ウイルス軍の「スイスナイフ」：逆転写酵素の秘密が解明されました。逆転写酵素リバーターゼ逆転写酵素

生物の転写過程のほとんどが異なる方向に起こる、すなわち、RNA転写物がDNA分子から合成されるので、それはそう呼ばれます。

話

逆転写酵素は、ウィスコンシン大学マディソン校のハワード・テミンによって発見され、1970年にデビッド・ボルティモアによって独立して発見されました。両方の研究者は、1975年にレナート・ドゥルベッコとともにノーベル生理学・医学賞を受賞しました。

転写の正確さ

RNAからDNAへの逆転写には、逆転写酵素を他のDNAポリメラーゼと区別する高レベルの翻訳エラーが伴います。これらのエラーは、ウイルスの薬剤耐性の原因となる突然変異につながる可能性があります。

ウイルスの重要性

逆転写は、特にレトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトT細胞リンパ腫1型および2型のライフサイクルに必要です。ウイルスRNAが細胞に入った後、ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素はそれに相補的なDNAを合成し、テンプレートのようにこのDNA鎖の2番目の鎖を完成させます。

真核生物にとっての重要性

応用

抗レトロウイルス療法

遺伝子工学における役割

遺伝子工学では、逆転写酵素を使用して、イントロンを含まない真核生物の遺伝子のコピーであるcDNAを生成します。このために、成熟したmRNA（対応する遺伝子産物：タンパク質、RNAをコードする）が体から分離され、それをテンプレートとして逆転写が実行されます。得られたcDNAを細菌細胞に形質転換して、トランスジェニック産物を得ることができます。

も参照してください

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メモ（編集）

逆転写酵素を特徴付ける抜粋

-O！おお！おお！
-さようなら、ボルコンスキー！さようなら、王子様。早く夕食に来なさい」と声が上がった。 -お世話になります。
「皇帝と話をするときは、可能な限り食料とルートの配達の順序を称賛するようにしてください」と、ボルコンスキーを前に護衛してビリビンは言いました。
「そして私は賞賛したいのですが、私が知っている限り、私はできません」とボルコンスキーは笑って答えました。
-まあ、一般的には、できるだけ話してください。彼の情熱は聴衆です。しかし、あなたが見るように、彼自身は話すのが好きではなく、方法も知りません。

出口で、フランツ皇帝はオーストリアの将校の間の指定された場所に立っていたアンドリュー王子の顔をじっと見つめ、長い頭で彼にうなずきました。しかし、昨日の翼を離れた後、副官は彼に聴衆を与えたいという皇帝の願望をボルコンスキーに丁寧に伝えました。
フランツ皇帝は部屋の真ん中に立って彼を迎えました。会話を始める前に、アンドリュー王子は皇帝が何を言うべきかわからず混乱しているように見え、顔を赤らめたという事実に感銘を受けました。
-教えてください、戦いはいつ始まりましたか？彼は急いで尋ねた。
アンドルー王子は答えました。この質問の後には、他の同様に単純な質問が続きました。彼はどのくらい前にクレムスを去りましたか？」天皇は、あたかも彼の全体の目的が特定の数の質問をすることだけであるかのように、そのような表現で話しました。これらの質問への答えは、それがあまりにも明白だったので、彼に興味を持たせることができませんでした。
-戦闘はいつ始まりましたか？皇帝は尋ねました。
「戦闘が正面から始まったのはいつかは陛下にはわかりませんが、私がいたデュレンシュタインでは、軍は夕方6時に攻撃を開始しました」とボルコンスキーは言いました。このケースでは、彼が自分の頭の中で既製のものを、彼が知っていて見たすべてのものの本当の説明を提示できると仮定しています。
しかし、皇帝は微笑んで彼を邪魔しました：
-何マイル？
-どこへ、どこへ、陛下？
-デュルンシュタインからクレムスへ？
「3.5マイル、あなたの威厳。
-フランス人は左岸を去りましたか？
-スカウトが報告したように、最後のスカウトは夜にいかだを渡りました。
-クレムスには十分な飼料がありますか？
-飼料はその量で配達されませんでした...
皇帝は彼を邪魔した。
-シュミット将軍は何時に殺されましたか？..。
-7時にだと思います。
-7：00 とても悲しい！とても悲しい！
皇帝は感謝し、お辞儀をしたと言いました。アンドルー王子は外に出て、すぐに四方八方からの廷臣に囲まれました。愛情のこもった目が彼を四方八方から見つめ、優しい言葉が聞こえた。昨日の別棟の副官は、宮殿に滞在しなかったとして彼を非難し、彼に彼の家を提供しました。戦争大臣が現れ、皇帝が彼に授けた3度のマリアテレジア軍団を祝福しました。皇后両陛下の室長は彼を陛下に招待しました。大公も彼に会いたかった。彼は誰に答えるべきかわからず、数秒間彼の考えを集めました。ロシアの使節は彼を肩に乗せ、窓に連れて行き、彼と話し始めました。
ビリビンの言葉に反して、彼がもたらしたニュースは喜んで受け取られました。感謝祭のサービスが任命されました。クトゥーゾフはマリア・テレジアからグランドクロスを授与され、軍全体が賞を受賞しました。ボルコンスキーはあらゆる方面から招待状を受け取り、午前中はオーストリアの主要な高官を訪問しなければなりませんでした。アンドレイ王子は夕方5時に訪問を終え、戦いとブランへの旅行について父親に宛てた手紙を頭の中で作成し、ビリビンに帰国しました。ビリビンが住んでいた家のポーチには、半分物が詰まった寝椅子があり、ビリビンの僕であるフランツは、スーツケースを引きずることが困難で、ドアから出て行った。

