Cromatina: definizione, struttura e ruolo nella divisione cellulare. Tre frazioni del DNA eucariotico, loro localizzazione nei cromosomi e funzioni Componenti strutturali e funzionali della cromatina

La cromatina, il componente principale del nucleo cellulare, è abbastanza facile da ottenere da nuclei interfasici isolati e da cromosomi mitotici isolati. Per fare ciò, sfruttano la sua capacità di passare allo stato disciolto durante l'estrazione con soluzioni acquose a bassa forza ionica o semplicemente acqua deionizzata. In questo caso, le sezioni della cromatina si gonfiano e si trasformano in un gel. Per convertire tali farmaci in soluzioni reali sono necessarie forti influenze meccaniche: agitazione, agitazione, ulteriore omogeneizzazione. Ciò, ovviamente, porta alla parziale distruzione della struttura originaria della cromatina, frantumandola in piccoli frammenti, ma praticamente non ne modifica la composizione chimica.

Le frazioni di cromatina ottenute da oggetti diversi hanno un insieme di componenti abbastanza uniforme. Si è scoperto che la composizione chimica totale della cromatina dei nuclei interfase e dei cromosomi mitotici differisce poco l'una dall'altra. I componenti principali della cromatina sono il DNA e le proteine, la maggior parte delle quali sono istoni e proteine non istoniche (vedi Tabella 3).

Tabella 3. Composizione chimica della cromatina. I contenuti di proteine e RNA sono forniti in relazione al DNA

In media, circa il 40% della cromatina è costituito da DNA e circa il 60% da proteine, comprese specifiche proteine nucleari. istoni, costituiscono dal 40 all'80% di tutte le proteine che compongono la cromatina isolata. Inoltre, la frazione cromatinica comprende componenti di membrana, RNA, carboidrati, lipidi e glicoproteine. La questione di quanto questi componenti minori siano inclusi nella struttura della cromatina non è stata ancora risolta. Così, ad esempio, l'RNA può essere un RNA trascritto che non ha ancora perso la connessione con lo stampo di DNA. Altri componenti minori possono rappresentare sostanze provenienti da frammenti coprecipitati della membrana nucleare.

Strutturalmente, la cromatina è un complesso filamentoso di molecole di desossiribonucleoproteina (DNP), costituito da DNA associato agli istoni (vedi Fig. 57). Pertanto, ha messo radici un altro nome per la cromatina: nucleoistone. A causa dell'associazione degli istoni con il DNA si formano complessi acido nucleico-istone molto labili e variabili, dove il rapporto DNA:istone è circa uno, cioè sono presenti in quantità uguali in peso. Queste fibrille filamentose del DNP sono filamenti cromosomici o cromatinici elementari, il cui spessore, a seconda del grado di impaccamento del DNA, può variare da 10 a 30 nm. Queste fibrille DNP possono, a loro volta, essere ulteriormente compattate per formare livelli più elevati di strutturazione del DNP, fino al cromosoma mitotico. Il ruolo di alcune proteine non istoniche è proprio nella formazione di elevati livelli di compattazione della cromatina.

Cromatina del DNA

In una preparazione della cromatina, il DNA rappresenta solitamente il 30-40%. Questo DNA è una molecola elicoidale a doppio filamento, simile al DNA puro isolato in soluzioni acquose. Ciò è dimostrato da molti dati sperimentali. Pertanto, quando le soluzioni di cromatina vengono riscaldate, si osserva un aumento della densità ottica della soluzione, il cosiddetto effetto ipercromico associato alla rottura dei legami idrogeno internucleotidici tra le catene del DNA, simile a quanto accade quando il DNA puro viene riscaldato (fuso). .

La questione della dimensione e della lunghezza delle molecole di DNA nella cromatina è importante per comprendere la struttura del cromosoma nel suo insieme. Utilizzando metodi standard di isolamento del DNA, la cromatina ha un peso molecolare di 7-9 x 10 6, che è significativamente inferiore al peso molecolare del DNA di Escherichia coli (2,8 x 10 9). Un peso molecolare così basso del DNA proveniente da preparati di cromatina può essere spiegato da un danno meccanico al DNA durante il processo di isolamento della cromatina. Se il DNA viene isolato in condizioni che escludono l'agitazione, l'omogeneizzazione e altri fattori, è possibile ottenere molecole di DNA molto lunghe dalle cellule. La lunghezza delle molecole di DNA dei nuclei e dei cromosomi delle cellule eucariotiche può essere studiata utilizzando il metodo dell'autoradiografia ottica, proprio come è stato studiato sulle cellule procariotiche.

Si è scoperto che all'interno dei cromosomi la lunghezza delle singole molecole di DNA lineari (a differenza dei cromosomi procariotici) può raggiungere centinaia di micrometri e persino diversi centimetri. Pertanto, da diversi oggetti sono state ottenute molecole di DNA di dimensioni comprese tra 0,5 mm e 2 cm, e questi risultati hanno dimostrato che esiste uno stretto accordo tra la lunghezza calcolata del DNA per cromosoma e l'osservazione autoradiografica.

Dopo una lieve lisi delle cellule eucariotiche, i pesi molecolari del DNA possono essere determinati direttamente mediante metodi fisico-chimici. È stato dimostrato che il peso molecolare massimo di una molecola di DNA della Drosophila è 41 x 10 9, che corrisponde ad una lunghezza di circa 2 cm. In alcuni lieviti esiste una molecola di DNA per cromosoma con un peso molecolare di 1 x 10 8 -10 9, che misura circa 0,5 mm.

Un DNA così lungo è una singola molecola, e non diverse molecole più corte, unite insieme in un unico file utilizzando legami proteici, come credevano alcuni ricercatori. Questa conclusione è stata raggiunta dopo che si è scoperto che la lunghezza delle molecole di DNA non cambia dopo il trattamento con farmaci con enzimi proteolitici.

La quantità totale di DNA inclusa nelle strutture nucleari delle cellule, nel genoma degli organismi, varia da specie a specie, sebbene nei microrganismi la quantità di DNA per cellula sia significativamente inferiore rispetto agli invertebrati, alle piante superiori e agli animali. Pertanto, un topo ha quasi 600 volte più DNA per nucleo di E. coli. Confrontando la quantità di DNA per cellula negli organismi eucarioti, è difficile discernere alcuna correlazione tra il grado di complessità dell'organismo e la quantità di DNA per nucleo. Organismi diversi come il lino, il riccio di mare, il pesce persico (1,4-1,9 pg) o il salmerino e il toro (6,4 e 7 pg) hanno approssimativamente la stessa quantità di DNA.

Ci sono fluttuazioni significative nella quantità di DNA in grandi gruppi tassonomici. Tra le piante superiori, la quantità di DNA nelle diverse specie può differire centinaia di volte, proprio come tra i pesci, la quantità di DNA negli anfibi differisce decine di volte.

Alcuni anfibi hanno nei loro nuclei 10-30 volte più DNA che nei nuclei umani, sebbene la costituzione genetica degli esseri umani sia incomparabilmente più complessa di quella delle rane. Pertanto, si può presumere che la quantità "in eccesso" di DNA negli organismi organizzati a livello inferiore non sia associata all'adempimento di un ruolo genetico, oppure che il numero di geni venga ripetuto una o l'altra quantità di volte.

Tabella 4. Contenuto di DNA nelle cellule di alcuni oggetti (pg, 10 -12 g)

Si è rivelato possibile risolvere questi problemi studiando la cinetica della reazione di rinaturazione o ibridazione del DNA. Se le molecole di DNA frammentate in soluzioni vengono sottoposte a denaturazione termica e quindi incubate a una temperatura leggermente inferiore a quella alla quale avviene la denaturazione, la struttura originale a doppio filamento dei frammenti di DNA viene ripristinata grazie alla riunificazione delle catene complementari - rinaturazione. Per i virus a DNA e le cellule procariotiche, è stato dimostrato che la velocità di tale rinaturazione dipende direttamente dalla dimensione del genoma; quanto più grande è il genoma, tanto maggiore è la quantità di DNA per particella o cellula, tanto più tempo è necessario per l'avvicinamento casuale di catene complementari e la riassociazione specifica di un numero maggiore di frammenti di DNA diversi nella sequenza nucleotidica (Fig. 53). La natura della curva di riassociazione del DNA delle cellule procariotiche indica l'assenza di sequenze di basi ripetute nel genoma procariotico; tutte le sezioni del loro DNA portano sequenze uniche, il cui numero e diversità riflette il grado di complessità della composizione genetica degli oggetti e, di conseguenza, la loro organizzazione biologica generale.

Un quadro completamente diverso della riassociazione del DNA si osserva negli organismi eucarioti. Si è scoperto che il loro DNA contiene frazioni che si rinaturano a un ritmo molto più elevato di quanto ci si aspetterebbe in base alle dimensioni del loro genoma, così come una frazione di DNA che si rinatura lentamente, come le sequenze di DNA uniche dei procarioti. Tuttavia, gli eucarioti richiedono molto più tempo per rinaturare questa frazione, che è associata alle grandi dimensioni complessive del loro genoma e al gran numero di diversi geni unici.

In quella parte del DNA eucariotico che è caratterizzata da un alto tasso di rinaturazione, si distinguono due sottofrazioni: 1) una frazione con sequenze altamente o frequentemente ripetute, dove sezioni di DNA simili possono essere ripetute 10 6 volte; 2) una frazione di sequenze moderatamente ripetitive che ricorrono 10 2 -10 3 volte nel genoma. Pertanto, nei topi, la frazione di DNA con sequenze ripetute frequentemente comprende il 10% della quantità totale di DNA per genoma e il 15% è rappresentato dalla frazione con sequenze moderatamente ripetute. Il restante 75% di tutto il DNA del topo è rappresentato da regioni uniche corrispondenti a un gran numero di geni diversi non ripetitivi.

