Kromatin: definicija, struktura i uloga u staničnoj diobi. Tri frakcije eukariotske DNA, njihova lokalizacija u kromosomima i funkcije Strukturne i funkcionalne komponente kromatina

Kromatin, glavnu komponentu stanične jezgre, relativno je lako dobiti iz izoliranih interfaznih jezgri i iz izoliranih mitotičkih kromosoma. Da bi to učinili, koriste njegovu sposobnost da prijeđe u otopljeno stanje tijekom ekstrakcije s vodenim otopinama niske ionske jakosti ili jednostavno deioniziranom vodom. U tom slučaju dijelovi kromatina bubre i pretvaraju se u gel. Da bi se takvi lijekovi pretvorili u prave otopine, potrebni su snažni mehanički utjecaji: mućkanje, miješanje, dodatna homogenizacija. To, naravno, dovodi do djelomičnog uništavanja izvorne strukture kromatina, drobeći ga u male fragmente, ali praktički ne mijenja njegov kemijski sastav.

Frakcije kromatina dobivene iz različitih objekata imaju prilično ujednačen skup komponenti. Utvrđeno je da se ukupni kemijski sastav kromatina iz interfaznih jezgri i mitotskih kromosoma malo razlikuju jedni od drugih. Glavne komponente kromatina su DNA i proteini, od kojih većinu čine histoni i nehistonski proteini (vidi tablicu 3).

Tablica 3. Kemijski sastav kromatina. Sadržaj proteina i RNA dat je u odnosu na DNA

U prosjeku, oko 40% kromatina je DNA, a oko 60% su proteini, uključujući specifične nuklearne proteine - histoni, čine od 40 do 80% svih proteina koji čine izolirani kromatin. Osim toga, frakcija kromatina uključuje komponente membrane, RNA, ugljikohidrate, lipide i glikoproteine. Pitanje koliko su te manje komponente uključene u strukturu kromatina još nije riješeno. Tako, na primjer, RNA može biti transkribirana RNA koja još nije izgubila vezu s DNA šablonom. Ostale manje komponente mogu predstavljati tvari iz koprecipitiranih fragmenata nuklearne membrane.

Strukturno, kromatin je filamentni kompleks molekula deoksiribonukleoproteina (DNP), koji se sastoji od DNA povezane s histonima (vidi sliku 57). Stoga se ukorijenio drugi naziv za kromatin - nukleohiston. Zbog povezanosti histona s DNA nastaju vrlo labilni, varijabilni kompleksi nukleinske kiseline i histona, gdje je omjer DNA:histoni približno jedan, tj. prisutni su u jednakim težinskim količinama. Ove filamentne DNP fibrile su elementarni kromosomski ili kromatinski filamenti, čija debljina, ovisno o stupnju pakiranja DNA, može biti u rasponu od 10 do 30 nm. Ove DNP fibrile mogu se, pak, dalje zbijati kako bi formirale više razine DNP strukturiranja, sve do mitotskog kromosoma. Uloga nekih nehistonskih proteina je upravo u formiranju visoke razine zbijanja kromatina.

DNA kromatin

U pripravku kromatina, DNA obično čini 30-40%. Ova DNK je dvolančana spiralna molekula, slična čistoj izoliranoj DNK u vodenim otopinama. O tome svjedoče mnogi eksperimentalni podaci. Dakle, kada se otopine kromatina zagrijavaju, uočava se povećanje optičke gustoće otopine, takozvani hiperkromni učinak povezan s kidanjem internukleotidnih vodikovih veza između lanaca DNA, slično onome što se događa kada se čista DNA zagrijava (otapa) .

Pitanje veličine i duljine molekula DNA u kromatinu važno je za razumijevanje strukture kromosoma u cjelini. Koristeći standardne metode izolacije DNA, kromatin ima molekularnu težinu od 7-9 x 10 6, što je znatno manje od molekularne težine DNA iz Escherichie coli (2,8 x 10 9). Ovako relativno niska molekularna masa DNA iz pripravaka kromatina može se objasniti mehaničkim oštećenjem DNA tijekom procesa izolacije kromatina. Ako se DNA izolira u uvjetima koji isključuju mućkanje, homogenizaciju i druge utjecaje, moguće je iz stanica dobiti vrlo dugačke molekule DNA. Duljina molekula DNA iz jezgri i kromosoma eukariotskih stanica može se proučavati metodom svjetlosno-optičke autoradiografije, kao što je to proučavano na prokariotskim stanicama.

Otkriveno je da unutar kromosoma duljina pojedinačnih linearnih (za razliku od prokariotskih kromosoma) molekula DNA može doseći stotine mikrometara, pa čak i nekoliko centimetara. Tako su iz različitih objekata dobivene molekule DNA u rasponu od 0,5 mm do 2 cm. Ovi rezultati su pokazali da postoji blisko slaganje između izračunate duljine DNA po kromosomu i autoradiografskog promatranja.

Nakon blage lize eukariotskih stanica, molekularne težine DNA mogu se izravno odrediti fizikalno-kemijskim metodama. Pokazalo se da je najveća molekularna težina molekule DNA Drosophila 41 x 10 9, što odgovara duljini od oko 2 cm. Kod nekih kvasaca postoji molekula DNA po kromosomu s molekulskom masom od 1 x 10 8 -10 9, koji mjeri oko 0,5 mm.

Tako duga DNK je jedna molekula, a ne nekoliko kraćih, spojenih u jednu datoteku pomoću proteinskih veza, kako su neki istraživači vjerovali. Do ovog zaključka došlo se nakon što se pokazalo da se duljina molekula DNK ne mijenja nakon tretmana lijekovima s proteolitičkim enzimima.

Ukupna količina DNA uključena u jezgrene strukture stanica, u genom organizama, varira od vrste do vrste, iako je u mikroorganizama količina DNA po stanici znatno niža nego u beskralješnjaka, viših biljaka i životinja. Dakle, miš ima gotovo 600 puta više DNK po jezgri od E. coli. Kada se uspoređuje količina DNA po stanici u eukariotskim organizmima, teško je uočiti bilo kakvu korelaciju između stupnja složenosti organizma i količine DNA po jezgri. Tako različiti organizmi kao što su lan, morski jež, grgeč (1,4-1,9 pg) ili galeb i bik (6,4 i 7 pg) imaju približno jednaku količinu DNA.

Postoje značajne fluktuacije u količini DNK u velikim taksonomskim skupinama. Među višim biljkama količina DNA u različitim vrstama može se razlikovati stotinama puta, kao što se među ribama količina DNA u vodozemaca razlikuje nekoliko desetaka puta.

Neki vodozemci imaju 10-30 puta više DNA u jezgri nego u ljudskoj jezgri, iako je genetska konstitucija čovjeka neusporedivo složenija od one žabe. Stoga se može pretpostaviti da "višak" količine DNA u niže organiziranim organizmima ili nije povezan s ispunjavanjem genetske uloge ili se broj gena ponavlja jedan ili drugi broj puta.

Tablica 4. Sadržaj DNA u stanicama nekih objekata (pg, 10 -12 g)

Ispostavilo se da je te probleme moguće riješiti proučavanjem kinetike reakcije renaturacije ili hibridizacije DNA. Ako se fragmentirane molekule DNA u otopinama podvrgnu toplinskoj denaturaciji, a zatim inkubiraju na temperaturi nešto nižoj od one na kojoj dolazi do denaturacije, tada dolazi do obnavljanja izvorne dvolančane strukture fragmenata DNA zbog ponovnog spajanja komplementarnih lanaca – renaturacije. Za DNA viruse i prokariotske stanice pokazalo se da brzina takve renaturacije izravno ovisi o veličini genoma; što je genom veći, to je veća količina DNA po čestici ili stanici, potrebno je više vremena za nasumično približavanje komplementarnih lanaca i specifičnu reasocijaciju većeg broja fragmenata DNA različitih nukleotidnih sekvenci (slika 53). Priroda krivulje reasocijacije DNA prokariotskih stanica ukazuje na odsutnost ponovljenih sekvenci baza u prokariotskom genomu; svi dijelovi njihove DNA nose jedinstvene sekvence, čiji broj i raznolikost odražavaju stupanj složenosti genetskog sastava objekata i, posljedično, njihovu opću biološku organizaciju.

U eukariotskim organizmima opaža se potpuno drugačija slika reasocijacije DNA. Ispostavilo se da njihova DNK sadrži frakcije koje se renaturiraju puno većom brzinom nego što bi se očekivalo na temelju veličine njihovog genoma, kao i frakciju DNK koja se sporo renaturira, poput jedinstvenih sekvenci DNK prokariota. Međutim, eukariotima je potrebno znatno više vremena za renaturaciju ove frakcije, što je povezano s ukupno velikom veličinom njihovog genoma i velikim brojem različitih jedinstvenih gena.

