"Švajčiarsky nôž" vírusovej armády: tajomstvo reverznej transkriptázy odhalené. Reverzná transkriptáza Reverzná transkriptáza

Nazýva sa tak, pretože väčšina transkripčných procesov v živých organizmoch prebieha iným smerom, konkrétne, RNA transkript sa syntetizuje z molekuly DNA.

História

Reverznú transkriptázu objavil Howard Temin na University of Wisconsin-Madison a nezávisle David Baltimore v roku 1970. Obaja vedci dostali spolu s Renato Dulbeccom Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu v roku 1975.

Presnosť prepisu

Reverzná transkripcia z RNA do DNA je sprevádzaná vysokou úrovňou translačných chýb, čo odlišuje reverznú transkriptázu od iných DNA polymeráz. Tieto chyby môžu viesť k mutáciám zodpovedným za liekovú rezistenciu vírusov.

Význam pre vírusy

Reverzná transkripcia je potrebná najmä pre životný cyklus retrovírusov, napríklad vírusov ľudskej imunodeficiencie a ľudských T-bunkových lymfómov typu 1 a 2. Potom, čo vírusová RNA vstúpi do bunky, reverzná transkriptáza obsiahnutá vo vírusových časticiach syntetizuje DNA, ktorá je k nej komplementárna, a potom dokončí druhé vlákno na tomto reťazci DNA, ako na šablóne.

Význam pre eukaryoty

Aplikácia

Antiretrovírusová terapia

Úloha v genetickom inžinierstve

V genetickom inžinierstve sa reverzná transkriptáza používa na produkciu cDNA, kópie eukaryotického génu, ktorý neobsahuje intróny. Na tento účel sa z tela izoluje zrelá mRNA (kódujúca zodpovedajúci génový produkt: proteín, RNA) a ako templát sa s ňou vykonáva reverzná transkripcia. Výsledná cDNA môže byť transformovaná do bakteriálnych buniek, aby sa získal transgénny produkt.

pozri tiež

Napíšte recenziu na článok "Reverzná transkriptáza"

Poznámky (upraviť)

Výňatok charakterizujúci reverznú transkriptázu

- O! O! O!
- No zbohom, Bolkonsky! Zbohom, princ; Príďte na večeru skôr, “zneli hlasy. - Postaráme sa o vás.
"Pokúste sa čo najviac pochváliť poriadok pri doručovaní zásob a trás, keď budete hovoriť s cisárom," povedal Bilibin a sprevádzal Bolkonského na front.
- A chcel by som chváliť, ale nemôžem, pokiaľ viem, - odpovedal s úsmevom Bolkonskij.
- Vo všeobecnosti hovorte čo najviac. Jeho vášňou je publikum; ale on sám nerád hovorí a nevie ako, ako uvidíte.