Le frazioni con sequenze altamente ripetute possono avere una densità di galleggiamento diversa rispetto alla maggior parte del DNA e possono quindi essere isolate in forma pura come le cosiddette frazioni DNA satellitare. Nel topo questa frazione ha una densità di 1,691 g/ml e la parte principale del DNA è di 1,700 g/ml. Queste differenze di densità sono determinate dalle differenze nella composizione nucleotidica. Ad esempio, in un topo ci sono il 35% di coppie G e C in questa frazione e il 42% nel picco principale del DNA.

Come si è scoperto, il DNA satellite, o la frazione di DNA con sequenze ripetute frequentemente, non è coinvolta nella sintesi dei principali tipi di RNA nella cellula e non è associata al processo di sintesi proteica. Questa conclusione è stata fatta sulla base del fatto che nessuno dei tipi di RNA cellulare (tRNA, mRNA, rRNA) si ibrida con il DNA satellite. Di conseguenza, questi DNA non contengono sequenze responsabili della sintesi dell’RNA cellulare, cioè i DNA satelliti non sono modelli per la sintesi dell'RNA e non sono coinvolti nella trascrizione.

Esiste l'ipotesi che sequenze altamente ripetitive che non sono direttamente coinvolte nella sintesi proteica possano trasportare informazioni che svolgono un importante ruolo strutturale nel mantenimento e nel funzionamento dei cromosomi. Questi possono includere numerose sezioni di DNA associate alle proteine centrali del nucleo interfase (vedi sotto), siti all'origine della replicazione o della trascrizione, nonché sezioni di DNA che regolano questi processi.

Utilizzando il metodo di ibridazione degli acidi nucleici direttamente sui cromosomi ( sul posto) è stata studiata la localizzazione di questa frazione. Per fare questo, l'RNA marcato con 3H-uridina è stato sintetizzato sul DNA satellite isolato utilizzando enzimi batterici. Quindi la preparazione citologica con cromosomi è stata sottoposta a un trattamento tale da provocare la denaturazione del DNA (temperatura elevata, ambiente alcalino, ecc.). Successivamente, l'RNA marcato con 3H è stato posizionato sulla preparazione ed è stata ottenuta l'ibridazione tra DNA e RNA. L'autoradiografia ha rivelato che la maggior parte della marcatura è localizzata nella zona delle costrizioni primarie dei cromosomi, nella zona delle loro regioni centromeriche. La macchia è stata rilevata anche in altre regioni dei cromosomi, ma molto debolmente (fig. 54).

Negli ultimi 10 anni sono stati fatti passi da gigante nello studio DNA centromerico, soprattutto nelle cellule di lievito. Quindi fallo S. cerevisiae Il DNA centromerico è costituito da regioni ripetute di 110 bp. È costituito da due regioni conservate (I e III) e da un elemento centrale (II), arricchito in coppie di basi AT. I cromosomi della Drosophila hanno una struttura del DNA centromerica simile. Il DNA centromerico umano (DNA satellite alfoide) è costituito da un tandem di monomeri di 170 bp organizzati in gruppi di dimeri o pentameri, che a loro volta formano grandi sequenze di 1-6 x 10 3 bp. Questa unità più grande viene ripetuta 100-1000 volte. Speciali proteine centromeriche vengono complessate con questo specifico DNA centromerico e sono coinvolte nella formazione cinetocore, una struttura che garantisce la connessione dei cromosomi con i microtubuli del fuso e il movimento dei cromosomi in anafase (vedi sotto).

È stato trovato anche DNA con sequenze altamente ripetitive regioni telomeriche cromosomi di molti organismi eucariotici (dal lievito all'uomo). Qui si trovano più spesso le ripetizioni, che includono 3-4 nucleotidi di guanina. Negli esseri umani, i telomeri contengono 500-3000 ripetizioni TTAGGG. Queste sezioni del DNA svolgono un ruolo speciale: limitare le estremità del cromosoma e prevenirne l'accorciamento durante il processo di replicazione ripetuta.

È stato recentemente scoperto che sequenze di DNA altamente ripetitive dei cromosomi interfasici si legano specificamente alle proteine laminari sottostanti l'involucro nucleare e partecipano all'ancoraggio di cromosomi interfasici decondensati estesi, determinando così l'ordine nella localizzazione dei cromosomi nel volume del nucleo interfase.

È stato suggerito che il DNA satellite possa essere coinvolto nel riconoscimento di regioni omologhe dei cromosomi durante la meiosi. Secondo altri presupposti, le regioni con sequenze ripetute frequentemente svolgono il ruolo di separatori (distanziatori) tra varie unità funzionali del DNA cromosomico, ad esempio tra i repliconi (vedi sotto).

Come si è scoperto, la frazione di sequenze moderatamente ripetute (da 10 2 a 10 5 volte) appartiene a una classe variegata di regioni del DNA che svolgono un ruolo importante nei processi di creazione dell'apparato di sintesi proteica. Questa frazione comprende geni del DNA ribosomiale, che possono essere ripetuti da 100 a 1000 volte in specie diverse. Questa frazione comprende regioni ripetute molte volte per la sintesi di tutti i tRNA. Inoltre, alcuni geni strutturali responsabili della sintesi di alcune proteine possono essere ripetuti anche più volte, rappresentati da molte copie. Questi sono i geni per le proteine della cromatina: gli istoni, ripetuti fino a 400 volte.

Inoltre, questa frazione comprende sezioni di DNA con sequenze diverse (100-400 coppie di nucleotidi ciascuna), ripetute anche molte volte, ma sparse nel genoma. Il loro ruolo non è ancora del tutto chiaro. È stato suggerito che tali sezioni di DNA possano rappresentare regioni accettrici o regolatrici di geni diversi.

Quindi, il DNA delle cellule eucariotiche è di composizione eterogenea, contenente diverse classi di sequenze nucleotidiche: sequenze ripetute frequentemente (> 10 6 volte), incluse nella frazione di DNA satellite e non trascritte; una frazione di sequenze moderatamente ripetitive (10 2 -10 5), che rappresentano blocchi di geni veri, nonché brevi sequenze sparse nel genoma; una frazione di sequenze uniche che trasportano informazioni per la maggior parte delle proteine cellulari.

Sulla base di queste idee, le differenze nella quantità di DNA osservate in diversi organismi diventano chiare: possono essere associate a una proporzione ineguale di alcune classi di DNA nel genoma degli organismi. Quindi, ad esempio, in un anfibio Anfiuma(che ha 20 volte più DNA di quello umano) le sequenze ripetute rappresentano fino all'80% del DNA totale, nelle cipolle - fino a 70, nel salmone - fino al 60%, ecc. La vera ricchezza dell'informazione genetica dovrebbe riflettersi nella frazione di sequenze uniche. Non dobbiamo dimenticare che in una molecola di DNA nativa e non frammentata del cromosoma, tutte le regioni che includono sequenze uniche, moderatamente e frequentemente ripetute sono collegate in un'unica gigantesca catena di DNA covalente.

Le molecole di DNA sono eterogenee non solo nelle aree di diverse sequenze nucleotidiche, ma differiscono anche nella loro attività sintetica.

Replicazione del DNA eucariotico

Il cromosoma batterico si replica come un'unità strutturale, avendo un punto iniziale e un punto terminale della replicazione. Quindi il DNA circolare batterico è uno replicone. Dal punto di partenza, la replicazione procede in due direzioni opposte, così che mentre il DNA viene sintetizzato si forma un cosiddetto occhio di replicazione, delimitato su entrambi i lati da forcelle di replicazione, che è chiaramente visibile durante l'esame al microscopio elettronico dei cromosomi replicativi virali e batterici .

Nelle cellule eucariotiche, l'organizzazione della replicazione è di natura diversa: polireplicone Come già accennato, con l'inclusione pulsata di 3 HT, in quasi tutti i cromosomi mitotici appare un'etichetta multipla. Ciò significa che simultaneamente ci sono molti siti di replicazione e molte origini di replicazione autonoma nel cromosoma interfase. Questo fenomeno è stato studiato più in dettaglio utilizzando l'autoradiografia di molecole marcate isolate dal DNA (Fig. 55). Se le cellule fossero marcate a impulsi con 3 HT, allora al microscopio ottico sugli autografi del DNA isolato si possono vedere aree di argento ridotto sotto forma di linee tratteggiate. Si tratta di piccoli tratti di DNA che sono riusciti a replicarsi, e tra di essi ci sono sezioni di DNA non replicato che non hanno lasciato un autoradiografo e quindi rimangono invisibili. All'aumentare del tempo di contatto di 3 NT con la cellula, la dimensione di tali segmenti aumenta e la distanza tra loro diminuisce. Da questi esperimenti è possibile calcolare con precisione la velocità di replicazione del DNA negli organismi eucarioti. La velocità di movimento della forcella di replica è risultata essere di 1-3 kb. al minuto nei mammiferi, circa 1 kb. al minuto in alcune piante, che è molto inferiore alla velocità di replicazione del DNA nei batteri (50 kb al minuto). Negli stessi esperimenti, la struttura polireplicon del DNA dei cromosomi eucariotici è stata dimostrata direttamente: lungo la lunghezza del DNA cromosomico, lungo di esso, ci sono molti siti di replicazione indipendenti: i repliconi. In base alla distanza tra i punti medi dei repliconi taggati adiacenti, ad es. In base alla distanza tra due punti iniziali di replica adiacenti, è possibile determinare la dimensione dei singoli repliconi. In media, la dimensione del replicone degli animali superiori è di circa 30 µm o 100 kb. Pertanto, dovrebbero esserci 20.000-30.000 repliconi nell'insieme aploide dei mammiferi. Negli eucarioti inferiori i repliconi sono più piccoli, circa 40 kb. Pertanto, nella Drosophila ci sono 3500 repliconi per genoma, e nel lievito – 400. Come accennato, la sintesi del DNA in un replicone avviene in due direzioni opposte. Ciò può essere facilmente dimostrato mediante autoradiografia: se alle cellule, dopo un impulso marcatore, viene permesso di continuare a sintetizzare il DNA per un certo tempo in un mezzo senza 3 HT, allora la sua inclusione nel DNA diminuirà, si verificherà una diluizione del marcatore e successivamente dall'autoradiografia sarà possibile vedere uno schema simmetrico su entrambi i lati della regione replicata, riducendo il numero di grani di argento ridotto.