U onom dijelu eukariotske DNA koji je karakteriziran visokom stopom renaturacije, razlikuju se dvije podfrakcije: 1) frakcija s visoko ili često ponavljanim sekvencama, gdje se slični dijelovi DNA mogu ponoviti 10 6 puta; 2) frakcija umjereno ponavljajućih sekvenci koje se pojavljuju 10 2 -10 3 puta u genomu. Tako kod miševa frakcija DNA s često ponavljanim sekvencama uključuje 10% ukupne količine DNA po genomu, a 15% otpada na frakciju s umjereno ponavljanim sekvencama. Preostalih 75% sve mišje DNA predstavljeno je jedinstvenim regijama koje odgovaraju velikom broju različitih gena koji se ne ponavljaju.

Frakcije s često ponavljanim sekvencama mogu imati drugačiju gustoću uzgona od većine DNK i stoga se mogu izolirati u čistom obliku kao tzv. satelitska DNK. Kod miša ova frakcija ima gustoću od 1,691 g/ml, a glavni dio DNA je 1,700 g/ml. Ove razlike u gustoći određene su razlikama u sastavu nukleotida. Na primjer, kod miša postoji 35% parova G i C u ovoj frakciji, a 42% u glavnom piku DNA.

Kako se pokazalo, satelitska DNK, ili frakcija DNK s često ponavljanim sekvencama, nije uključena u sintezu glavnih vrsta RNK u stanici i nije povezana s procesom sinteze proteina. Ovaj zaključak donesen je na temelju činjenice da nijedan tip stanične RNA (tRNA, mRNA, rRNA) ne hibridizira sa satelitskom DNA. Posljedično, ove DNA ne sadrže sekvence odgovorne za sintezu stanične RNA, tj. satelitske DNA nisu uzorci za sintezu RNA i ne sudjeluju u transkripciji.

Postoji hipoteza da vrlo ponavljajuće sekvence koje nisu izravno uključene u sintezu proteina mogu nositi informacije koje igraju važnu strukturnu ulogu u održavanju i funkcioniranju kromosoma. Oni mogu uključivati brojne dijelove DNA povezane s proteinima jezgre interfazne jezgre (vidi dolje), mjesta na početku replikacije ili transkripcije, kao i dijelove DNA koji reguliraju te procese.

Korištenje metode hibridizacije nukleinskih kiselina izravno na kromosomima ( in situ) proučavana je lokalizacija ove frakcije. Da bi se to postiglo, RNA obilježena 3H-uridinom sintetizirana je na izoliranoj satelitskoj DNA pomoću bakterijskih enzima. Zatim je citološki preparat s kromosomima podvrgnut takvoj obradi da dolazi do denaturacije DNA (povišena temperatura, alkalna sredina i sl.). Nakon toga, na preparat je stavljena 3H-označena RNA i postignuta je hibridizacija između DNA i RNA. Autoradiografijom je utvrđeno da je najveći dio oznake lokaliziran u zoni primarnih suženja kromosoma, u zoni njihovih centromernih regija. Oznaka je također otkrivena u drugim regijama kromosoma, ali vrlo slabo (slika 54).

U proteklih 10 godina učinjeni su veliki pomaci u studiranju centromerna DNA, posebno u stanicama kvasca. Tako i učini S. cerevisiae Centromerna DNA sastoji se od ponavljajućih regija od 110 bp. Sastoji se od dvije očuvane regije (I i III) i središnjeg elementa (II), obogaćenog AT parovima baza. Kromosomi Drosophila imaju sličnu strukturu DNA centromere. Ljudska centromerna DNA (alfoidna satelitska DNA) sastoji se od tandema monomera od 170 bp organiziranih u skupine dimera ili pentamera, koji zauzvrat tvore velike sekvence od 1-6 x 103 bp. Ova najveća jedinica se ponavlja 100-1000 puta. Posebni centromerni proteini su u kompleksu s ovom specifičnom centromernom DNA i uključeni su u stvaranje kinetohor, struktura koja osigurava vezu kromosoma s mikrotubulima vretena i u kretanju kromosoma u anafazi (vidi dolje).

Također je pronađena DNK s vrlo ponavljajućim sekvencama telomerne regije kromosomi mnogih eukariotskih organizama (od kvasca do čovjeka). Ovdje se najčešće nalaze ponavljanja koja uključuju 3-4 guanin nukleotida. Kod ljudi telomeri sadrže 500-3000 TTAGGG ponavljanja. Ti dijelovi DNK imaju posebnu ulogu - ograničavaju krajeve kromosoma i sprječavaju njegovo skraćivanje tijekom procesa ponovljene replikacije.

Nedavno je otkriveno da se vrlo repetitivne sekvence DNA interfaznih kromosoma specifično vežu za laminske proteine koji se nalaze ispod jezgrene ovojnice i sudjeluju u usidrenju proširenih dekondenziranih interfaznih kromosoma, određujući tako redoslijed u lokalizaciji kromosoma u volumenu interfazne jezgre.

Pretpostavlja se da bi satelitska DNK mogla biti uključena u prepoznavanje homolognih regija kromosoma tijekom mejoze. Prema drugim pretpostavkama, regije s često ponavljanim sekvencama igraju ulogu separatora (razmaknica) između različitih funkcionalnih jedinica kromosomske DNA, na primjer, između replikona (vidi dolje).

Kako se pokazalo, dio umjereno ponavljajućih (od 10 2 do 10 5 puta) sekvenci pripada šarolikoj klasi regija DNK koje igraju važnu ulogu u procesima stvaranja aparata za sintezu proteina. Ova frakcija uključuje gene ribosomske DNA, koji se mogu ponoviti 100 do 1000 puta u različitim vrstama. Ova frakcija uključuje mnogo puta ponovljene regije za sintezu svih tRNA. Štoviše, neki strukturni geni odgovorni za sintezu određenih proteina također se mogu ponavljati mnogo puta, predstavljeni mnogim kopijama. To su geni za proteine kromatina – histone, koji se ponavljaju i do 400 puta.

Osim toga, ova frakcija uključuje dijelove DNA s različitim sekvencama (100-400 parova nukleotida svaki), koji se također ponavljaju mnogo puta, ali su razbacani po genomu. Njihova uloga još nije potpuno jasna. Pretpostavlja se da takvi dijelovi DNA mogu predstavljati akceptorska ili regulatorna područja različitih gena.

Dakle, DNA eukariotskih stanica je heterogena u sastavu, sadrži nekoliko klasa nukleotidnih sekvenci: često ponovljene sekvence (> 10 6 puta), uključene u satelitsku frakciju DNA i netranskripirane; frakcija umjereno ponavljajućih sekvenci (10 2 -10 5), koje predstavljaju blokove pravih gena, kao i kratke sekvence razasute po genomu; frakcija jedinstvenih sekvenci koje nose informacije za većinu staničnih proteina.

Na temelju ovih ideja, razlike u količini DNA koje se opažaju u različitim organizmima postaju jasne: one mogu biti povezane s nejednakim udjelom određenih klasa DNA u genomu organizama. Tako, na primjer, u vodozemcu Amphiuma(koji ima 20 puta više DNK od ljudi) ponavljajuće sekvence čine do 80% ukupne DNK, u luku - do 70, u lososu - do 60% itd. Pravo bogatstvo genetskih informacija trebalo bi odražavati udio jedinstvenih sekvenci. Ne smijemo zaboraviti da su u prirodnoj, nefragmentiranoj molekuli DNA kromosoma, sve regije koje uključuju jedinstvene, umjereno i često ponavljane sekvence povezane u jedan divovski kovalentni lanac DNA.

Molekule DNA heterogene su ne samo u područjima različitih nukleotidnih sekvenci, već se razlikuju i po svojoj sintetskoj aktivnosti.

Eukariotska replikacija DNA

Bakterijski kromosom replicira se kao jedna strukturna jedinica, koja ima jednu početnu i jednu završnu točku replikacije. Tako je bakterijska kružna DNA jedna replikon. Od početne točke replikacija se odvija u dva suprotna smjera, tako da se sintetiziranjem DNA formira tzv. replikacijsko oko, koje je s obje strane omeđeno replikacijskim rašljama, što je jasno vidljivo tijekom elektronskog mikroskopskog pregleda virusnih i bakterijskih kromosoma koji se repliciraju. .