レベルターゼは、RNAテンプレート上でcDNAを合成する酵素です。

一部のウイルスでは、ゲノムは通常のようにDNAではなく、RNAです。このようなウイルスはレトロウイルスと呼ばれていました（レトロ-リバース）。 1970年、D。ボルティモアとH.M.テミンは、ウイルスRNAからDNAに情報を転送するメカニズムを発見しました。高等生物の細胞で起こることとは反対に。このプロセスは逆転写と呼ばれ、それを実行する酵素は逆転写酵素またはリバーターゼ（リバーターゼ）と呼ばれていました。

逆転写酵素、または逆転写酵素、[lat。音訳-書き直し）-逆転写が行われる酵素RNA依存性DNAポリメラーゼ-RNAマトリックス上でのDNA合成; いくつかのRNA含有ウイルスのゲノムと高等生物のゲノムの可動遺伝因子によってコード化されており、遺伝子工学の重要な「ツール」です。逆転写酵素には少なくとも3つの酵素活性があります。

1）RNAとDNAの両方をテンプレートとして使用するDNAポリメラーゼ。

2）一本鎖または二本鎖RNAではなくRNA-DNAハイブリッドの一部としてRNAを加水分解するRNaseHの活性。

3）DNAエンドヌクレアーゼ活性。

1970年にD.ボルティモアとH.テミンによってRNAを含む担癌ウイルスで互いに独立して発見されました（1975年のノーベル賞とR.ダルベッコ）。

したがって、逆転写酵素は、4つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を重合することにより、RNAテンプレート上でDNAを合成することができます。また、DNAポリメラーゼと同様に、プライミングされた場合にのみ機能します。

逆転写酵素は、RNA（特にmRNA）に相補的な二本鎖DNAの合成に使用され、cDNAライブラリー（クローン）を取得する際のプラスミドベクターでのその後のクローニングに使用されます。 DNAポリメラーゼのような逆転写酵素を使用して、適切に標識されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸のDNAプローブに放射性または蛍光標識を導入することができます。

特定の条件下でRNAテンプレート上でDNAを合成する能力は、耐熱性DNAポリメラーゼThermusthermophilusで実証されています。これにより、PCRによる生体サンプル中の特定のRNAの直接検出に使用できます。このアプローチの最新の変更により、1つの反応混合物（およびテストチューブ）で、逆転写反応で、RNAテンプレート上の増幅されたDNAフラグメントの少数のコピーを合成できます。これは、テンプレートと同じ酵素によってすぐに使用されます。従来のPCR（ワンチューブPCR）で。