Le estremità replicanti o le biforcazioni di un replicone smettono di muoversi quando incontrano le biforcazioni dei repliconi vicini (in un punto terminale comune ai repliconi vicini). A questo punto, le sezioni replicate dei repliconi vicini vengono combinate in singole catene covalenti di due molecole di DNA appena sintetizzate. La divisione funzionale del DNA cromosomico in repliconi coincide con la divisione strutturale del DNA in domini o anse, le cui basi, come già accennato, sono tenute insieme da legami proteici.

Pertanto, tutta la sintesi del DNA su un singolo cromosoma avviene attraverso la sintesi indipendente su molti repliconi individuali, seguita dall'unione delle estremità dei segmenti di DNA adiacenti. Il significato biologico di questa proprietà diventa chiaro se si confronta la sintesi del DNA nei batteri e negli eucarioti. Pertanto, un cromosoma batterico monoreplicon con una lunghezza di 1600 micron viene sintetizzato ad una velocità di circa mezz'ora. Se anche una molecola di DNA lunga un centimetro di un cromosoma di mammifero venisse replicata come struttura monoreplicon, occorrerebbe circa una settimana (6 giorni). Ma se un tale cromosoma contiene diverse centinaia di repliconi, la sua replica completa richiederà solo circa un'ora. Infatti, il tempo di replicazione del DNA nei mammiferi è di 6-8 ore. Ciò è dovuto al fatto che non tutti i repliconi di un singolo cromosoma sono attivati contemporaneamente.

In alcuni casi si osserva l'inclusione simultanea di tutti i repliconi o la comparsa di ulteriori origini di replicazione, che consente di completare la sintesi di tutti i cromosomi in un tempo minimamente breve. Questo fenomeno si verifica nelle prime fasi dell'embriogenesi di alcuni animali. È noto che quando si schiacciano le uova delle rane artigliate Xenopo laevis La sintesi del DNA richiede solo 20 minuti, mentre nella coltura delle cellule somatiche questo processo dura circa un giorno. Un quadro simile si osserva nella Drosophila: nei primi stadi embrionali, l'intera sintesi del DNA nel nucleo richiede 3,5 minuti e nelle cellule di coltura tissutale - 600 minuti. Allo stesso tempo, la dimensione dei repliconi nelle cellule di coltura si è rivelata quasi 5 volte maggiore rispetto a quella degli embrioni.

La sintesi del DNA avviene in modo non uniforme lungo la lunghezza di un singolo cromosoma. Si è scoperto che in un singolo cromosoma, i repliconi attivi sono assemblati in gruppi, unità replicative, che comprendono 20-80 origini di replicazione. Ciò è seguito dall'analisi degli autografi del DNA, dove è stato osservato esattamente tale blocco dei segmenti replicanti. Un'altra base per l'idea dell'esistenza di blocchi o gruppi di repliconi o unità di replicazione sono stati gli esperimenti con l'inclusione di un analogo della timidina, la 5'-bromodeossiuridina (BrdU), nel DNA. L'inclusione di BrdU nella cromatina interfase porta al fatto che durante la mitosi, le aree con BrdU si condensano in misura minore (condensazione insufficiente) rispetto a quelle aree in cui era inclusa la timidina. Pertanto, quelle regioni dei cromosomi mitotici in cui è inclusa BrdU saranno debolmente colorate durante la colorazione differenziale. Ciò rende possibile determinare la sequenza di incorporazione della BrdU utilizzando colture cellulari sincronizzate, ad es. sequenza di sintesi del DNA lungo la lunghezza di un cromosoma. Si è scoperto che si verifica l'inclusione del precursore in ampie sezioni del cromosoma. L'inclusione delle diverse sezioni avviene in modo rigorosamente sequenziale durante il periodo S. Ogni cromosoma è caratterizzato da un'elevata stabilità dell'ordine di replicazione lungo la sua lunghezza e ha il proprio modello di replicazione specifico.

Grappoli di repliconi, combinati in unità di replicazione, sono associati alle proteine della matrice nucleare (vedi sotto), che, insieme agli enzimi di replicazione, formano i cosiddetti. i clusterosomi sono zone nel nucleo interfase in cui avviene la sintesi del DNA.

L'ordine in cui vengono attivate le unità di replicazione può probabilmente essere determinato dalla struttura della cromatina in queste regioni. Ad esempio, le zone di eterocromatina costitutiva (vicino al centromero) sono solitamente replicate alla fine del periodo S; inoltre, alla fine del periodo S, parte dell'eterocromatina facoltativa raddoppia (ad esempio, il cromosoma X della femmina mammiferi). La sequenza di replicazione delle sezioni cromosomiche è correlata in modo particolarmente chiaro nel tempo con il modello di colorazione differenziale dei cromosomi: i segmenti R appartengono a segmenti a replicazione precoce, i segmenti G corrispondono a sezioni cromosomiche con replicazione tardiva. I segmenti C (centromeri) sono i siti dell'ultima replicazione.

Poiché in diversi cromosomi la dimensione e il numero di diversi gruppi di segmenti differenzialmente colorati sono diversi, ciò crea un'immagine dell'inizio e della fine asincroni della replicazione di diversi cromosomi nel loro insieme. In ogni caso, la sequenza dell'inizio e della fine della replicazione dei singoli cromosomi nel set non è casuale. Esiste una sequenza rigorosa di riproduzione cromosomica rispetto agli altri cromosomi del set.

La durata del processo di replicazione dei singoli cromosomi non dipende direttamente dalla loro dimensione. Pertanto, i grandi cromosomi umani del gruppo A (1-3) sono etichettati durante l'intero periodo S, così come i cromosomi più corti del gruppo B (4-5).

Pertanto, la sintesi del DNA nel genoma eucariotico inizia quasi contemporaneamente su tutti i cromosomi del nucleo all'inizio del periodo S. Ma allo stesso tempo, l'inclusione sequenziale e asincrona di diversi repliconi avviene sia in diverse parti dei cromosomi che in diversi cromosomi. La sequenza di replicazione di una particolare regione del genoma è strettamente determinata geneticamente. Quest'ultima affermazione è provata non solo dal modello di inclusione della marcatura in diversi segmenti del periodo S, ma anche dal fatto che esiste una sequenza rigorosa di comparsa dei picchi nella sensibilità di alcuni geni agli agenti mutageni durante il periodo S. -periodo.

1. Tipi di cromatina

2. Geni, spaziatori

3. Sequenza di nucleotidi nel DNA

4. Organizzazione spaziale del DNA

1. Durante il riposo tra gli atti di divisione, alcune sezioni di cromosomi e interi cromosomi rimangono compatti. Queste regioni della cromatina sono chiamate eterocromatina. Dipinge bene.

Dopo la divisione nucleare, la cromatina si scioglie e viene chiamata in questa forma eucromatina. L'eterocromatina è inattiva in relazione alla trascrizione e in relazione alla replicazione del DNA si comporta diversamente dall'eucromatina.

Eterocromatina facoltativaè eterocromatico solo a volte. È informativo, cioè contiene geni. Quando entra nello stato eucromatico, questi geni possono diventare disponibili per la trascrizione. Di due cromosomi omologhi, uno può essere eterocromatico. Questa eterocromatizzazione facoltativa è tessuto-specifica e non si verifica in alcuni tessuti.

Eterocromatina costitutiva sempre eterocromatico. È costituito da sequenze di basi ripetute ripetutamente, non è informativo (non contiene geni) ed è quindi sempre inattivo in relazione alla trascrizione. Puoi vederlo E durante la fissione nucleare. Esce con qualcuno:

Molto spesso al centromero;

Alle estremità dei cromosomi (compresi i satelliti);

Vicino all'organizzatore del nucleolo;

Vicino al gene 5S-RNA.

L'eterocromatina, principalmente facoltativa, durante l'interfase può unirsi in un cromocentro intensamente colorato, che nella maggior parte dei casi si trova sul bordo del nucleo cellulare o del nucleolo.

2. Ogni cromosoma lo è doppia elica continua del DNA, che negli organismi superiori è costituito da più di 10 8 paia di basi. Nei cromosomi delle piante e degli animali superiori, ciascuna doppia elica del DNA (2 nm di diametro) ha una lunghezza da uno a diversi centimetri. Come risultato di ripetute torsioni, viene confezionato in un cromatide lungo diversi micrometri.

I geni sono distribuiti linearmente lungo questa doppia elica e insieme costituiscono fino al 25% del DNA.

Geneè l'unità funzionale del DNA, contenente informazioni per la sintesi di un polipeptide o RNA. La lunghezza media del gene è di circa 1000 paia di basi. La sequenza di basi in ciascun gene è unica.

Tra i geni ci sono distanziatori- tratti di DNA non informativi di varia lunghezza (a volte più di 20.000 paia di basi), importanti per regolare la trascrizione di un gene vicino.