Cisár Franz pri východe len uprene hľadel do tváre princa Andrewa, ktorý stál na určenom mieste medzi rakúskymi dôstojníkmi, a dlhou hlavou mu kývol. Ale po opustení včerajšieho krídla pobočník zdvorilo vyjadril Bolkonskému cisárovu túžbu poskytnúť mu audienciu.
Cisár Franz ho prijal, stojac uprostred miestnosti. Pred začatím rozhovoru princa Andrewa zarazila skutočnosť, že cisár vyzeral byť zmätený, nevedel, čo má povedať, a začervenal sa.
- Povedz mi, kedy sa začala bitka? Rýchlo sa spýtal.
Odpovedal princ Andrew. Po tejto otázke nasledovali ďalšie, rovnako jednoduché otázky: „Je Kutuzov zdravý? ako dávno odišiel z Kremsu?" atď. Cisár hovoril s takým výrazom, akoby celý jeho zámer spočíval len v kladení určitého počtu otázok. Odpovede na tieto otázky ho, ako bolo až príliš zrejmé, nemohli zaujímať.
- Kedy začala bitka? Spýtal sa cisár.
`` Nemôžem povedať Vášmu Veličenstvu, kedy sa začala bitka z frontu, ale v Durensteine, kde som bol, armáda začala o šiestej hodine večer útok, '' povedal Bolkonsky, stal sa oživeným a v tomto prípad, za predpokladu, že bude schopný predložiť ready-made vo svojej hlave pravdivý popis všetkého, čo vedel a videl.
Ale cisár sa usmial a prerušil ho:
- Koľko míľ?
- Kam a kam, Vaše Veličenstvo?
- Z Durensteinu do Kremsu?
"Tri a pol míle, Vaše veličenstvo."
- Opustili Francúzi ľavý breh?
- Ako hlásili skauti, poslední prešli plte v noci.
- Je v Kremse dostatok krmiva?
- Krmivo nebolo dodané v takom množstve...
Cisár ho prerušil.
- Kedy bol zabitý generál Schmitt? ...
- Myslím, že o siedmej.
- O 7:00. Veľmi smutný! Veľmi smutný!
Cisár povedal, že ďakuje a uklonil sa. Princ Andrew vyšiel von a bol okamžite obklopený dvoranmi zo všetkých strán. Láskavé oči sa naňho pozerali zo všetkých strán a bolo počuť nežné slová. Včerajší pobočník mu vyčítal, že nezostal v paláci, a ponúkol mu svoj dom. Pristúpil minister vojny, zablahoželal mu k Rádu Márie Terézie 3. stupňa, ktorý mu udelil cisár. Komorník cisárovnej ho pozval na jej Veličenstvo. Chcela ho vidieť aj arcivojvodkyňa. Nevedel, komu má odpovedať, a na pár sekúnd zbieral myšlienky. Ruský vyslanec ho vzal za rameno, odviedol k oknu a začal sa s ním rozprávať.
Na rozdiel od Bilibinových slov boli správy, ktoré priniesol, prijaté s radosťou. Bola ustanovená ďakovná bohoslužba. Kutuzovovi udelila Mária Terézia Veľký kríž a vyznamenania dostala celá armáda. Bolkonskij dostával pozvania zo všetkých strán a celé dopoludnie musel robiť návštevy u hlavných hodnostárov Rakúska. Keď princ Andrey ukončil svoje návštevy o piatej hodine večer, v duchu napísal svojmu otcovi list o bitke ao svojej ceste do Brunnu, vrátil sa domov do Bilibinu. Na verande domu, v ktorom býval Bilibin, bol kreslo napoly plné vecí a Franz, Bilibinov sluha, s ťažkosťami ťahajúci kufor, vyšiel z dverí.

Revertáza je enzým, ktorý syntetizuje cDNA na templáte RNA.

V niektorých vírusoch nie je genóm DNA, ako zvyčajne, ale RNA. Takéto vírusy sa nazývali retrovírusy (retro - reverzné). V roku 1970 D. Baltimore a H.M.Temin objavili mechanizmus prenosu informácií z vírusovej RNA do DNA, t.j. na rozdiel od toho, čo sa odohráva v bunkách vyšších organizmov. Tento proces sa nazýval reverzná transkripcia a enzým, ktorý ho vykonáva, sa nazýval reverzná transkriptáza alebo revertáza.

Reverzná transkriptáza alebo reverzná transkriptáza [lat. transcriptio- prepisovanie) - enzým RNA-dependentná DNA polymeráza, pomocou ktorej sa uskutočňuje reverzná transkripcia - syntéza DNA na matrici RNA; je kódovaný genómami niektorých vírusov obsahujúcich RNA a mobilnými genetickými prvkami genómu vyšších organizmov, dôležitým „nástrojom“ genetického inžinierstva. Reverzná transkriptáza má aspoň tri enzymatické aktivity:

1) DNA polymeráza s použitím RNA aj DNA ako templátu;

2) aktivita RNázy H, ktorá hydrolyzuje RNA v hybride RNA-DNA, ale nie jednovláknovú alebo dvojvláknovú RNA a

3) Aktivita endonukleázy DNA.

Objavené nezávisle od seba D. Baltimorom a H. Teminom v roku 1970 vo vírusoch nesúcich nádory s obsahom RNA (Nobelova cena za rok 1975 spolu s R. Dulbeccom).

Reverzné transkriptázy sú teda schopné syntetizovať DNA na templáte RNA polymerizáciou štyroch deoxyribonukleozidtrifosfátov. A rovnako ako DNA polymerázy fungujú iba vtedy, keď sú aktivované.

Reverzné transkriptázy sa využívajú pri syntéze dvojvláknovej DNA, komplementárnej s RNA (najmä mRNA), na jej následné klonovanie do plazmidových vektorov pri získavaní cDNA knižníc (klonov). Reverzné transkriptázy, ako napríklad DNA polymerázy, sa môžu použiť na zavedenie rádioaktívnych alebo fluorescenčných značiek do DNA sond vo vhodne značených deoxyribonukleozidtrifosfátoch.

Schopnosť syntetizovať DNA na templáte RNA za určitých podmienok bola preukázaná pre termostabilnú DNA polymerázu Thermus thermophilus. To umožňuje jeho použitie na priamu detekciu špecifických RNA v biologických vzorkách pomocou PCR. Moderné modifikácie tohto prístupu umožňujú v jednej reakčnej zmesi (a skúmavke) syntetizovať v reakcii reverznej transkripcie malý počet kópií amplifikovaného fragmentu DNA na templáte RNA, ktoré sú okamžite použité rovnakým enzýmom ako templát v konvenčnej PCR (jedno skúmavka PCR).