ゲノムが一本鎖RNA分子で表されるレトロウイルスを研究すると、細胞内発達の過程で、二本鎖DNAの形でゲノムが染色体に組み込まれる段階を経ることがわかりました。宿主細胞。 1964年、H。テミンは、RNAテンプレート上で相補的DNAを合成できるウイルス特異的酵素の存在についての仮説を提唱しました。 1970年、X。TeminとS. Mizutaniは、それらとは独立して、D。Baltimoreが、ラウス肉腫ウイルスの細胞外ビリオンの調製においてそのような酵素を発見しました。このRNA依存性DNAポリメラーゼは、逆転写酵素（逆転写酵素）と呼ばれます。

最も詳細な研究は、トリレトロウイルスのリバーターゼです。各ビリオンには、この酵素が約50分子含まれています。逆転写酵素は、2つのサブユニット（ά（65 kDa）とβ（95 kDa））で構成されており、これらは等モル量で存在します。 άサブユニットは、βサブユニットのN末端部分（3分の2）です。

逆転写酵素には少なくとも3つの酵素活性があります。

・RNAとDNAの両方をテンプレートとして使用するDNAポリメラーゼ。

・RNA-DNAハイブリッドのRNAを加水分解するRNase Hの活性。ただし、一本鎖または二本鎖RNAは加水分解しません。

・DNAエンドヌクレアーゼ。

最初の2つの活動はウイルスDNAの合成に必要であり、エンドヌクレアーゼはウイルスDNAを宿主細胞のゲノムに組み込むために重要であるように思われます。レベルターゼのβサブユニットには3つの活性がすべてありますが、άサブユニットにはポリメラーゼとRNaseHしかありません。

精製された逆転写酵素は、RNAテンプレートとDNAテンプレートの両方でDNAを合成します。合成を開始するには、他のポリメラーゼと同様に、リバーターゼには短い二本鎖領域（プライマー）が必要です。プライマーは、RNAとDNAの両方の一本鎖セグメントである可能性があり、反応中に、新しく合成されたDNA鎖に共有結合することがわかります。

逆転写酵素は主にメッセンジャーRNAを相補的DNA（cDNA）に転写するために使用されます。逆転写反応は、RNase活性の強力な阻害剤の存在下で行われます。この場合、ターゲットRNA分子の完全長のDNAコピーを取得することが可能です。オリゴ（dT）は、ポリ（A）を含むmRNAの逆転写のプライマーとして使用され（図）、3 "ポリ（A）末端のないRNA分子の場合、研究対象の3"末端に相補的な化学合成オリゴヌクレオチドRNA。さらに、後者のタイプのRNA分子は、大腸菌ポリ（A）-ポリメラーゼによってポリ（A）含有に変換することができます。

mRNA上で相補的DNA鎖が合成され、RNAが破壊された後（通常はアルカリ処理が使用されます）、2番目のDNA鎖が合成されます。これは、逆転写酵素の能力を利用して、プライマーとして機能できる一本鎖cDNAの3 '末端に自己相補的なヘアピンを形成します。テンプレートはcDNAの最初の鎖です。この反応は、逆転写酵素とDNAポリメラーゼI。これら2つの酵素の組み合わせにより、本格的な二本鎖cDNA分子の収量を増やすことができます。

合成の終わりに、cDNAの第1鎖と第2鎖は、第2鎖の合成のプライマーとして機能するヘアピンのループによって共有結合されたままになります。このループは、核酸の一本鎖領域を特異的に破壊するエンドヌクレアーゼS1で切断されます。得られた末端は常に平滑であるとは限らず、その後のクローニングの効率を高めるために、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを使用して平滑に修復されます。得られた二本鎖cDNAは、クローニングベクターに挿入され、ハイブリッドDNA分子内で拡張され、さらなる研究に使用されます。