Spaziatori trascritti vengono terminati durante la trascrizione insieme al gene e le loro copie complementari appaiono nel pre-i-RNA su entrambi i lati della copia del gene. Anche all'interno del gene stesso ci sono (solo negli eucarioti e nei loro virus) sequenze non informative, i cosiddetti introni, che vengono anch'esse trascritte. Durante l'elaborazione, tutte le copie degli introni e la maggior parte delle copie degli spaziatori vengono eliminate dagli enzimi.

Spaziatori non trascritti si verificano tra i geni per gli istoni, così come tra i geni per l’rRNA.

Geni ridondanti sono rappresentati da un gran numero (fino a 10 4 o più) copie identiche. Questi sono i geni:

Per tRNA;

5S-RNA e istoni;

Per prodotti sintetizzati in grandi quantità.

Le copie si trovano direttamente una accanto all'altra e vengono risolte da spaziatori identici. Nel riccio di mare i geni per gli istoni H4, H2b, H2a e Hi si trovano uno dopo l'altro e questa sequenza genetica si ripete nel DNA più di 100 volte.

3. Sequenze ripetute - Si tratta di sequenze di nucleotidi presenti più volte nel DNA. Moderatamente ripetitivo sequenze - sequenze con una lunghezza media di 300 paia di basi con 10 2 -10 4 ripetizioni. Questi includono geni ridondanti, così come la maggior parte degli spaziatori.

Altamente ripetitivo sequenze con 10 5 -10 6 ripetizioni formano l'eterocromatina costitutiva. Essi sempre poco informativo. Si tratta per lo più di sequenze brevi, molto spesso se ne trovano 7-10 e solo raramente - solo 2 (ad esempio AT) o, al contrario, più di 300 coppie di nucleotidi. Si raggruppano insieme, con una sequenza ripetuta immediatamente successiva all'altra. I DNA cromatinici altamente ripetitivi sono chiamati “DNA satellite” a causa del loro comportamento durante le procedure di frazionamento analitico. Circa il 75% di tutta la cromatina non è coinvolta nella trascrizione: si tratta di sequenze altamente ripetitive e di spaziatori non trascritti.

4. Nella cromatina isolata sezioni della doppia elica del DNA avvolgono le molecole degli istoni, in modo che qui appaia una superelica del primo ordine. Vengono chiamati i complessi di DNA con istone nucleosomi. Hanno la forma di un disco o di una lente e le dimensioni sono circa 10 x 10 x 5 nm. Un nucleosoma incluso:

8 molecole istoni:

Tetramero centrale di due molecole H3 e due H4; e separatamente due H 2a e H 2 b;

Una sezione di DNA (circa 140 paia di basi) che forma circa 1,25 giri di un'elica ed è strettamente legata al tetramero centrale.

Tra i nucleosomi sono presenti tratti di elica di 30-100 paia di basi senza struttura superelicoidale; L'istone si lega qui Ciao

In cromatina cucita Il DNA viene ulteriormente accorciato da un ulteriore avvolgimento poco compreso (superavvolgimento di ordine superiore) che è apparentemente fissato dall'istone Hi (e da alcune proteine non istoniche). Durante la transizione all'interfase, l'eucromatina si allenta mentre alcuni dei superavvolgimenti di ordine superiore si svolgono. Ciò si verifica probabilmente come risultato di cambiamenti conformazionali negli istoni e dell'indebolimento delle interazioni tra le molecole Hi. Le strutture cromatiniche spesse 10-25 nm (fili o eliche cromatiniche principali) sono visibili anche durante l'interfase.

1. Tipi di cromatina

2. Geni, spaziatori

3. Sequenza di nucleotidi nel DNA

4. Organizzazione spaziale del DNA

1. Durante il riposo tra gli atti di divisione, alcune sezioni di cromosomi e interi cromosomi rimangono compatti. Queste regioni della cromatina sono chiamate eterocromatina. Dipinge bene.

Molto spesso al centromero;

Alle estremità dei cromosomi (compresi i satelliti);

Vicino all'organizzatore del nucleolo;

Vicino al gene 5S-RNA.

I geni sono distribuiti linearmente lungo questa doppia elica e insieme costituiscono fino al 25% del DNA.

Tra i geni ci sono distanziatori- tratti di DNA non informativi di varia lunghezza (a volte più di 20.000 paia di basi), importanti per regolare la trascrizione di un gene vicino.

Spaziatori non trascritti si verificano tra i geni per gli istoni, così come tra i geni per l’rRNA.

Geni ridondanti sono rappresentati da un gran numero (fino a 10 4 o più) copie identiche. Questi sono i geni:

Per tRNA;

5S-RNA e istoni;

Per prodotti sintetizzati in grandi quantità.

8 molecole istoni:

Tetramero centrale di due molecole H3 e due H4; e separatamente due H 2a e H 2 b;

Una sezione di DNA (circa 140 paia di basi) che forma circa 1,25 giri di un'elica ed è strettamente legata al tetramero centrale.

Tra i nucleosomi sono presenti tratti di elica di 30-100 paia di basi senza struttura superelicoidale; L'istone si lega qui Ciao

Trascrizionalmente attivo cromatina: geni che trasmettono le loro informazioni attraverso la sintesi RNA, a seguito di un'ulteriore despiralizzazione si allenta ancora di più. Secondo alcuni dati, nelle sezioni corrispondenti dell'elica del DNA, l'istone Hi è assente o chimicamente alterato, ad esempio fosforilato.

Struttura nucleosomica cambia o viene completamente distrutto (nei geni per l'r-RNA nel nucleolo). La doppia elica si srotola in determinati punti. Questi processi coinvolgono apparentemente alcune proteine non istoniche che si accumulano nelle regioni trascritte del DNA.

Domanda 38. Insieme di cromosomi

/. Genoma. Ploidia cellulare

2. Cromosomi politenici

1. L'intero patrimonio di informazioni genetiche di ciascun nucleo cellulare - genoma- distribuito tra un certo numero costante di cromosomi (n). Questo numero è specifico per ciascuna specie o sottospecie. Negli ascaridi del cavallo è 1, nel mais - 10, nell'uomo - 23, nelle alghe Netrio digitale - circa 600. I cromosomi dello stesso set sono diversi secondo i seguenti criteri:

misurare;

Immagine di un cromometro;

La posizione delle costrizioni;

Dipende da molteplicità del corredo cromosomico - ploidia- le cellule si dividono:

Ad aploide;

Diploide;

Poliploide.

Aploide sono chiamate cellule che contengono un singolo set di cromosomi (“), ad esempio, cellule sessuali.

Se le cellule contengono un doppio set di cromosomi (2 P), loro diploide, poiché in essi l'informazione genetica è presentata due volte. Quasi tutte le cellule somatiche delle piante e degli animali superiori sono diploidi. Contengono un set di cromosomi paterni e uno materno.

IN poliploide le cellule hanno diversi set di cromosomi (4 P, 8 P, 16 P, ecc.). Queste cellule sono spesso particolarmente attive dal punto di vista metabolico, come molte cellule del fegato nei mammiferi.

Le cellule aploidi si formano da cellule diploidi come risultato della meiosi e le cellule diploidi si formano da cellule aploidi come risultato della fecondazione.

Le cellule poliploidi derivano da quelle diploidi attraverso l'endomitosi - divisione nucleare prematuramente interrotta: dopo la completa replicazione e separazione dei cromatidi, i cromosomi figli rimangono nel nucleo di una cellula, invece di essere distribuiti tra due nuclei. Questo processo può essere ripetuto molte volte.

Anomalie durante la formazione delle cellule germinali può portare alla poliploidia dell'intero organismo. A replica incompleta Alcune parti del genoma, come l'eterocromatina, non si replicano e rimangono diploidi dopo l'endomitosi, a differenza di altre parti che diventano poliploidi.

Amplificazione genica - questa è una superreplicazione multipla quando solo alcuni geni vengono replicati e diventano poliploidi (geni per l'rRNA nel nucleolo).

Cromosomi nucleo diploide possono essere raggruppati in coppie, due cromosomi omologhi. La maggior parte di essi (i cosiddetti autosomi) identici a coppie. Solo due cromosomi sessuali che determinano il sesso di un individuo non sono gli stessi nei maschi: questi sono i cromosomi X e Y (eterocromosomi). La maggior parte del cromosoma Y è occupato dall'eterocromatina costitutiva. Le femmine hanno due cromosomi X. Tuttavia, nelle farfalle, negli uccelli e in numerosi altri animali la situazione è opposta: i maschi hanno il set XX, le femmine hanno il set XY.

2. Cromosomi politenici(cromosomi giganti) contengono molte volte più DNA di quelli normali. Non cambiano forma durante il ciclo di divisione e raggiungono una lunghezza fino a 0,5 mm e uno spessore di 25 micron. Si trovano, ad esempio, nelle ghiandole salivari dei ditteri (mosche e zanzare), nel macronucleo dei ciliati e nei tessuti ovarici dei fagioli. Molto spesso sono visibili nel numero aploide, poiché i cromosomi omologhi sono strettamente accoppiati. Politenia si verifica a seguito dell'endoreplicazione. Rispetto all'endomitosi, si tratta di un processo di divisione ancora più ridotto: dopo la replicazione, i cromatidi non vengono separati (il processo si ripete molte volte). In cui si moltiplicano diversi tratti di DNA a vari livelli:

Aree centromere - insignificanti;

La maggior parte delle aree informative sono circa 1000 volte;

Alcuni - più di 30.000 volte.

Ecco perché cromosomi politenici Sono fasci di innumerevoli cromatidi che non sono completamente separati. I cromatidi sono allungati, i cromomeri omologhi formano dischi scuri strettamente posizionati lungo il cromosoma. Questi dischi sono separati da strisce più chiare. Probabilmente, sul cromatidio, oltre allo spaziatore, si formano un disco e una striscia intermedia, un gene (meno spesso diversi geni), che, a quanto pare, si trova nel disco. I cromosomi politenici sono estremamente poveri di eterocromatina.