U eukariotskim stanicama organizacija replikacije je drugačije prirode - polireplikon.Kao što je već spomenuto, pulsirajućim uključivanjem 3 HT pojavljuje se višestruka oznaka u gotovo svim mitotskim kromosomima. To znači da istovremeno postoji mnogo mjesta replikacije i mnogo autonomnih ishodišta replikacije u interfaznom kromosomu. Taj je fenomen detaljnije proučavan autoradiografijom obilježenih molekula izoliranih iz DNA (slika 55.) Ako su stanice pulsno obilježene s 3 HT, tada se u svjetlosnom mikroskopu na autogramima izolirane DNA vide područja reduciranog srebra. u obliku isprekidanih linija. To su mali dijelovi DNK koji su se uspjeli replicirati, a između njih postoje dijelovi nereplicirane DNK koji nisu napustili autoradiograf i stoga ostaju nevidljivi. Kako se vrijeme kontakta 3 NT sa stanicom povećava, veličina takvih segmenata se povećava, a udaljenost između njih se smanjuje. Iz ovih eksperimenata može se točno izračunati brzina replikacije DNA u eukariotskim organizmima. Pokazalo se da je brzina kretanja replikacijske vilice 1-3 kb. u minuti kod sisavaca, oko 1 kb. u minuti kod nekih biljaka, što je puno niže od brzine replikacije DNA u bakterija (50 kb u minuti). U istim pokusima izravno je dokazana polireplikonska struktura DNA eukariotskih kromosoma: po duljini kromosomske DNA, duž nje, postoje mnoga neovisna replikacijska mjesta - replikoni. Prema udaljenosti između srednjih točaka susjednih replikona za označavanje, tj. Na temelju udaljenosti između dvije susjedne početne točke replikacije, može se odrediti veličina pojedinačnih replikona. U prosjeku, veličina replikona viših životinja je oko 30 µm ili 100 kb. Stoga bi u haploidnom skupu sisavaca trebalo biti 20 000-30 000 replikona. Kod nižih eukariota replikoni su manji, oko 40 kb. Tako u Drosophili postoji 3500 replikona po genomu, au kvascu – 400. Kao što je spomenuto, sinteza DNA u replikonu odvija se u dva suprotna smjera. To se lako može dokazati autoradiografijom: ako se stanicama, nakon pulsne oznake, dopusti da nastave sintetizirati DNA neko vrijeme u mediju bez 3 HT, tada će se njezino uključivanje u DNA smanjiti, doći će do razrjeđenja oznake i na Na autoradiografu će biti moguće vidjeti simetrični uzorak na obje strane replicirane regije, smanjujući broj zrnaca reduciranog srebra.

Replicirajući krajevi ili račve u replikonu prestaju se kretati kada se susretnu s račvama susjednih replikona (na terminalnoj točki zajedničkoj susjednim replikonima). U ovoj točki, replicirani dijelovi susjednih replikona kombiniraju se u pojedinačne kovalentne lance dviju novosintetiziranih molekula DNA. Funkcionalna podjela kromosomske DNA na replikone podudara se sa strukturnom podjelom DNA na domene ili petlje, čije su baze, kao što je već spomenuto, spojene proteinskim vezama.

Dakle, sva sinteza DNA na jednom kromosomu događa se kroz neovisnu sintezu na mnogim pojedinačnim replikonima, nakon čega slijedi spajanje krajeva susjednih segmenata DNA. Biološko značenje ovog svojstva postaje jasno kada se usporedi sinteza DNK kod bakterija i eukariota. Tako se bakterijski monoreplikon kromosoma duljine 1600 mikrona sintetizira brzinom od oko pola sata. Kada bi se centimetar dugačka molekula DNA kromosoma sisavaca također replicirala kao monoreplikon struktura, trebalo bi oko tjedan dana (6 dana). Ali ako takav kromosom sadrži nekoliko stotina replikona, tada će njegova potpuna replikacija trajati samo oko sat vremena. Zapravo, vrijeme replikacije DNK kod sisavaca je 6-8 sati. To je zbog činjenice da nisu svi replikoni pojedinog kromosoma uključeni u isto vrijeme.

U nekim slučajevima uočava se istodobno uključivanje svih replikona ili pojava dodatnih ishodišta replikacije, što omogućuje dovršetak sinteze svih kromosoma u minimalno kratkom vremenu. Ovaj se fenomen javlja rano u embriogenezi nekih životinja. Poznato je da prilikom drobljenja jaja žaba s kandžama Xenopus laevis Sinteza DNA traje samo 20 minuta, dok u kulturi somatskih stanica taj proces traje oko jedan dan. Slična se slika opaža u Drosophili: u ranim embrionalnim stadijima cjelokupna sinteza DNA u jezgri traje 3,5 minuta, au stanicama kulture tkiva - 600 minuta. Istovremeno se pokazalo da je veličina replikona u stanicama kulture gotovo 5 puta veća nego u embrijima.

Sinteza DNA odvija se neravnomjerno duž duljine pojedinog kromosoma. Utvrđeno je da se u pojedinom kromosomu aktivni replikoni okupljaju u skupine, replikativne jedinice, koje uključuju 20-80 ishodišta replikacije. To je proizašlo iz analize DNK autograma, gdje je uočeno upravo takvo blokiranje replicirajućih segmenata. Još jedna osnova za ideju o postojanju blokova ili klastera replikona ili replikacijskih jedinica bili su eksperimenti s uključivanjem timidinskog analoga, 5'-bromodeoksiuridina (BrdU), u DNK. Uključivanje BrdU u interfazni kromatin dovodi do činjenice da se tijekom mitoze područja s BrdU kondenziraju u manjoj mjeri (nedovoljna kondenzacija) od onih područja u kojima je bio uključen timidin. Stoga će one regije mitotskih kromosoma u koje je uključen BrdU biti slabo obojene tijekom diferencijalnog bojenja. To omogućuje određivanje slijeda ugradnje BrdU korištenjem sinkroniziranih staničnih kultura, tj. slijed sinteze DNA duž duljine jednog kromosoma. Ispostavilo se da dolazi do uključivanja prekursora u velike dijelove kromosoma. Uključivanje različitih odjeljaka događa se strogo sekvencijalno tijekom S-razdoblja. Svaki kromosom karakterizira visoka stabilnost reda replikacije duž njegove duljine i ima svoj specifičan obrazac replikacije.

Klasteri replikona, spojeni u replikacijske jedinice, povezani su s proteinima nuklearnog matriksa (vidi dolje), koji zajedno s replikacijskim enzimima tvore tzv. klasterosomi su zone u interfaznoj jezgri u kojima se odvija sinteza DNA.

Redoslijed kojim se replikacijske jedinice aktiviraju vjerojatno je određen strukturom kromatina u tim regijama. Na primjer, zone konstitutivnog heterokromatina (blizu centromera) obično se repliciraju na kraju S-periode; također, na kraju S-periode, dio fakultativnog heterokromatina se udvostručuje (na primjer, X kromosom žene sisavci). Redoslijed replikacije kromosomskih odjeljaka posebno je jasno vremenski povezan s uzorkom diferencijalnog bojanja kromosoma: R-segmenti pripadaju segmentima rane replikacije, G-segmenti odgovaraju kromosomskim dijelovima s kasnom replikacijom. C-segmenti (centromere) su mjesta najnovije replikacije.

Budući da su u različitim kromosomima veličina i broj različitih skupina različito obojenih segmenata različiti, to stvara sliku asinkronog početka i kraja replikacije različitih kromosoma u cjelini. U svakom slučaju, redoslijed početka i kraja replikacije pojedinih kromosoma u skupu nije slučajan. Postoji strogi slijed reprodukcije kromosoma u odnosu na druge kromosome u skupu.

Trajanje procesa replikacije pojedinih kromosoma ne ovisi izravno o njihovoj veličini. Tako su veliki ljudski kromosomi skupine A (1-3) obilježeni tijekom cijele S-periode, kao i kraći kromosomi skupine B (4-5).

Dakle, sinteza DNA u eukariotskom genomu počinje gotovo istodobno na svim kromosomima jezgre na početku S-periode. Ali u isto vrijeme, sekvencijalno i asinkrono uključivanje različitih replikona događa se iu različitim dijelovima kromosoma iu različitim kromosomima. Slijed replikacije pojedine regije genoma je strogo genetski određen. Ovu posljednju tvrdnju dokazuje ne samo obrazac uključivanja oznake u različite segmente S-periode, već i činjenica da postoji strogi slijed pojavljivanja vrhova u osjetljivosti određenih gena na mutagene tijekom S-periode. -razdoblje.

1. Vrste kromatina

2. Geni, razmaknice

3. Redoslijed nukleotida u DNA

4. Prostorna organizacija DNK

1. Tijekom odmora između dioba, određeni dijelovi kromosoma i cijeli kromosomi ostaju kompaktni. Ta područja kromatina nazivaju se heterokromatin. Dobro slika.