Pri štúdiu retrovírusov, ktorých genóm je reprezentovaný jednovláknovými molekulami RNA, sa zistilo, že v procese vnútrobunkového vývoja prechádzajú štádiom integrácie svojho genómu vo forme dvojvláknovej DNA do chromozómov hostiteľskej bunky. V roku 1964 predložil H. Temin hypotézu o existencii vírusovo špecifického enzýmu schopného syntetizovať komplementárnu DNA na templáte RNA. V roku 1970 H. Temin a S. Mizutani, ako aj nezávisle od nich D. Baltimore, objavili takýto enzým pri príprave extracelulárnych viriónov vírusu Rousovho sarkómu. Táto RNA-dependentná DNA polymeráza sa nazýva reverzná transkriptáza (reverzná transkriptáza).

Najpodrobnejšia štúdia je revertáza vtáčích retrovírusov. Každý virión obsahuje asi 50 molekúl tohto enzýmu. Reverzná transkriptáza pozostáva z dvoch podjednotiek, ά (65 kDa) a β (95 kDa), ktoré sú prítomné v ekvimolárnych množstvách. ά-podjednotka je N-koncová časť (dve tretiny) β-podjednotky.

Reverzná transkriptáza má aspoň tri enzymatické aktivity:

· DNA polymeráza, využívajúca RNA aj DNA ako templát;

· Aktivita RNázy H, ktorá hydrolyzuje RNA v hybride RNA-DNA, ale nie jednovláknovú alebo dvojvláknovú RNA;

· DNA endonukleáza.

Prvé dve aktivity sú potrebné na syntézu vírusovej DNA a endonukleáza sa zdá byť dôležitá pre integráciu vírusovej DNA do genómu hostiteľskej bunky. β-podjednotka revertázy má všetky tri aktivity, zatiaľ čo podjednotka má iba polymerázu a RNázu H.

Purifikovaná reverzná transkriptáza syntetizuje DNA na templátoch RNA aj DNA. Na začatie syntézy potrebuje revertáza, podobne ako iné polymerázy, krátky dvojvláknový primer. Primér môže byť jednovláknový segment RNA aj DNA, ktorý sa v priebehu reakcie kovalentne viaže na novo syntetizovaný reťazec DNA.

Reverzná transkriptáza sa používa prevažne na transkripciu mediátorovej RNA do komplementárnej DNA (cDNA). Reverzná transkripčná reakcia sa uskutočňuje v prítomnosti silných inhibítorov aktivity RNázy. V tomto prípade je možné získať úplné kópie DNA cieľových molekúl RNA. Oligo (dT) sa používa ako primér pre reverznú transkripciu mRNA obsahujúcej poly (A) (obr.), a pre molekuly RNA bez 3 "poly (A) koncov, chemicky syntetizované oligonukleotidy komplementárne s 3" koncom študovaného RNA. Navyše, posledný typ molekúl RNA možno previesť na poly(A)-obsahujúce pomocou E. coli poly(A)-polymerázy.

Po syntéze komplementárneho vlákna DNA na mRNA a deštrukcii RNA (zvyčajne sa používa alkálie) sa syntetizuje druhé vlákno DNA. Toto využíva schopnosť reverznej transkriptázy vytvárať samokomplementárne vlásenky na 3'-koncoch jednovláknovej cDNA, ktoré môžu pôsobiť ako primér. Templátom je prvé vlákno cDNA. Táto reakcia môže byť katalyzovaná tak reverznou transkriptázou, ako aj DNA polymeráza I. Kombinácia týchto dvoch enzýmov umožňuje zvýšiť výťažok plnohodnotných dvojvláknových molekúl cDNA.

Na konci syntézy zostáva prvé a druhé vlákno cDNA kovalentne spojené slučkou vlásenky, ktorá slúžila ako primér pri syntéze druhého vlákna. Táto slučka je štiepená endonukleázou S1, ktorá špecificky ničí jednovláknové oblasti nukleových kyselín. Výsledné konce nie sú vždy tupé a na zvýšenie účinnosti následného klonovania sú opravené na tupé pomocou Klenowovho fragmentu E. coli DNA polymerázy I. Výsledná dvojvláknová cDNA sa potom môže vložiť do klonovacích vektorov, expandovať ako hybridné molekuly DNA a použiť na ďalší výskum.