Sui cromosomi politenici dischi separati a volte si gonfiano pouf(Balbiani suona). Lì, i cromatidi omologhi si separano gli uni dagli altri, i cromomeri omologhi si allontanano e appare una struttura libera di cromatina trascrizionalmente attiva. I soffi contengono meno istone Hi dei dischi e contengono invece l'enzima RNA polimerasi (che indica la sintesi dell'RNA). C'è anche poco istone Hi nelle bande intermedie, ma è presente la RNA polimerasi e, forse, avviene almeno una sintesi minore RNA.

In una preparazione della cromatina, il DNA rappresenta solitamente il 30-40%. Questo DNA è una molecola elicoidale a doppio filamento. Il DNA della cromatina ha un peso molecolare di 7-9*10 6 . Una massa così relativamente piccola di DNA proveniente dai preparati può essere spiegata da un danno meccanico al DNA durante il processo di isolamento della cromatina.

La quantità totale di DNA inclusa nelle strutture nucleari delle cellule, nel genoma degli organismi, varia da specie a specie. Confrontando la quantità di DNA per cellula negli organismi eucarioti, è difficile discernere alcuna correlazione tra il grado di complessità dell'organismo e la quantità di DNA per nucleo. Diversi organismi, come il lino, il riccio di mare, il pesce persico (1,4-1,9 pg) o il salmerino e il toro (6,4 e 7 pg), hanno all'incirca la stessa quantità di DNA.

Alcuni anfibi hanno nei loro nuclei 10-30 volte più DNA che nei nuclei umani, sebbene la costituzione genetica degli esseri umani sia incomparabilmente più complessa di quella delle rane. Di conseguenza, si può presumere che la quantità "in eccesso" di DNA negli organismi organizzati a livello inferiore non sia associata all'adempimento di un ruolo genetico, oppure che il numero di geni venga ripetuto più volte.

Il DNA satellite, o la frazione di DNA con sequenze ripetute frequentemente, può essere coinvolto nel riconoscimento di regioni omologhe dei cromosomi durante la meiosi. Secondo altri presupposti, queste regioni svolgono il ruolo di separatori (distanziatori) tra varie unità funzionali del DNA cromosomico.

Come si è scoperto, la frazione di sequenze moderatamente ripetute (da 10 2 a 10 5 volte) appartiene a una classe variegata di regioni del DNA che svolgono un ruolo importante nei processi metabolici. Questa frazione comprende geni del DNA ribosomiale, sezioni ripetute ripetutamente per la sintesi di tutti i tRNA. Inoltre, alcuni geni strutturali responsabili della sintesi di alcune proteine possono essere ripetuti anche più volte, rappresentati da molte copie (geni per le proteine della cromatina - istoni).

Quindi, il DNA delle cellule eucariotiche ha una composizione eterogenea e contiene diverse classi di sequenze nucleotidiche:

sequenze ripetute frequentemente (>10 6 volte), incluse nella frazione di DNA satellite e non trascritte;

una frazione di sequenze moderatamente ripetitive (10 2 -10 5), che rappresentano blocchi di geni veri, nonché brevi sequenze sparse nel genoma;

una frazione di sequenze uniche che trasportano informazioni per la maggior parte delle proteine cellulari.

Il DNA di un organismo procariotico è una gigantesca molecola ciclica. Il DNA dei cromosomi eucariotici è costituito da molecole lineari costituite da repliconi di diverse dimensioni disposti in tandem (uno dopo l'altro). La dimensione media del replicone è di circa 30 micron. Pertanto, il genoma umano dovrebbe contenere più di 50.000 repliconi, sezioni di DNA sintetizzate come unità indipendenti. Questi repliconi hanno un punto iniziale e un punto terminale per la sintesi del DNA.

Immaginiamo che nelle cellule eucariotiche ciascuno del DNA cromosomico, come nei batteri, sia un replicone. In questo caso, con una velocità di sintesi di 0,5 micron al minuto (per l'uomo), la duplicazione del primo cromosoma con una lunghezza del DNA di circa 7 cm dovrebbe richiedere 140.000 minuti, ovvero circa tre mesi. Infatti, a causa della struttura polireplicata delle molecole di DNA, l'intero processo richiede 7-12 ore.

Rimozione dell'istone H1 dalla cromatina trascrizionalmente attiva 1*2*. I primi esperimenti di J. Bonner (USA) hanno dimostrato che il DNA nella cromatina è una matrice molto peggiore del DNA libero. Sulla base di queste osservazioni, è stato proposto che gli istoni siano repressori trascrizionali.

L. N. Ananyeva e Yu. V. Kozlov Il nostro laboratorio si è proposto di scoprire se tutti gli istoni hanno un effetto inibitorio o solo alcuni di essi. Per fare questo, gli istoni sono stati rimossi dalla cromatina delle cellule tumorali ascitiche di Ehrlich di topo mediante estrazione con soluzioni di NaCl con concentrazioni gradualmente crescenti. I preparati risultanti sono serviti da modello per la sintesi dell'RNA. La trascrizione è stata effettuata in presenza di RNA polimerasi di Escherichia coli, E. coli, prelevata in eccesso, e di una miscela di nucleosidi trifosfati. Nell'intervallo 0,4-0,6 M NaCl, si è verificata una forte decondensazione del materiale, manifestata nel rigonfiamento del gel nucleare e persino nella dissoluzione del DNP (se è stata effettuata un'ulteriore lavorazione meccanica). È stato dimostrato che questo rimuove selettivamente l'istone HI. Contemporaneamente alla decondensazione della cromatina si è verificato un forte aumento della sua attività di matrice (Fig. 26). Un ulteriore aumento della concentrazione di sale nella soluzione di estrazione ha portato alla rimozione di altri istoni e ad un ulteriore aumento leggero, ma non molto pronunciato, dell'attività della matrice.

0 t. Pertanto, l'ibridabilità rivela la percentuale di sequenze ripetute nell'RNA sintetizzato (secondo i risultati ottenuti da L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov e l'autore); b - principali parametri della sintesi dell'RNA su diverse matrici: DNA libero, cromatina originale (DNP 0) e cromatina da cui è stato rimosso l'istone H1 mediante estrazione con NaCl 0,6 M (DNP 0,6). La sintesi dell'RNA è stata effettuata utilizzando la RNA polimerasi di Escherichia coli in presenza di nucleosidi trifosfati marcati: [14 C]-ATP e [γ- 32 P]-ATP o [γ- 32 P]-GTP. [14 C]-UMP era incluso nell'intero RNA e [γ- 32 P] - solo all'inizio della catena (pp x A- o pp x G). In altre parole, l'inclusione di [ 32 P] ha fornito informazioni sull'inizio della sintesi e [ 14 C] - sulla sintesi stessa dell'RNA. In alcuni esperimenti, 3-4 minuti dopo l'inizio dell'incubazione, al terreno è stata aggiunta la rifampicina, un antibiotico, che ha impedito l'inizio di nuove catene di RNA, ma non ha influenzato la sintesi già iniziata, cioè l'allungamento. 1 - inclusione di [14 C] - UMP, 2 - lo stesso dopo l'aggiunta di rifampicina; 3 - inclusione di [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - lo stesso dopo l'aggiunta di rifampicina. Sulla base di queste curve di inclusione è possibile calcolare i parametri principali della reazione della RNA polimerasi (sulla base dei risultati ottenuti da Yu. V. Kozlov e dall'autore)">
Riso. 26. L'influenza dell'istone H1 sull'attività del modello del DNA nella cromatina. a - l'effetto della rimozione di proteine dalla cromatina (1) sull'attività della matrice (2) di quest'ultima in presenza di RNA polimerasi esogena di Escherichia coli, nonché sull'ibridizzabilità dell'RNA sintetizzato (3). Gli istoni e le proteine non istoniche sono stati estratti con concentrazioni crescenti di soluzioni di NaCl. Nell'intervallo 0,4 M NaCl - 0,6 M NaCl, l'istone H1 è stato rimosso selettivamente. L'RNA sintetizzato è stato ibridato con DNA in eccesso a valori C0 t intermedi. Pertanto, l'ibridabilità rivela la percentuale di sequenze ripetute nell'RNA sintetizzato (secondo i risultati ottenuti da L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov e l'autore); b - principali parametri della sintesi dell'RNA su diverse matrici: DNA libero, cromatina originale (DNP 0) e cromatina da cui è stato rimosso l'istone H1 mediante estrazione con NaCl 0,6 M (DNP 0,6). La sintesi dell'RNA è stata effettuata utilizzando la RNA polimerasi di Escherichia coli in presenza di nucleosidi trifosfati marcati: [14 C]-UTP e [γ- 32 P]-ATP o [γ- 32 P]-GTP. [14 C]-UMP era incluso nell'intero RNA e [γ- 32 P] - solo all'inizio della catena (pp x A- o pp x G). In altre parole, l'inclusione di [ 32 P] ha fornito informazioni sull'inizio della sintesi e [ 14 C] - sulla sintesi stessa dell'RNA. In alcuni esperimenti, 3-4 minuti dopo l'inizio dell'incubazione, al terreno è stata aggiunta la rifampicina, un antibiotico, che ha impedito l'inizio di nuove catene di RNA, ma non ha influenzato la sintesi già iniziata, cioè l'allungamento. 1 - inclusione di [14 C] - UMP, 2 - lo stesso dopo l'aggiunta di rifampicina; 3 - inclusione di [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - lo stesso dopo l'aggiunta di rifampicina. Sulla base di queste curve di inclusione, è possibile calcolare i parametri principali della reazione della RNA polimerasi (sulla base dei risultati ottenuti da Yu. V. Kozlov e dall'autore)

Le proprietà del sintetizzato in vitro RNA mediante ibridazione con DNA totale di topo. In questo caso è stata rilevata una frazione di RNA sintetizzata su sequenze ripetute di DNA. Si è scoperto che nella cromatina la trascrizione di sequenze ripetute di DNA è limitata. Tuttavia, dopo l'estrazione della cromatina con NaCl 0,6 M, quando l'istone H1 è stato rimosso, le proprietà di ibridazione dell'RNA sintetizzato sulla matrice di tale cromatina e sulla matrice del DNA libero sono diventate indistinguibili. Abbiamo ipotizzato che gli istoni H2a, H2b, H3 e H4 (allora chiamati diversamente - istoni moderatamente ricchi di lisina e ricchi di arginina) non siano coinvolti nella soppressione della trascrizione, ma svolgano un ruolo puramente strutturale nell'organizzazione della cromatina, mentre l'istone H1 (nella vecchia terminologia istone, ricco di lisina) è un inibitore della sintesi dell'RNA. Allo stesso tempo, è anche un fattore che causa la condensazione della cromatina (vedi sopra).