Nakon jezgrene diobe kromatin se olabavi i u tom se obliku tzv eukromatin. Heterokromatin je neaktivan u odnosu na transkripciju, au odnosu na replikaciju DNA ponaša se drugačije od eukromatina.

Fakultativni heterokromatin heterokromatski je samo ponekad. Informativan je, tj. sadrži gene. Kada uđe u eukromatsko stanje, ti geni mogu postati dostupni za transkripciju. Od dva homologna kromosoma, jedan može biti heterokromatski. Ova fakultativna heterokromatizacija je tkivno specifična i ne događa se u određenim tkivima.

Konstitutivni heterokromatin uvijek heterokromatski. Sastoji se od opetovano ponavljanih nizova baza, neinformativan je (ne sadrži gene) i stoga je uvijek neaktivan u odnosu na transkripciju. Možete ga vidjeti I tijekom nuklearne fisije. On izlazi:

Najčešće na centromeri;

Na krajevima kromosoma (uključujući satelite);

U blizini organizatora jezgrice;

Blizu gena 5S-RNA.

Heterokromatin, prvenstveno fakultativni, tijekom interfaze može se sjediniti u intenzivno obojeni kromocentar, koji se u većini slučajeva nalazi na rubu stanične jezgre ili jezgrice.

2. Svaki kromosom je kontinuirana dvostruka spirala DNK, koji se kod viših organizama sastoji od više od 10 8 parova baza. U kromosomima viših biljaka i životinja svaka dvostruka spirala DNA (promjera 2 nm) ima duljinu od jednog do nekoliko centimetara. Kao rezultat ponovljenog uvijanja, pakira se u kromatidu dugu nekoliko mikrometara.

Geni su linearno raspoređeni duž ove dvostruke spirale, koji zajedno čine do 25% DNK.

Genje funkcionalna jedinica DNK, koji sadrži informacije za sintezu polipeptida ili RNA. Prosječna duljina gena je oko 1000 parova baza. Redoslijed baza u svakom genu je jedinstven.

Između gena su odstojnici- neinformativni nizovi DNA različitih duljina (ponekad više od 20 000 parova baza), koji su važni za regulaciju transkripcije susjednog gena.

Transkribirani razmaknici završavaju tijekom transkripcije zajedno s genom, a njihove komplementarne kopije pojavljuju se u pre-i-RNA s obje strane kopije gena. I unutar samog gena postoje (samo kod eukariota i njihovih virusa) neinformativni nizovi, tzv. introni, koji se također prepisuju. Tijekom obrade, enzimi izrezuju sve kopije introna i većinu kopija razmaknica.

Razmaknice koje se ne mogu prepisati javljaju između gena za histone, kao i između gena za rRNA.

Suvišni geni predstavljeni su velikim brojem (do 10 4 ili više) identičnih kopija. Ovo su geni:

Za tRNA;

5S-RNA i histoni;

Za proizvode sintetizirane u velikim količinama.

Kopije se nalaze neposredno jedna do druge i razriješene su identičnim odstojnicima. Kod morskog ježa geni za histone H4, H2b, H2a i Hi leže jedan za drugim, a taj se slijed gena ponavlja u DNK više od 100 puta.

3. Sekvence koje se ponavljaju - To su sekvence nukleotida prisutnih više puta u DNK. Umjereno se ponavlja sekvence - sekvence prosječne duljine 300 parova baza s 10 2 -10 4 ponavljanja. To uključuje redundantne gene, kao i većinu razmaknica.

Jako se ponavlja sekvence s 10 5 -10 6 ponavljanja čine konstitutivni heterokromatin. Oni uvijek neinformativno. To su uglavnom kratke sekvence, najčešće se u njima nalazi 7-10 i samo rijetko - samo 2 (na primjer, AT) ili, obrnuto, preko 300 parova nukleotida. Skupljaju se zajedno, s jednom ponavljajućom sekvencom odmah iza druge. Vrlo repetitivne kromatinske DNK nazivaju se "satelitske DNK" zbog njihovog ponašanja tijekom analitičkih postupaka frakcioniranja. Oko 75% cjelokupnog kromatina nije uključeno u transkripciju: to su sekvence koje se jako ponavljaju i razmaknice koje se ne mogu transkriptirati.

4. U izoliranom kromatinu dijelovi dvostruke spirale DNA omotavaju se oko molekula histona, tako da se ovdje pojavljuje superheliks prvog reda. Kompleksi DNA s histonom nazivaju se nukleozomi. Imaju oblik diska ili leće, a dimenzije su oko 10 x 10 x 5 nm. Jedan nukleosom uključeno:

8 molekula histoni:

Središnji tetramer od dvije molekule H3 i dvije H4; i odvojeno dva H2a i H2b;

Dio DNK (oko 140 parova baza) koji tvori približno 1,25 zavoja spirale i čvrsto je vezan za središnji tetramer.

Između nukleosoma nalaze se dijelovi spirale od 30-100 parova baza bez superhelikalne strukture; Histon se veže ovdje Bok

U spojenom kromatinu DNK se dalje skraćuje slabo poznatim daljnjim namotavanjem (superzavoj višeg reda) koji je očito fiksiran histonom Hi (i nekim nehistonskim proteinima). Tijekom prijelaza u interfazu, eukromatin se olabavi dok se neki od superzavoja višeg reda odmotaju. To se vjerojatno događa kao posljedica konformacijskih promjena u histonima i slabljenja interakcija između Hi molekula.Kromatinske strukture debljine 10-25 nm (glavne kromatinske niti ili spirale) također su vidljive tijekom interfaze.

1. Vrste kromatina

2. Geni, razmaknice

3. Redoslijed nukleotida u DNA

4. Prostorna organizacija DNK

1. Tijekom odmora između dioba, određeni dijelovi kromosoma i cijeli kromosomi ostaju kompaktni. Ta područja kromatina nazivaju se heterokromatin. Dobro slika.

Najčešće na centromeri;

Na krajevima kromosoma (uključujući satelite);

U blizini organizatora jezgrice;

Blizu gena 5S-RNA.

Heterokromatin, prvenstveno fakultativni, tijekom interfaze može se sjediniti u intenzivno obojeni kromocentar, koji se u većini slučajeva nalazi na rubu stanične jezgre ili jezgrice.

Geni su linearno raspoređeni duž ove dvostruke spirale, koji zajedno čine do 25% DNK.

Genje funkcionalna jedinica DNK, koji sadrži informacije za sintezu polipeptida ili RNA. Prosječna duljina gena je oko 1000 parova baza. Redoslijed baza u svakom genu je jedinstven.

Između gena su odstojnici- neinformativni nizovi DNA različitih duljina (ponekad više od 20 000 parova baza), koji su važni za regulaciju transkripcije susjednog gena.

Razmaknice koje se ne mogu prepisati javljaju između gena za histone, kao i između gena za rRNA.

Suvišni geni predstavljeni su velikim brojem (do 10 4 ili više) identičnih kopija. Ovo su geni:

Za tRNA;

5S-RNA i histoni;

Za proizvode sintetizirane u velikim količinama.

8 molekula histoni:

Središnji tetramer od dvije molekule H3 i dvije H4; i odvojeno dva H2a i H2b;

Dio DNK (oko 140 parova baza) koji tvori približno 1,25 zavoja spirale i čvrsto je vezan za središnji tetramer.

Između nukleosoma nalaze se dijelovi spirale od 30-100 parova baza bez superhelikalne strukture; Histon se veže ovdje Bok

Transkripcijski aktivan kromatin – geni koji sintezom prenose svoje informacije RNA, uslijed daljnje despiralizacije još više olabavi. Prema nekim podacima, u odgovarajućim dijelovima spirale DNA, histon Hi je ili odsutan ili je kemijski promijenjen, na primjer, fosforiliran.

Struktura nukleosoma također mijenja ili je potpuno uništen (u genima za r-RNA u jezgrici). Dvostruka spirala se odmotava na određenim mjestima. Ovi procesi očito uključuju određene nehistonske proteine koji se nakupljaju u transkribiranim regijama DNA.

Pitanje 38. Skup kromosoma

/. Genom. Ploidnost stanica

2. Politenski kromosomi

1. Cjelokupni fond genetskih informacija svake stanične jezgre - genom- raspoređeni između određenog konstantnog broja kromosoma (n). Ovaj broj je specifičan za svaku vrstu ili podvrstu. Kod konjskih valjkastih crva je 1, kod kukuruza - 10, kod ljudi - 23, kod algi Netrium digitus - oko 600. Kromosomi istog skupa su različiti prema sljedećim kriterijima:

veličina;

Slika kromometra;

Položaj suženja;

Ovisno o višestrukost kromosomske garniture - ploidnost- stanice se dijele:

Do haploidnog;

Diploid;

Poliploidna.