Reverzná transkriptáza (revertáza alebo RNA-dependentná DNA polymeráza) je enzým, ktorý katalyzuje syntézu DNA na templáte RNA v procese nazývanom „ spätný prepis"... Názov procesu odráža opak procesu prepisy uskutočnené v opačnom smere: z templátovej molekuly DNA sa syntetizuje transkript RNA.

Tieto enzýmy boli izolované z RNA vírusov ( retrovírusy). Reverznú transkriptázu používajú tumorigénne vírusy na transkripciu mRNA do komplementárneho reťazca DNA. Pri štúdiu retrovírusov, ktorých genóm predstavujú jednovláknové molekuly RNA, sa zistilo, že v procese vnútrobunkového vývoja retrovírus prechádza štádiom integrácie svojho genómu vo forme dvojvláknovej DNA do chromozómov. hostiteľskej bunky. V roku 1964 Temin predložil hypotézu o existencii vírusovo špecifického enzýmu schopného syntetizovať komplementárnu DNA na templáte RNA. Úsilie zamerané na izoláciu takéhoto enzýmu bolo korunované úspechom a v roku 1970 Temin a Mizutani a nezávisle od nich Baltimore objavili požadovaný enzým v prípravku extracelulárnych viriónov vírusu Rousovho sarkómu. Táto RNA-dependentná DNA polymeráza sa nazýva reverzná transkriptáza alebo reverzná transkriptáza.

Najpodrobnejšia štúdia je revertáza vtáčích retrovírusov. Každý virión obsahuje asi 50 molekúl tohto enzýmu. Reverzná transkriptáza pozostáva z dvoch podjednotiek, a (65 kDa) a b (95 kDa), prítomných v ekvimolárnych množstvách. Reverzná transkriptáza má aspoň tri enzymatické aktivity:

1) DNA polymeráza s použitím RNA aj DNA ako templátu;

2) aktivita RNázy H, ktorá hydrolyzuje RNA v hybride RNA-DNA;

3) Aktivita endonukleázy DNA.

Prvé dve aktivity sú potrebné na syntézu vírusovej DNA a endonukleáza sa zdá byť dôležitá pre integráciu vírusovej DNA do genómu hostiteľskej bunky. Purifikovaná reverzná transkriptáza syntetizuje DNA na templátoch RNA aj DNA (obr. 11).

Ryža. 11. Schéma syntézy kópií dvojvláknovej DNA molekúl RNA

Na začatie syntézy potrebuje revertáza, podobne ako iné polymerázy, krátku dvojvláknovú oblasť (primér). Primér môže byť jednovláknový segment RNA aj DNA, ktorý sa v priebehu reakcie kovalentne viaže na novo syntetizovaný reťazec DNA. V genetickom inžinierstve sa používajú oligo- (dT) priméry komplementárne k 3'-polyA koncom mRNA a súbor náhodných primérov v zložení a sekvencii hexanukleotidov (náhodné priméry). doplnkové k 3"-koncu

Reverzná transkriptáza sa používa prevažne na transkripciu mediátorovej RNA do komplementárnej DNA (cDNA). Reverzná transkripčná reakcia sa uskutočňuje za špeciálne vybraných podmienok s použitím silných inhibítorov aktivity RNázy. V tomto prípade je možné získať úplné kópie DNA cieľových molekúl RNA. Po syntéze komplementárneho vlákna DNA na mRNA a deštrukcii RNA (zvyčajne sa používa alkálie) sa syntetizuje druhé vlákno DNA. V tomto prípade sa využíva schopnosť reverznej transkriptázy vytvárať samokomplementárne vlásenky na 3'-koncoch jednovláknovej cDNA, ktoré môžu pôsobiť ako primér.

Templát je prvé vlákno cDNA. Táto reakcia môže byť katalyzovaná tak revertázou, ako aj DNA polymerázou I z E. coli. Ukázalo sa, že kombinácia týchto dvoch enzýmov zvyšuje výťažok plnohodnotných molekúl dvojvláknovej cDNA. Na konci syntézy zostávajú prvé a druhé vlákna cDNA kovalentne spojené slučkou vlásenky, ktorá slúžila ako primér pri syntéze druhého vlákna. Táto slučka je štiepená endonukleázou S1, ktorá špecificky ničí jednovláknové oblasti nukleových kyselín. Výsledné konce nie sú vždy tupé a na zvýšenie účinnosti následného klonovania sú opravené na tupé pomocou Klenowovho fragmentu E. coli DNA polymerázy I. Výsledná dvojvláknová cDNA sa potom môže vložiť do klonovacích vektorov, expandovať v hybridných molekulách DNA a použiť na ďalší výskum.