Successivamente Yu V. Kozlov studiò il meccanismo di inibizione della trascrizione da parte dell'istone H1, sempre su un sistema privo di cellule con RNA polimerasi isolata da E. coli. È stato studiato l'effetto dell'istone H1 sui processi di inizio e allungamento (vedi Fig. 26, Tabella 4). Si è scoperto che riduce più volte il numero di catene di RNA iniziate sulla matrice cromatinica nativa. L'allungamento è particolarmente inibito: l'RNA polimerasi non legge più di 100-150 bp. DNA e poi si ferma. Nel frattempo, sulla cromatina da cui è stato rimosso l'istone H1, l'RNA polimerasi legge diverse migliaia di coppie di nucleotidi alla volta e la lunghezza delle catene non differisce dalla lunghezza delle catene sintetizzate sullo stampo di DNA libero. È vero, sul DNA libero, rispetto alla cromatina da cui è stato rimosso l'istone H1, i processi di inizio della sintesi dell'RNA avvengono in modo più efficiente. Si è concluso che l'istone H1, condensando la cromatina, crea ostacoli sul percorso della RNA polimerasi e quindi arresta la sintesi dell'RNA.

* (Il DNPM è un DNP isolato mediante trattamento con urea che è completamente solubilizzato ma conserva l'istone H1.)

Alla luce dei dati moderni sulla struttura del solenoide della fibrilla 300 A-DNP, che dipende dalla presenza dell'istone H1, questo risultato è facilmente spiegabile. Infatti, la RNA polimerasi ovviamente non può leggere più di 100 bp nel solenoide. a causa di vincoli puramente topologici.

Secondo la nostra ipotesi, quando il gene è stato attivato, l'istone H1 dovrebbe essere rimosso. Tuttavia, in quel momento non è stato possibile verificarlo. Solo relativamente di recente sono emerse prove della perdita dell'istone H1 dalla cromatina durante l'attivazione del gene. Pertanto, quando da un certo numero di organismi sono state isolate regioni della cromatina attivamente trascritte, ad esempio mini-nucleoli, in esse non è stato rilevato l'istone H1. Non si trova nemmeno nel lievito, dove tutti i geni sono potenzialmente attivi.

Risultati convincenti sono stati ottenuti in laboratorio A. D. Mirzabekova V. L. Karpov e O. V. Preobrazhenskaya. Hanno sviluppato un metodo chiamato “ibridazione ombra istonica”. Per fare ciò, il DNA è stato reticolato con gli istoni utilizzando dimetilsolfato in condizioni in cui, in media, una molecola di istone è reticolata per segmento di DNA di circa 200-300 bp di lunghezza. Il DNA è stato quindi frammentato ed è stata eseguita l'elettroforesi bidimensionale su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Dopo aver corso nella prima direzione, gli istoni attaccati al DNA venivano distrutti dalla proteinasi e il DNA già libero veniva accelerato nella seconda direzione. Poiché durante il primo ciclo di elettroforesi diversi istoni hanno rallentato il movimento dei frammenti di DNA in modi diversi, dopo il secondo ciclo sono state rivelate diverse diagonali (Fig. 27). Di solito tre sono chiaramente visibili: uno corrispondente al DNA inizialmente libero, l'altro ai complessi di DNA originali con istoni centrali e il terzo (in basso) al complesso di DNA originale con istone H1. Il DNA risultante viene trasferito su un filtro e ibridato con un particolare campione. Se per l'ibridazione veniva presa una regione inattiva del genoma, ad esempio lo spaziatore del gene ribosomiale della Drosophila, l'etichetta veniva associata a tutte le diagonali. Se, tuttavia, come campione veniva utilizzato il gene dello shock termico, che è stato trascritto nelle cellule da cui è stata isolata la cromatina, l'ibridazione con la diagonale corrispondente ai complessi di DNA con l'istone H1 era nettamente indebolita o completamente assente. In altre parole, nei nuclei, prima dell'attaccamento, il DNA del gene trascritto non aveva contatti con l'istone H1.

Riso. 27. Perdita dell'istone H1 e degli istoni centrali all'attivazione della trascrizione. Gli esperimenti sono stati condotti su cellule di coltura di D. melanogaster (a, b) in condizioni di coltivazione a 25° (a) e shock termico (b). Nel caso a non c’è espressione dei geni dello shock termico; nel caso b è molto attivo. Inoltre, sono stati condotti esperimenti su embrioni decorionizzati (c), dove l'espressione dei geni dello shock termico è ad un livello medio. Dopo la formazione dei complessi DNA-proteina, l'isolamento dei frammenti di DNA, la loro separazione bidimensionale (in direzione verticale dopo rimozione della proteina) e il trasferimento su un filtro, gli stessi filtri sono stati ibridati con campioni diversi: con la regione regolatrice di il gene dello shock termico p70 (HS-5") ; con la regione codificante dello stesso gene (codice TS); con un campione di un'inserzione trascrizionalmente inattiva nel gene rDNA (inattivo). Tre diagonali sono visibili nel gene inattivo ; 1 - DNA libero, 2 - Complessi di DNA con istoni ottameri; 3 - Complessi di DNA Con istone H1. L'indebolimento o la scomparsa dei complessi DNA-istone in seguito all'attivazione della cromatina è visibile (secondo i risultati ottenuti da A. D. Mirzabekov et al.)

Sebbene tutti i dati attualmente disponibili, presi singolarmente, consentano altre interpretazioni, nel loro insieme forniscono una forte evidenza a favore della rimozione dell’istone H1 dalla cromatina attiva. Tuttavia, il meccanismo di questo processo non è ancora del tutto chiaro.

Destino dei nucleosomi durante l'attivazione della cromatina 2* [154-157]. Meno chiara è la questione del destino degli istoni H2a, H2b, H3 e H4, che costituiscono il nucleo del nucleosoma. Negli esperimenti di cui sopra Yu.V. Kozlova la loro presenza non ha praticamente alcun effetto sulla trascrizione del DNA da parte della RNA polimerasi Escherichia coli. Studiando i prodotti dell'idrolisi della cromatina eucariotica, molti autori hanno scoperto che i nucleosomi contengono DNA di geni attivi, cioè questi ultimi sono anche organizzati in nucleosomi. Dati ottenuti da materiale sperimentale di grandi dimensioni A. D. Mirzabekova et al. mostrano che i nucleosomi contenenti DNA trascritto attivamente sono fondamentalmente costruiti allo stesso modo dei nucleosomi contenenti DNA inattivo, sebbene alcuni contatti DNA-istone in essi siano modificati.

Sono stati condotti anche esperimenti sull'ibridazione con ombre istoniche, discusse nella sezione precedente (vedere Fig. 27). Preparazioni con diagonali sono state preparate da cellule di Drosophila in cui i geni dello shock termico o non funzionavano affatto, cioè erano spenti, oppure lavoravano a un livello basso, o, infine, venivano stimolati dallo shock termico alla trascrizione attiva. In tutti i casi, il campione di controllo era il DNA del gene spaziatore ribosomiale, che si ibridava in tutte e tre le diagonali, inclusa la diagonale derivata dai complessi di DNA con gli istoni centrali.

Anche il gene dello shock termico si ibridava normalmente con questa diagonale da cellule in cui non era stato trascritto. Tuttavia, con materiale ottenuto da cellule con trascrizione moderata del gene dello shock termico, l'ibridazione della seconda diagonale era significativamente ridotta. Infine, se le diagonali fossero ottenute da cellule con sintesi molto attiva dell'mRNA da shock termico, la seconda diagonale non sarebbe stata affatto visibile durante l'ibridazione (come lo era la terza), e sarebbe stata rivelata solo la diagonale che corrispondeva al DNA non reticolato con gli istoni La conclusione generale tratta dagli studi utilizzando il metodo di reticolazione delle proteine del DNA è stata che durante la trascrizione, l'RNA polimerasi che si muove lungo la catena del DNA fa collidere reversibilmente i nucleosomi con il DNA e trascrive il DNA praticamente nudo. Se il livello di trascrizione è basso e ci sono poche RNA polimerasi che strisciano lungo il DNA, i nucleosomi hanno il tempo di formarsi nuovamente nell'area attraverso la quale è già passata la RNA polimerasi. Se la trascrizione è attiva, la struttura nucleosomiale del DNA non ha il tempo di essere ripristinata e il DNA è generalmente privo di istoni. Allo stesso tempo, si postula che l'organizzazione dei nucleosomi nella cromatina attiva non sia praticamente diversa da quella nella cromatina inattiva. Recentemente, A.D. Mirzabekov et al. hanno riprodotto esperimenti sull'attaccamento degli istoni al DNA utilizzando un metodo diverso, trattando nuclei isolati con preparati di platino. Questo metodo è più delicato del dimetilsolfato. Fondamentalmente sono stati ottenuti gli stessi risultati.