Haploidan nazivaju se stanice koje sadrže jedan set kromosoma (“), na primjer, spolne stanice.

Ako stanice sadrže dvostruki set kromosoma (2 P), oni diploidan, budući da su genetske informacije u njima predstavljene dvostruko. Gotovo sve somatske stanice viših biljaka i životinja su diploidne. Sadrže jedan očevi i jedan majčin set kromosoma.

U poliploidan stanice imaju nekoliko setova kromosoma (4 P, 8 P, 16 P, itd.). Te su stanice često posebno metabolički aktivne, poput mnogih stanica jetre u sisavaca.

Haploidne stanice nastaju iz diploidnih stanica kao rezultat mejoze, a diploidne stanice nastaju iz haploidnih stanica kao rezultat oplodnje.

Poliploidne stanice nastaju iz diploidnih endomitozom - prerano prekinutom diobom jezgre: nakon potpune replikacije i odvajanja kromatida, kromosomi kćeri ostaju u jednoj staničnoj jezgri, umjesto da budu raspoređeni između dvije jezgre. Ovaj proces se može ponoviti mnogo puta.

Anomalije tijekom stvaranja spolnih stanica može dovesti do poliploidije cijelog organizma. Na nepotpuna replikacija Neki dijelovi genoma, poput heterokromatina, ne repliciraju se i ostaju diploidni nakon endomitoze, za razliku od drugih dijelova koji postaju poliploidni.

Pojačanje gena - ovo je višestruka superreplikacija kada se samo određeni geni repliciraju i postanu poliploidni (geni za rRNA u jezgrici).

Kromosomi diploidna jezgra mogu se grupirati u parove, dva homologna kromosoma. Većina njih (tzv autosomi) u paru identični. Samo dva spolna kromosoma koja određuju spol jedinke nisu ista kod muškaraca - to su X i Y kromosomi (heterokromosomi). Većina Y kromosoma zauzima konstitutivni heterokromatin. Žene imaju dva X kromosoma. Međutim, kod leptira, ptica i niza drugih životinja situacija je obrnuta: mužjaci imaju set XX, ženke imaju set XY.

2. Politenski kromosomi(divovski kromosomi) sadrže višestruko više DNK od normalnih. Ne mijenjaju svoj oblik tijekom cijelog ciklusa diobe i dosežu duljinu do 0,5 mm i debljinu od 25 mikrona. Nalaze se, primjerice, u žlijezdama slinovnicama dvokrilaca (muha i komaraca), u makronukleusu trepavica i u tkivu jajnika graha. Najčešće su vidljivi u haploidnom broju, jer su homologni kromosomi usko spareni. Politenija nastaje kao rezultat endoreplikacije. U usporedbi s endomitozom, ovo je još reduciraniji proces diobe - nakon replikacije kromatide se ne razdvajaju (proces se ponavlja više puta). pri čemu različiti dijelovi DNK se umnožavaju u različitim stupnjevima:

Područja centromere - beznačajna;

Većina informativnih područja je približno 1000 puta;

Neki - više od 30.000 puta.

Zato politene kromosome Oni su snopovi bezbrojnih kromatida koje nisu potpuno odvojene. Kromatide su rastegnute, homologne kromomere tvore tamne diskove usko smještene duž kromosoma. Ovi diskovi su odvojeni svjetlijim prugama. Vjerojatno, na kromatidi, jedan disk i jedna srednja pruga tvore, osim razmaknice, jedan gen (rjeđe nekoliko gena), koji se, očito, nalazi u disku. Politenski kromosomi izrazito su siromašni heterokromatinom.

Na politenim kromosomima odvojeni diskovi ponekad nabubri u pufovi(Balbiani prstenje). Tamo se homologne kromatide odvajaju jedna od druge, homologne kromomere se razmiču i pojavljuje se labava struktura transkripcijski aktivnog kromatina. Pufovi sadrže manje histona Hi od diskova i umjesto toga sadrže enzim RNA polimerazu (koji ukazuje na sintezu RNA). Postoji također malo histona Hi u srednjim vrpcama, ali postoji RNA polimeraza i, moguće, dolazi do barem manje sinteze RNA.

U pripravku kromatina, DNA obično čini 30-40%. Ova DNK je dvolančana spiralna molekula. DNK kromatina ima molekularnu težinu od 7-9*10 6 . Ovako relativno mala masa DNA iz preparata može se objasniti mehaničkim oštećenjem DNA tijekom procesa izolacije kromatina.

Ukupna količina DNA uključena u nuklearne strukture stanica, u genom organizama, varira od vrste do vrste. Kada se uspoređuje količina DNA po stanici u eukariotskim organizmima, teško je uočiti bilo kakvu korelaciju između stupnja složenosti organizma i količine DNA po jezgri. Različiti organizmi, poput lana, morskog ježa, grgeča (1,4-1,9 pg) ili galeba i bika (6,4 i 7 pg), imaju približno jednaku količinu DNA.

Neki vodozemci imaju 10-30 puta više DNA u jezgri nego u ljudskoj jezgri, iako je genetska konstitucija čovjeka neusporedivo složenija od one žabe. Posljedično, može se pretpostaviti da "višak" količine DNA u niže organiziranim organizmima ili nije povezan s ispunjavanjem genetske uloge ili se broj gena ponavlja jedan ili drugi broj puta.

Satelitska DNA, ili dio DNA s često ponavljanim sekvencama, može biti uključena u prepoznavanje homolognih regija kromosoma tijekom mejoze. Prema drugim pretpostavkama, ove regije imaju ulogu separatora (razmaknica) između različitih funkcionalnih jedinica kromosomske DNA.

Kako se pokazalo, udio umjereno ponavljajućih (od 10 2 do 10 5 puta) sekvenci pripada raznolikoj klasi DNA regija koje igraju važnu ulogu u metaboličkim procesima. Ova frakcija uključuje gene ribosomske DNA, opetovano ponavljane dijelove za sintezu svih tRNA. Štoviše, neki strukturni geni odgovorni za sintezu određenih proteina također se mogu višestruko ponavljati, predstavljeni mnogim kopijama (geni za proteine kromatina - histone).

Dakle, DNA eukariotskih stanica je heterogena u sastavu i sadrži nekoliko klasa nukleotidnih sekvenci:

često ponavljane sekvence (>10 6 puta), uključene u satelitsku frakciju DNA i netranskripirane;

frakcija umjereno ponavljajućih sekvenci (10 2 -10 5), koje predstavljaju blokove pravih gena, kao i kratke sekvence razasute po genomu;

frakcija jedinstvenih sekvenci koje nose informacije za većinu staničnih proteina.

DNK prokariotskog organizma jedna je gigantska ciklička molekula. DNA eukariotskih kromosoma linearne su molekule koje se sastoje od replikona različitih veličina poredanih u tandemu (jedan za drugim). Prosječna veličina replikona je oko 30 mikrona. Dakle, ljudski genom trebao bi sadržavati više od 50.000 replikona, dijelova DNK koji se sintetiziraju kao neovisne jedinice. Ovi replikoni imaju početnu i krajnju točku za sintezu DNA.

Zamislimo da je u eukariotskim stanicama svaki kromosomski DNK, kao kod bakterija, jedan replikon. U tom slučaju, pri brzini sinteze od 0,5 mikrona u minuti (za čovjeka), reduplikacija prvog kromosoma s duljinom DNK od oko 7 cm trebala bi trajati 140 000 minuta, odnosno oko tri mjeseca. Zapravo, zbog polireplikonske strukture DNA molekula, cijeli proces traje 7-12 sati.

Uklanjanje histona H1 iz transkripcijski aktivnog kromatina 1*2* . Rani pokusi J. Bonnera (SAD) pokazali su da je DNA u kromatinu puno lošija matrica od slobodne DNA. Na temelju ovih opažanja, predloženo je da su histoni transkripcijski represori.

L. N. Ananyeva i Yu. V. Kozlov Naš je laboratorij krenuo u istraživanje imaju li svi histoni inhibitorni učinak ili samo neki od njih. Da bi se to postiglo, histoni su uklonjeni iz kromatina mišjih Ehrlichovih ascitnih stanica raka ekstrakcijom s otopinama NaCl uz postupno rastuće koncentracije. Dobiveni pripravci poslužili su kao predložak za sintezu RNA. Transkripcija je provedena u prisutnosti RNA polimeraze iz Escherichia coli, E. coli, koja je uzeta u suvišku, i mješavine nukleozid trifosfata. U rasponu od 0,4-0,6 M NaCl dolazi do oštre dekondenzacije materijala, koja se očituje u bubrenju jezgrinog gela, pa čak i otapanju DNP-a (ako je provedena daljnja mehanička obrada). Pokazalo se da ovo selektivno uklanja histon HI. Istodobno s dekondenzacijom kromatina, došlo je do naglog povećanja njegove matrične aktivnosti (slika 26). Daljnji porast koncentracije soli u ekstrakcijskoj otopini doveo je do uklanjanja drugih histona i blagog, ali ne jako izraženog dodatnog povećanja aktivnosti matriksa.