逆転写酵素 (レベルターゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ）は、「」と呼ばれるプロセスでRNAテンプレート上でのDNA合成を触媒する酵素です。 逆転写」..。プロセスの名前は、プロセスの反対を反映しています転写別の方向で実行されます：RNA転写物はDNAテンプレート分子から合成されます。

これらの酵素はRNAウイルスから分離されました（ レトロウイルス）。逆転写酵素は、腫瘍形成性ウイルスがmRNAを相補的DNA鎖に転写するために使用されます。ゲノムが一本鎖RNA分子で表されるレトロウイルスを研究したところ、細胞内発生の過程で、レトロウイルスは二本鎖DNAの形でゲノムが染色体に組み込まれる段階を経ていることがわかりました。宿主細胞の。 1964年、テミンは、RNAテンプレート上で相補的DNAを合成できるウイルス特異的酵素の存在についての仮説を提唱しました。そのような酵素を単離することを目的とした努力は成功を収め、1970年にテミンとミズタニ、そしてそれらとは独立してボルチモアは、ラウス肉腫ウイルスの細胞外ビリオンの調製において所望の酵素を発見した。このRNA依存性DNAポリメラーゼは、逆転写酵素または逆転写酵素と呼ばれます。

最も詳細な研究は、トリレトロウイルスのリバーターゼです。各ビリオンには、この酵素が約50分子含まれています。逆転写酵素は、等モル量で存在する2つのサブユニットa（65 kDa）とb（95 kDa）で構成されています。逆転写酵素には少なくとも3つの酵素活性があります。

1）RNAとDNAの両方をテンプレートとして使用するDNAポリメラーゼ。

2）RNA-DNAハイブリッドのRNAを加水分解するRNaseHの活性。

3）DNAエンドヌクレアーゼ活性。

最初の2つの活動はウイルスDNAの合成に必要であり、エンドヌクレアーゼはウイルスDNAを宿主細胞のゲノムに組み込むために重要であるように思われます。精製された逆転写酵素は、RNAテンプレートとDNAテンプレートの両方でDNAを合成します（図11）。

米。 11.RNA分子の二本鎖DNAコピーの合成スキーム

合成を開始するには、他のポリメラーゼと同様に、リバーターゼには短い二本鎖領域（プライマー）が必要です。プライマーは、RNAとDNAの両方の一本鎖セグメントである可能性があり、反応中に、新しく合成されたDNA鎖に共有結合していることがわかります。遺伝子工学では、mRNAの3'-polyA末端に相補的なオリゴ（dT）プライマーと、組成および配列が「ランダム」なヘキサヌクレオチドのセット（ランダムプライマー）の両方が使用されます。ポリ（A）末端、化学的に合成された相補的なオリゴヌクレオチド3 "端まで使用されます

逆転写酵素は主にメッセンジャーRNAを相補的DNA（cDNA）に転写するために使用されます。逆転写反応は、RNase活性の強力な阻害剤を使用して特別に選択された条件下で実行されます。この場合、ターゲットRNA分子の完全長のDNAコピーを取得することが可能です。 mRNA上で相補的DNA鎖が合成され、RNAが破壊された後（通常はアルカリ処理が使用されます）、2番目のDNA鎖が合成されます。この場合、プライマーとして機能することができる一本鎖cDNAの3 '末端で自己相補的ヘアピンを形成する逆転写酵素の能力が使用されます。

テンプレートはcDNAの最初の鎖です。この反応は、レベルターゼと大腸菌DNAポリメラーゼIの両方によって触媒されます。これら2つの酵素の組み合わせにより、本格的な二本鎖cDNA分子の収量が増加することが示されています。合成の終わりに、cDNAの第1鎖と第2鎖は、第2鎖の合成のプライマーとして機能するヘアピンのループによって共有結合されたままになります。このループは、核酸の一本鎖領域を特異的に破壊するエンドヌクレアーゼS1で切断されます。得られた末端は常に平滑であるとは限らず、その後のクローニングの効率を高めるために、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを使用して平滑に修復されます。得られた二本鎖cDNAは、クローニングベクターに挿入され、ハイブリッドDNA分子内で拡張され、さらなる研究に使用されます。