Insieme a questo insieme di dati, ci sono studi in cui gli autori giungono a conclusioni leggermente diverse. W. Garrard e A. Worsel(USA), studiando lo stato dei geni attivi nella cromatina mediante l'idrolisi delle nucleasi e la microscopia elettronica, sono giunti alla conclusione che i nucleosomi rimangono nella cromatina attiva, ma subiscono cambiamenti strutturali come girarsi, trasformandosi in seminucleosomi. Di conseguenza, la periodicità negli elettroferogrammi degli idrolizzati con nucleasi micrococcica è di ~ 200 bp. sostituito da una periodicità di ~100 bp. Con la microscopia elettronica il numero delle perle raddoppia e le loro dimensioni diminuiscono. Si presume che l'RNA polimerasi possa passare attraverso tali nucleosomi spiegati.

Questa possibilità è supportata anche dai dati ottenuti T. Koller(Svizzera). Ha sviluppato un metodo originale per studiare i nucleosomi. Le cellule vengono trattate con psoraleni, una sostanza che si lega al DNA e poi reticola due filamenti di DNA insieme alla luce UV. Tuttavia, se il DNA fa parte dei nucleosomi, la sua reazione con lo psoralene non avviene. Pertanto, se il DNA isolato dalle cellule trattate viene denaturato in presenza di formaldeide (impedisce la rinaturazione del DNA), allora al microscopio elettronico, si alternano bolle (due filamenti di DNA denaturato) corrispondenti a nucleosomi collegati tra loro da singoli filamenti (croce -linked, non suscettibili di denaturazione) sono visibili sul DNA (DNA) corrispondenti ai linker internucleosomiali. Innanzitutto sono stati studiati i geni dell'RNA ribosomiale trascritto attivamente, che fanno parte di strutture extracromosomiche e quindi facilmente analizzabili mediante microscopia elettronica. In essi, le vescicole corrispondenti ai nucleosomi non sono visibili, cioè, con ogni probabilità, gli istoni vengono completamente rimossi dalle regioni trascritte. È interessante notare che nelle regioni non trascritte sono chiaramente visibili gli spaziatori, le bolle di DNA (nucleosomi).

Tuttavia, risultati diversi sono stati ottenuti sui minicromosomi SV40, che sono trascritti dalla RNA polimerasi II anziché dalla RNA polimerasi I come i geni dell'RNA ribosomiale (Fig. 28). I mini-cromosomi trascrizionalmente attivi vengono identificati grazie alla presenza di catene di RNA in crescita (di solito una o due) su di essi. Tali minicromosomi costituiscono l'1-2% di tutti i minicromosomi isolati dalla cellula. Tuttavia contengono lo stesso numero di vescicole dei minicromosomi inattivi e le loro dimensioni sono le stesse in entrambi i casi. La cosa più interessante è che le catene di RNA si estendono sia dai linker che direttamente dalle vescicole, cioè la RNA polimerasi apparentemente trascrive i nucleosomi. Questi dati supportano lo sviluppo dei nucleosomi e la loro trascrizione da parte della RNA polimerasi.

Tutti i risultati di cui sopra non sono diretti e pertanto gli esperimenti futuri dovrebbero fornire una soluzione finale alla questione del destino dei nucleosomi durante la trascrizione.

Modificazione dell'istone e varianti dell'istone: associazione con la cromatina attiva. All'inizio degli anni '60 Allfrey (USA) dimostrò che gli istoni possono subire varie modifiche. Pertanto, l'istone HI viene fosforilato nei gruppi ε-amminici della lisina. Gli istoni H3 e H4 sono acetilati sugli stessi gruppi. Esistono numerose altre modifiche (metilazione, ADP - ribosilazione, ubiquitinazione, ecc.).

Si è subito ipotizzato che le modifiche enzimatiche degli istoni potessero influenzare la struttura della cromatina e la sua attività. Infatti, quando la lisina viene fosforilata, una carica positiva in un istone viene sostituita con una negativa, quando viene richiamata si perde una carica positiva, ecc. È grazie a tali cambiamenti di carica che gli istoni modificati possono essere separati da quelli non modificati durante l'esecuzione elettroforesi su gel in tampone acetato con urea. Pertanto, nell'elettroforesi ad alta risoluzione, l'istone H4 fornisce non una, ma quattro bande, corrispondenti a molecole che non sono acetilate e acetilate su uno, due e tre residui di lisina. Nei diversi tessuti il rapporto tra le frazioni cambia. Gli istoni H3, H2a, H2b e H1 sono divisi in diverse frazioni (diversi gradi di acetilazione e fosforilazione).

Sfortunatamente, non esistono ancora buoni metodi per separare la cromatina trascrizionalmente attiva da quella inattiva e quindi è difficile attribuire forme istoniche alterate all'uno o all'altro stato della cromatina. I dati più interessanti in questa direzione sono stati ottenuti dagli stessi W.Alfrey(STATI UNITI D'AMERICA). Durante l'idrolisi della cromatina attiva, ha isolato particelle insolite che sedimentavano nel gradiente di saccarosio più lentamente dei nucleosomi ordinari e, secondo l'opinione dell'autore, corrispondevano a nucleosomi spiegati. Queste particelle, chiamate particelle A, contenevano tutti gli istoni centrali. A differenza dei normali nucleosomi, i gruppi SH dell'istone H3 nelle particelle A erano accessibili a un numero di reagenti chimici e, per questo motivo, le particelle A potevano essere separate dai nucleosomi mediante frazionamento su colonne di cloromercuribenzoato (un reagente che lega i gruppi SH). Le particelle A contengono un contenuto aumentato di forme acetilate di istoni. L'autore suggerisce che l'acetilazione dell'istone in seguito all'attivazione della cromatina porta allo sviluppo di particelle nucleosomiali e questo, a sua volta, aumenta la disponibilità dei gruppi SH dell'istone H3.

Alcuni istoni sono codificati da più di un tipo di gene. Di conseguenza, esistono diverse varianti di questi istoni che differiscono leggermente nella sequenza aminoacidica. A volte nel processo di ontogenesi avviene una sostituzione naturale di una sottoclasse di istoni con un'altra. Non è chiaro, tuttavia, se ciò abbia un significato normativo. Il problema, ovviamente, potrà essere risolto anche dopo lo sviluppo di metodi adeguati per isolare la cromatina trascrizionalmente attiva.

Una posizione speciale è occupata dall'istone H1. Ci sono opzioni che differiscono nettamente nella loro organizzazione strutturale. Questa opzione è, ad esempio, l'istone H5, che sostituisce una parte significativa dell'istone H1 nei nuclei degli eritrociti aviari. Con ogni probabilità, questa sostituzione è un fattore importante nella completa interruzione della trascrizione nei nuclei degli eritrociti. Nelle cellule normali esiste una variante dell'istone H1: l'istone H1 0. Il suo contenuto costituisce una piccola frazione dell'istone H1 totale. Esistono numerosi dati contraddittori secondo cui H1 0 è associato a geni attivi o, al contrario, a geni stabilmente disattivati. La questione rimane aperta.

Le proteine HMG possono essere coinvolte nell'organizzazione della cromatina attiva 1*. Oltre agli istoni, la cromatina contiene molte proteine non istoniche la cui funzione è sconosciuta. Tra questi, ovviamente, dovrebbero esserci proteine strutturali, enzimi che assicurano i processi di replicazione, trascrizione, ecc., e proteine regolatrici. E. Jones(Gran Bretagna) hanno tentato di isolare componenti proteici presenti in quantità sufficientemente grandi da consentirne l'analisi e l'identificazione. Riuscì effettivamente a isolare una nuova classe di proteine nucleari, che chiamò il “gruppo di proteine ad alta mobilità” ( gruppo ad alta mobilità) o proteine HMG. Il nome dipende dall'elevata mobilità di queste proteine durante l'elettroforesi su gel. La frazione proteica HMG si scompone in una serie di singoli componenti. Tra questi, i più rappresentativi e ben caratterizzati sono HMG-1, HMG-2, HMG-14 e HMG-17.

Le proteine HMG hanno un basso peso molecolare. Sono arricchiti con aminoacidi sia basici che bicarbossilici. Il contenuto delle proteine HMG è circa il 7% del contenuto degli istoni. Può variare nei nuclei di diversi tipi di cellule. In questo contesto, siamo maggiormente interessati alle proteine HMG-14 e HMG-17, per le quali è stata ottenuta evidenza di un possibile ruolo nell'attivazione della trascrizione. H.Weintraub(USA) hanno dimostrato che l'estrazione nucleare con NaCl 0,35 M, che estrae le proteine HMG, modifica alcune proprietà della cromatina attiva, che vengono ripristinate quando HMG-14 e HMG-17 vengono aggiunti alla cromatina. G. Dixon(Canada) ha scoperto queste proteine nella composizione dei nucleosomi rilasciati dalla cromatina nelle prime fasi dell'idrolisi mediante nucleasi, che, secondo i suoi dati, erano arricchiti nel DNA di geni trazionalmente attivi.