0 t. Dakle, sposobnost hibridizacije otkriva postotak ponavljajućih sekvenci u sintetiziranoj RNA (prema rezultatima koje su dobili L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov i autor); b - glavni parametri sinteze RNA na različitim matricama: slobodna DNA, izvorni kromatin (DNP 0) i kromatin iz kojeg je ekstrakcijom s 0,6 M NaCl (DNP 0,6) uklonjen histon H1. Sinteza RNA provedena je pomoću RNA polimeraze bakterije Escherichia coli u prisutnosti obilježenih nukleozid trifosfata: [ 14 C]-ATP i [γ- 32 P]-ATP ili [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP je bio uključen u cijelu RNA, a [γ- 32 P] - samo na početku lanca (pp x A- ili pp x G). Drugim riječima, uključivanje [ 32 P] dalo je informacije o početku sinteze, a [ 14 C] - o samoj sintezi RNA. U nekim pokusima 3-4 minute nakon početka inkubacije u medij je dodan rifampicin, antibiotik, koji je spriječio inicijaciju novih lanaca RNA, ali nije utjecao na već započetu sintezu, odnosno produljenje. 1 - uključivanje [14 C] - UMP, 2 - isto nakon dodavanja rifampicina; 3 - uključivanje [γ-32 P]-ATP + GTP; 4 - isto nakon dodavanja rifampicina. Na temelju ovih inkluzijskih krivulja moguće je izračunati glavne parametre reakcije RNA polimeraze (na temelju rezultata dobivenih od strane Yu. V. Kozlova i autora)">
Riža. 26. Utjecaj histona H1 na templatsku aktivnost DNA u kromatinu. a - učinak uklanjanja proteina iz kromatina (1) na aktivnost matrice (2) potonjeg u prisutnosti egzogene RNA polimeraze Escherichia coli, kao i na sposobnost hibridizacije sintetizirane RNA (3). Histoni i nehistonski proteini ekstrahirani su rastućim koncentracijama otopina NaCl. U rasponu od 0,4 M NaCl - 0,6 M NaCl, histon H1 je selektivno uklonjen. Sintetizirana RNA je hibridizirana s viškom DNA pri srednjim vrijednostima CO t. Dakle, sposobnost hibridizacije otkriva postotak ponavljajućih sekvenci u sintetiziranoj RNA (prema rezultatima koje su dobili L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov i autor); b - glavni parametri sinteze RNA na različitim matricama: slobodna DNA, izvorni kromatin (DNP 0) i kromatin iz kojeg je ekstrakcijom s 0,6 M NaCl (DNP 0,6) uklonjen histon H1. Sinteza RNA provedena je korištenjem RNA polimeraze bakterije Escherichia coli u prisutnosti obilježenih nukleozid trifosfata: [ 14 C]-UTP i [γ- 32 P]-ATP ili [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP je bio uključen u cijelu RNA, a [γ- 32 P] - samo na početku lanca (pp x A- ili pp x G). Drugim riječima, uključivanje [ 32 P] dalo je informacije o početku sinteze, a [ 14 C] - o samoj sintezi RNA. U nekim pokusima 3-4 minute nakon početka inkubacije u medij je dodan rifampicin, antibiotik, koji je spriječio inicijaciju novih lanaca RNA, ali nije utjecao na već započetu sintezu, odnosno produljenje. 1 - uključivanje [14 C] - UMP, 2 - isto nakon dodavanja rifampicina; 3 - uključivanje [γ-32 P]-ATP + GTP; 4 - isto nakon dodavanja rifampicina. Na temelju ovih inkluzijskih krivulja mogu se izračunati glavni parametri reakcije RNA polimeraze (na temelju rezultata dobivenih od strane Yu. V. Kozlova i autora)

Svojstva sintetiziranog in vitro RNA hibridizacijom s ukupnom mišjom DNA. U ovom slučaju, otkriven je dio RNA sintetiziran na ponavljajućim sekvencama DNA. Pokazalo se da je u kromatinu transkripcija ponovljenih sekvenci DNA ograničena. Međutim, nakon ekstrakcije kromatina s 0,6 M NaCl, kada je histon H1 uklonjen, svojstva hibridizacije RNA sintetizirane na matrici takvog kromatina i na matrici slobodne DNA postala su nerazlučiva. Pretpostavili smo da histoni H2a, H2b, H3 i H4 (tada drugačije nazvani - histoni bogati umjereno lizinom i argininom) nisu uključeni u supresiju transkripcije, već igraju čisto strukturnu ulogu u organizaciji kromatina, dok histon H1 (u starom terminologija histon , bogat lizinom) je inhibitor sinteze RNK. U isto vrijeme, to je i faktor koji uzrokuje kondenzaciju kromatina (vidi gore).

Kasnije je Yu.V.Kozlov proučavao mehanizam inhibicije transkripcije histonom H1, opet na sustavu bez stanica s RNA polimerazom izoliranom iz E, coli. Proučavao se učinak histona H1 na procese inicijacije i elongacije (vidi sliku 26, tablica 4). Pokazalo se da nekoliko puta smanjuje broj RNA lanaca iniciranih na nativnoj kromatinskoj matrici. Elongacija je posebno oštro inhibirana: RNA polimeraza ne čita više od 100-150 bp. DNK i onda prestaje. U međuvremenu, na kromatinu s kojeg je uklonjen histon H1, RNA polimeraza istovremeno čita nekoliko tisuća parova nukleotida, a duljina lanaca ne razlikuje se od duljine lanaca sintetiziranih na slobodnoj DNA šabloni. Istina, na slobodnoj DNA, u usporedbi s kromatinom iz kojeg je uklonjen histon H1, procesi inicijacije sinteze RNA odvijaju se učinkovitije. Zaključeno je da histon H1 kondenzacijom kromatina stvara prepreke na putu RNA polimeraze i time zaustavlja sintezu RNA.

* (DNPM je DNP izoliran tretmanom ureom koji je potpuno otopljen, ali zadržava histon H1.)

U svjetlu modernih podataka o solenoidnoj strukturi fibrila 300 A-DNP, koja ovisi o prisutnosti histona H1, ovaj se rezultat lako objašnjava. Doista, RNA polimeraza očito ne može očitati više od 100 bp u solenoidu. zbog čisto topoloških ograničenja.

Prema našoj hipotezi, kada je gen aktiviran, histon H1 bi trebao biti uklonjen. Međutim, to tada nije bilo moguće provjeriti. Tek relativno nedavno su se pojavili dokazi o gubitku histona H1 iz kromatina tijekom aktivacije gena. Stoga, kada su aktivno transkribirane regije kromatina, na primjer mini-nukleoli, izolirane iz niza organizama, histon H1 nije otkriven u njima. Nema ga ni u kvascu, gdje su svi geni potencijalno aktivni.

U laboratoriju su dobiveni uvjerljivi rezultati A. D. Mirzabekova V. L. Karpov i O. V. Preobrazhenskaya. Razvili su metodu nazvanu "hibridizacija sjene histona". Da bi se to postiglo, DNK je umrežena s histonima pomoću dimetil sulfata pod uvjetima u kojima je, u prosjeku, jedna molekula histona umrežena po segmentu DNK dužine oko 200-300 bp. DNK je zatim fragmentirana i izvedena je dvodimenzionalna elektroforeza na natrijevom dodecil sulfatu i poliakrilamidnom gelu. Nakon trčanja u prvom smjeru, histoni vezani za DNA su uništeni proteinazom, a već slobodna DNA je ubrzana u drugom smjeru. Budući da su tijekom prve runde elektroforeze različiti histoni na različite načine usporavali kretanje fragmenata DNA, nakon druge runde otkriveno je nekoliko dijagonala (slika 27). Obično su tri jasno vidljiva: jedan odgovara početno slobodnoj DNA, drugi izvornim DNA kompleksima s histonima jezgre, a treći (donji) izvornom DNA kompleksu s histonom H1. Dobivena DNA se prenosi u filter i hibridizira s određenim uzorkom. Ako je za hibridizaciju uzeto neaktivno područje genoma, na primjer, razmaknica ribosomalnog gena Drosophila, tada je oznaka povezana sa svim dijagonalama. Međutim, ako je kao uzorak korišten gen toplinskog šoka, koji je prepisan u stanicama iz kojih je izoliran kromatin, tada je hibridizacija s dijagonalom koja odgovara kompleksima DNA s histonom H1 bila oštro oslabljena ili potpuno odsutna. Drugim riječima, u jezgri, prije vezanja, DNA transkribiranog gena nije imala kontakt s histonom H1.