termina [32 P] e poi ibridato con hnRNA da cellule L. Gli ibridi sono stati rilevati mediante filtrazione su gel. 1 - DNA CH-2; 2 - DNA CH-3; 3 - DNA totale della cellula (secondo i risultati ottenuti da V.V. Bakaev et al.)">
Riso. 29. Possibile connessione delle proteine HMG (14 e 17) con la cromatina attiva. a - rilevamento di subnucleosomi negli idrolizzati di cromatina mediante nucleasi micrococcica. Nei diversi stadi dell'idrolisi compaiono alcune frazioni di subnucleosomi. L'elettroforesi è stata effettuata in gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti. Colorazione con bromuro di etidio, fluorografia sulla colonna di destra; b - utilizzo dell'elettroforesi bidimensionale per determinare la composizione proteica dei subnucleosomi CH2 e CH3. La cromatina marcata con la proteina [14C] è stata idrolizzata con nucleasi micrococcica e separata mediante elettroforesi bidimensionale (1a direzione - mezzo non dissociante, 2a direzione - soluzione di sodio dodecil solfato), dopo di che è stata eseguita l'autoradiografia per identificare le proteine. Le lettere indicano proteine HMG che al momento dell'esperimento non erano ancora state identificate con quelle conosciute. Ora sappiamo che A è HMG-1, B è HMG-2, E è HMG-14, G è HMG-17, le proteine HMG F e H non sono chiaramente identificate, probabilmente H corrisponde anche a HMG-17. Si può vedere che le proteine HMG fanno parte dei mononucleosomi (MH-2 e MH-3) e dei subnucleosomi CH-2 (HMG-17) e CH-3 (HMG-14); c - dimostrazione dell'arricchimento del DNA delle sequenze trascritte CH-2 e CH-3. Il DNA isolato dalle bande CH-2 e CH-3 delle cellule L è stato marcato alle estremità da 5" [32 P] e quindi ibridato con hnRNA delle cellule L. Gli ibridi sono stati rilevati mediante filtrazione su gel. 1 - DNA CH-2; 2 - DNA CH-3; 3 - DNA totale della cellula (secondo i risultati ottenuti da V.V. Bakaev et al.)

V. V. Bakaev nel nostro laboratorio siamo giunti alla conclusione sul ruolo delle proteine HMG nella trascrizione utilizzando un diverso approccio sperimentale. Durante l'analisi elettroforetica degli idrolizzati di cromatina, ha rivelato, oltre ai nucleosomi e agli oligonucleosomi, componenti minori con maggiore mobilità. Erano chiamati subnucleosomi e, ovviamente, erano il prodotto di un'ulteriore rottura del nucleosoma (Fig. 29, Tabella 5). Il subnucleosoma CH-7 corrispondeva a un nucleosoma che aveva perso una molecola ciascuno di H2a e H2b e conteneva DNA accorciato di 40 bp; CH-6 corrispondeva a un complesso di DNA lungo 30-40 bp. con l'istone H1, che viene scisso da MH-2 durante la sua trasformazione in MH-1. CH-4 conteneva un segmento di DNA e una coppia di istoni H2a e H2b (il prodotto della reazione MH-1→CH-7→CH-4). Due subnucleosomi, CH-3 e CH-2, erano costituiti da DNA corto e proteine HMG (HMG-14 e HMG-17). Si potrebbe supporre che si tratti di regioni linker associate alle proteine HMG-14 e HMG-17, che passano in soluzione dopo la digestione dei corrispondenti nucleosomi. Sono stati raccolti CH-2 e CH-3, il DNA è stato isolato da essi, marcato all'estremità ed è stata studiata la sua ibridazione con l'RNA nucleare. Si è scoperto che il DNA di CH-2 e CH-3 si ibrida in modo molto più efficiente con l'RNA nucleare rispetto al DNA cellulare totale frammentato alla stessa dimensione.

Si è quindi concluso che il DNA associato alle proteine HMG-14 e HMG-17 probabilmente proveniva dalla cromatina trascrizionalmente attiva.

Tutti questi dati, ottenuti indipendentemente, suggeriscono che HMG-14 e HMG-17 siano in qualche modo associati all'attivazione genica. Il meccanismo di attivazione, tuttavia, non era del tutto chiaro. HMG-14 e HMG-17 non potrebbero essere i fattori primari che attivano il gene, poiché mancano di specificità. Si potrebbe pensare che siano coinvolti nel mantenimento della “conformazione aperta” della cromatina attiva.

Negli anni successivi emerse lo scetticismo riguardo al ruolo di HMG-14 e HMG-17 nell'attivazione della cromatina. In particolare, di recente A. D. Mirzabekov et al. utilizzando il metodo di ibridazione con tessuti proteici, abbiamo ottenuto dati sulla deplezione della cromatina attiva di HMG-14 e HMG-17. Poiché, tuttavia, tutti i dati sopra riportati sono indiretti, in generale la questione del ruolo delle proteine HMG rimane aperta e richiede ulteriori studi.

La topoisomerasi I e le proteine strettamente legate al DNA fanno parte della cromatina trascrizionalmente attiva 1*. S. Elgin (USA), seguito da numerosi altri autori, ha dimostrato che la cromatina trascrizionalmente attiva contiene topoisomerasi I, un enzima che rilassa il DNA superavvolto. Ciò è stato dimostrato per la prima volta su preparazioni citologiche di cromosomi politenici della Drosophila utilizzando anticorpi fluorescenti contro la topoisomerasi I. Questo enzima introduce una rottura a filamento singolo nel DNA e si lega covalentemente all'estremità risultante da 5 pollici del DNA. Ciò consente al DNA di ruotare liberamente a il punto di rottura. Quindi il frammento viene tagliato e il legame fosfodiesterico nel DNA viene ripristinato. In termini di peso molecolare, la topoisomerasi I, o topo I in breve, è eterogenea. Il componente più pesante ha un peso molecolare 135 kDa, e il più riccamente rappresentato - 80 kDa. Quando viene scisso dalle proteinasi, si formano polipeptidi più corti, che tuttavia mantengono l'attività enzimatica.

L'antibiotico captotecina è un inibitore della topo I e, quando le cellule vengono trattate con esso, l'enzima forma legami crociati covalenti con il DNA nel luogo in cui si trovava al momento del contatto con l'antibiotico. La posizione di tali legami incrociati può essere facilmente determinata mappando utilizzando un tag di ibridazione. In questo modo si è scoperto che la topo I è presente esclusivamente nelle regioni trascritte del genoma, cioè, molto probabilmente, lavora in collaborazione con la RNA polimerasi II, rimuovendo le torsioni locali del DNA che si verificano durante la trascrizione.

Un'altra componente proteica rilevata nelle regioni trascritte del genoma è un insieme di proteine strettamente legate al DNA (DBP), che corrisponde al DNA trascritto della cellula (vedere Sezione 3.4).

S. V. Razin e V. V. ChernokhvostovÈ stato fatto un tentativo di caratterizzare in dettaglio i complessi di DNA con PBP. Frammenti di DNA di 1-2 kb di lunghezza associati alla PBP sono stati purificati e sottoposti a ultracentrifugazione all'equilibrio in un gradiente di densità CsCl. La loro densità di galleggiamento si è rivelata uguale 1,7 g/cm3, cioè corrispondeva alla densità vivace del DNA libero che non contiene proteine. Negli esperimenti volti a spiegare questo paradosso, si è scoperto che il trattamento con DRNasi porta ad una diminuzione della densità di galleggiamento dei complessi da 1,62-1,65 g/cm3. Calcoli approssimativi basati sulla densità proteica ( ~ 1,3 g/cm3) e RNA ( ~ 1,9 g/cm3), (dimostrare che per ogni molecola di DNA ci sono circa 150 kDa proteine e circa 200 nucleotidi di RNA. La natura di questo RNA non è chiara, ma sono state ottenute prove della sua omogeneità e della sequenza nucleotidica unica.

Pertanto, gran parte dei complessi DNA-PBP rimane misteriosa, ma con ogni probabilità essi svolgono un ruolo significativo nell’organizzazione del meccanismo di trascrizione. La loro ricerca è attualmente in corso.

Demetilazione del DNA nei geni trascritti 2*. Un'altra caratteristica importante della cromatina attiva è la demetilazione di alcune sezioni del DNA. Nei geni inattivi, la maggior parte dei residui citidilici all'interno delle sequenze CG sono metilati. Primo BV Vanyushin nel laboratorio A. N. Belozerskyè stato dimostrato che il DNA in diversi tessuti dello stesso animale differisce nel livello di metilazione di C. Sulla base di ciò, è stato suggerito che la metilazione possa avere un ruolo regolatore nella differenziazione. Successivamente, molti autori hanno dimostrato che alcune regioni del DNA trascritto sono sottometilate. Il metodo di analisi più utilizzato è il confronto di mappe di restrizione ottenute con enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza, come CGCG o CCGG, ma hanno sensibilità alla metilazione diverse. Uno degli enzimi di restrizione taglia sia le sequenze metilate che quelle non metilate, mentre l'altro taglia solo quelle non metilate. Tipicamente, le sequenze non metilate sono localizzate nella regione regolatoria del gene. La regione del gene stesso, la sua parte codificante e gli introni sono ugualmente metilati sia nei geni funzionanti che in quelli silenziosi.

Quando il DNA metilato viene introdotto nelle cellule, la sua espressione nella cellula è significativamente ridotta rispetto al DNA non metilato. Sono stati ottenuti dati secondo i quali, durante la replicazione del DNA, viene riprodotto lo stato di metilazione del DNA: se una delle catene è metilata, anche la catena appena formata viene metilata nello stesso punto.

Un tempo sembrava che la metilazione-demetilazione della citidina nelle sequenze CG della regione regolatoria fosse il principale meccanismo di inattivazione-attivazione genica. Tuttavia, recentemente sono emersi alcuni dati che contraddicono questa ipotesi. Pertanto, il DNA SV40 completamente metilato in CG viene espresso attivamente. Allo stesso tempo, la metilcitosina non viene rilevata affatto nel DNA della Drosophila. È possibile che la demetilazione di C sia una conseguenza dell'attivazione genica e perpetui solo lo stato di attività trascrizionale. Qui, come in altre aree di studio dell’attivazione genetica, sono necessari nuovi esperimenti.