Riža. 27. Gubitak histona H1 i histona jezgre nakon aktivacije transkripcije. Pokusi su provedeni na stanicama kulture D. melanogaster (a, b) u uvjetima uzgoja na 25° (a) i toplinskom šoku (b). U slučaju a, nema ekspresije gena toplinskog šoka, u slučaju b, on je vrlo aktivan. Osim toga, eksperimenti su provedeni na dehorioniziranim embrijima (c), kod kojih je ekspresija gena toplinskog šoka na prosječnoj razini. Nakon formiranja kompleksa DNA-protein, izolacije fragmenata DNA, njihovog dvodimenzionalnog odvajanja (u okomitom smjeru nakon uklanjanja proteina) i prijenosa na filtar, isti su filtri hibridizirani s različitim uzorcima: s regulatornom regijom p70 gen toplinskog šoka (HS-5") ; s kodirajućom regijom istog gena (TS-kod); s uzorkom transkripcijski neaktivne insercije u rDNA gen (neaktivan). U neaktivnom genu vidljive su tri dijagonale ; 1 - slobodna DNA, 2 - DNA kompleksi s oktamernim histonima 3 - DNA kompleksi s histonom H1. Vidljivo je slabljenje ili nestanak DNA-histonskih kompleksa nakon aktivacije kromatina (prema rezultatima A. D. Mirzabekova i sur.)

Iako svi trenutno dostupni podaci, uzeti pojedinačno, dopuštaju drugačija tumačenja, uzeti zajedno daju snažne dokaze u prilog uklanjanja histona H1 iz aktivnog kromatina. Međutim, mehanizam ovog procesa još uvijek je potpuno nejasan.

Sudbina nukleosoma tijekom aktivacije kromatina 2* [154-157]. Manje je jasno pitanje sudbine histona H2a, H2b, H3 i H4, koji čine jezgru nukleosoma. U navedenim pokusima Yu. V. Kozlova njihova prisutnost praktički nije utjecala na transkripciju DNA pomoću RNA polimeraze iz E coli. Proučavajući produkte hidrolize eukariotskog kromatina, mnogi su autori otkrili da nukleosomi sadrže DNA aktivnih gena, tj. potonji su također organizirani u nukleosome. Podaci dobiveni iz velikog eksperimentalnog materijala A. D. Mirzabekova et al. pokazuju da su nukleosomi koji sadrže aktivno transkribiranu DNA temeljno izgrađeni na isti način kao i nukleosomi koji sadrže neaktivnu DNA, iako su neki kontakti DNA-histona u njima promijenjeni.

Eksperimenti su također provedeni na hibridizaciji s histonskim sjenama, o čemu je bilo riječi u prethodnom odjeljku (vidi sliku 27). Preparati s dijagonalama pripremljeni su iz stanica Drosophile u kojima geni toplinskog šoka ili uopće nisu radili, odnosno bili su isključeni, ili su radili na niskoj razini, ili su, konačno, toplinskim šokom potaknuti na aktivnu transkripciju. U svim slučajevima kontrolni uzorak bila je DNA ribosomskog genskog razmaknice, koja je hibridizirana u sve tri dijagonale, uključujući i dijagonalu izvedenu iz DNA kompleksa s jezgrom histona.

Gen toplinskog šoka također se normalno hibridizirao s ovom dijagonalom iz stanica u kojima nije bio transkribiran. Međutim, s materijalom dobivenim iz stanica s umjerenom transkripcijom gena toplinskog šoka, hibridizacija druge dijagonale značajno je smanjena. Konačno, ako su dijagonale dobivene iz stanica s vrlo aktivnom sintezom mRNA toplinskog šoka, tada druga dijagonala uopće nije bila vidljiva tijekom hibridizacije (kao i treća), a otkrivena je samo dijagonala koja odgovara DNK koja nije umrežena s histonima.Opći zaključak izvučen iz studija koje su koristile metodu unakrsnog povezivanja DNA-proteina bio je da tijekom transkripcije, RNA polimeraza koja se kreće duž lanca DNA reverzibilno sudara nukleosome s DNA i prepisuje gotovo golu DNA. Ako je razina transkripcije niska i malo je RNK polimeraza koje puze duž DNK, tada nukleosomi imaju vremena da se ponovno formiraju u području kroz koje je RNK polimeraza već prošla. Ako je transkripcija aktivna, tada se nukleosomska struktura DNA nema vremena obnoviti, a DNA je općenito lišena histona. Istodobno se pretpostavlja da se organizacija nukleosoma u aktivnom kromatinu praktički ne razlikuje od one u neaktivnom kromatinu. Nedavno su A.D. Mirzabekov i sur. reproducirali su pokuse vezanja histona na DNA drukčijom metodom, tretiranjem izoliranih jezgri s pripravcima platine. Ova metoda je blaža od dimetilsulfata. Dobiveni su u osnovi isti rezultati.

Uz taj korpus podataka postoje istraživanja u kojima autori dolaze do nešto drugačijih zaključaka. W. Garrard i A. Worsel(SAD), proučavajući stanje aktivnih gena u kromatinu pomoću nukleazne hidrolize i elektronske mikroskopije, došli su do zaključka da nukleosomi ostaju u aktivnom kromatinu, ali prolaze kroz strukturne promjene kao što su okretanje, pretvaranje u polunukleosome. Kao rezultat toga, periodičnost u elektroferogramima hidrolizata s mikrokoknom nukleazom je ~200 bp. zamijenjen periodičnošću od ~100 bp. Elektronskom mikroskopijom broj kuglica se udvostručuje, a njihova veličina smanjuje. Pretpostavlja se da RNA polimeraza može proći kroz takve razmotane nukleosome.

Ovu mogućnost podupiru i dobiveni podaci T. Koller(Švicarska). Razvio je originalnu metodu proučavanja nukleosoma. Stanice se tretiraju psoralenom, supstancom koja se veže na DNK i potom umreži dva lanca DNK UV svjetlom. Međutim, ako je DNA dio nukleosoma, ne dolazi do reakcije s psoralenom. Stoga, ako je DNA izolirana iz tretiranih stanica denaturirana u prisutnosti formaldehida (sprječava renaturaciju DNA), tada se nakon elektronske mikroskopije mogu pojaviti izmjenični mjehurići (dva lanca denaturirane DNA) koji odgovaraju nukleosomima koji su međusobno povezani jednostrukim lancima (križnim -vezani, nesposobni za denaturaciju) vidljivi su na DNA.DNA) koji odgovaraju internukleosomskim poveznicima. Prvo su proučavani aktivno transkribirani geni ribosomske RNA, koji su dio ekstrakromosomskih struktura i stoga se lako analiziraju elektronskom mikroskopijom. U njima se ne vide vezikule koje odgovaraju nukleosomima, tj. po svoj prilici histoni su potpuno uklonjeni iz transkribiranih regija. Zanimljivo je da su u netranskribiranim regijama razmaknice, DNA mjehurići (nukleosomi) jasno vidljivi.

Međutim, različiti su rezultati dobiveni na minikromosomima SV40, koje prepisuje RNA polimeraza II, a ne RNA polimeraza I, poput gena ribosomske RNA (Slika 28). Transkripcijski aktivni mini-kromosomi identificiraju se zbog prisutnosti rastućih RNA lanaca (obično jednog ili dva) na njima. Takvi mini-kromosomi čine 1-2% svih mini-kromosoma izoliranih iz stanice. Oni, međutim, sadrže isti broj vezikula kao i neaktivni minikromosomi, a njihove su veličine iste u oba slučaja. Najzanimljivije je da se RNA lanci protežu i od linkera i izravno od vezikula, tj. RNA polimeraza očito prepisuje nukleosome. Ovi podaci podržavaju odvijanje nukleosoma i njihovu transkripciju RNA polimerazom.

Svi navedeni rezultati nisu izravni, pa bi budući eksperimenti trebali dati konačno rješenje pitanja sudbine nukleosoma tijekom transkripcije.

Modifikacija histona i varijante histona: povezanost s aktivnim kromatinom. Još ranih 60-ih Allfrey (SAD) pokazao je da histoni mogu doživjeti različite modifikacije. Stoga je histon HI fosforiliran na ε-amino skupinama lizina. Histoni H3 i H4 su acetilirani na istim skupinama. Postoji niz drugih modifikacija (metilacija, ADP - ribozilacija, ubikvitinacija itd.).

Odmah se pretpostavilo da enzimske modifikacije histona mogu utjecati na strukturu kromatina i njegovu aktivnost. Doista, kada se lizin fosforilira, jedan pozitivan naboj u histonu zamjenjuje se negativnim; kada se apelira, pozitivni naboj se gubi, itd. Zahvaljujući takvim promjenama naboja modificirani histoni mogu se odvojiti od nemodificiranih pri izvođenju gel elektroforeza u acetatnom puferu s ureom. Dakle, u elektroforezi visoke razlučivosti, histon H4 ne daje jednu, već četiri trake, što odgovara molekulama koje nisu acetilirane i acetilirane na jednom, dva i tri lizinska ostatka. U različitim tkivima omjer između frakcija se mijenja. Histoni H3, H2a, H2b i H1 podijeljeni su u nekoliko frakcija (različitih stupnjeva acetilacije i fosforilacije).

Nažalost, još uvijek ne postoje dobre metode za odvajanje transkripcijski aktivnog i neaktivnog kromatina i stoga je teško pripisati promijenjene oblike histona jednom ili drugom stanju kromatina. Najzanimljivije podatke u tom pravcu dobili su od strane istog W. Alfrey(SAD). Tijekom hidrolize aktivnog kromatina izolirao je neobične čestice koje su se u gradijentu saharoze taložile sporije od običnih nukleosoma i, prema mišljenju autora, odgovarale su nesmotanim nukleosomima. Te čestice, nazvane A čestice, sadržavale su sve jezgre histona. Za razliku od normalnih nukleosoma, SH skupine histona H3 u A česticama bile su dostupne brojnim kemijskim reagensima i zbog toga su A čestice mogle biti odvojene od nukleosoma frakcioniranjem na stupcima kloromerkuribenzoata (reagens za vezanje SH skupine). A-čestice sadrže povećan sadržaj acetiliranih oblika histona. Autor predlaže da acetilacija histona nakon aktivacije kromatina dovodi do razmotavanja nukleosomskih čestica, a to zauzvrat povećava dostupnost SH skupina histona H3.

Neke histone kodira više od jedne vrste gena. Kao rezultat toga, postoji nekoliko varijanti ovih histona koji se neznatno razlikuju u svojoj aminokiselinskoj sekvenci. Ponekad u procesu ontogeneze postoji prirodna zamjena jedne podklase histona drugom. Međutim, ostaje nejasno ima li to ikakav regulatorni značaj. Problem se, očito, također može riješiti nakon razvoja odgovarajućih metoda za izolaciju transkripcijski aktivnog kromatina.

Poseban položaj zauzima histon H1. Postoje opcije za to koje se oštro razlikuju u svojoj strukturnoj organizaciji. Ova opcija je, na primjer, histon H5, koji zamjenjuje značajan dio histona H1 u jezgri eritrocita ptica. Po svoj prilici ova je supstitucija važan čimbenik potpunog gašenja transkripcije u jezgrama eritrocita. U normalnim stanicama postoji varijanta histona H1 - histon H1 0. Njegov sadržaj čini mali dio ukupnog histona H1. Postoji niz kontradiktornih podataka da je H1 0 povezan s aktivnim genima ili, obrnuto, sa stabilno isključenim genima. Pitanje ostaje otvoreno.

HMG proteini mogu biti uključeni u organiziranje aktivnog kromatina 1* . Osim histona, kromatin sadrži mnoge nehistonske proteine čija je funkcija nepoznata. Među njima, očito, trebaju biti strukturni proteini, enzimi koji osiguravaju procese replikacije, transkripcije itd., Regulacijski proteini. E. Jones(Velika Britanija) pokušali su izolirati proteinske komponente prisutne u dovoljno velikim količinama da bi se omogućila njihova analiza i identifikacija. Zapravo je uspio izolirati novu klasu nuklearnih proteina, koju je nazvao "skupina proteina visoke pokretljivosti" ( skupina visoke pokretljivosti), ili HMG proteini. Naziv je ovisio o visokoj mobilnosti ovih proteina tijekom gel elektroforeze. Proteinska frakcija HMG razgrađuje se na brojne pojedinačne komponente. Među njima su najreprezentativniji i dobro karakterizirani HMG-1, HMG-2, HMG-14 i HMG-17.

HMG proteini imaju nisku molekulsku masu. Obogaćeni su i bazičnim i dikarboksilnim aminokiselinama. Sadržaj HMG proteina je približno 7% sadržaja histona. Može se razlikovati u jezgrama iz različitih vrsta stanica. U tom kontekstu nas najviše zanimaju proteini HMG-14 i HMG-17, za koje su dobiveni dokazi o mogućoj ulozi u aktivaciji transkripcije. H. Weintraub(SAD) pokazali su da nuklearna ekstrakcija s 0,35 M NaCl, koja ekstrahira HMG proteine, mijenja neka svojstva aktivnog kromatina, koja se obnavljaju kada se kromatinu dodaju HMG-14 i HMG-17. G. Dixon(Kanada) otkrio je ove proteine u sastavu nukleosoma koji se oslobađaju iz kromatina u ranim fazama hidrolize nukleazom, a koji su, prema njegovim podacima, obogaćeni DNK trakcijski aktivnih gena.

završava [32 P] i zatim hibridizira s hnRNA iz L stanica. Hibridi su detektirani gel filtracijom. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - ukupna DNA stanice (prema rezultatima V.V. Bakaev et al.)">
Riža. 29. Moguća povezanost HMG proteina (14 i 17) s aktivnim kromatinom. a - detekcija subnukleosoma u hidrolizatu kromatina pomoću mikrokokne nukleaze. U različitim fazama hidrolize pojavljuju se određene frakcije subnukleosoma. Elektroforeza je provedena u poliakrilamidnom gelu u nedenaturirajućim uvjetima. Bojenje etidijevim bromidom, fluorografija na desnom stupcu; b - korištenje dvodimenzionalne elektroforeze za određivanje proteinskog sastava subnukleosoma CH2 i CH3. Kromatin obilježen [14 C] proteinom hidroliziran je mikrokoknom nukleazom i odvojen dvodimenzionalnom elektroforezom (1. smjer - nedisocirajući medij, 2. smjer - otopina natrijevog dodecil sulfata), nakon čega je učinjena autoradiografija za identifikaciju proteina. Slova označavaju HMG proteine koji u vrijeme eksperimenta još nisu bili identificirani s poznatima. Sada znamo da je A HMG-1, B je HMG-2, E je HMG-14, G je HMG-17, HMG proteini F i H nisu jasno identificirani, vjerojatno H također odgovara HMG-17. Može se vidjeti da su HMG proteini dio mononukleosoma (MH-2 i MH-3) i subnukleosoma CH-2 (HMG-17) i CH-3 (HMG-14); c - demonstracija obogaćivanja DNA CH-2 i CH-3 transkribiranih sekvenci. DNA izolirana iz CH-2 i CH-3 vrpci L stanica obilježena je na 5" krajevima [32 P] i zatim hibridizirana s hnRNA iz L stanica. Hibridi su otkriveni gel filtracijom. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - ukupna DNA stanice (prema rezultatima V.V. Bakaev et al.)

V. V. Bakaev u našem laboratoriju drugačijim eksperimentalnim pristupom došli do zaključka o ulozi HMG proteina u transkripciji. Tijekom elektroforetske analize hidrolizata kromatina otkrio je, osim nukleosoma i oligonukleosoma, manje pokretljive komponente. Nazvani su subnukleosomi i očito su produkti daljnje razgradnje nukleosoma (slika 29, tablica 5). Subnukleosom CH-7 odgovarao je nukleosomu koji je izgubio po jednu molekulu H2a i H2b i sadržavao je DNA skraćenu za 40 bp; CH-6 je odgovarao kompleksu DNA dugom 30-40 bp. s histonom H1, koji je odcijepljen od MH-2 tijekom njegove transformacije u MH-1. CH-4 je sadržavao segment DNA i par histona H2a i H2b (produkt reakcije MH-1→CH-7→CH-4). Dva subnukleosoma, CH-3 i CH-2, sastoje se od kratkih DNA i HMG proteina (HMG-14 i HMG-17). Moglo bi se pretpostaviti da su to vezne regije povezane s proteinima HMG-14 i HMG-17, koje prelaze u otopinu nakon probave odgovarajućih nukleosoma. CH-2 i CH-3 su sakupljeni, iz njih je izolirana DNA, označena na kraju i proučavana je njena hibridizacija s nuklearnom RNA. Ispostavilo se da DNA iz CH-2 i CH-3 mnogo učinkovitije hibridizira s nuklearnom RNA nego ukupna stanična DNA fragmentirana na istu veličinu.

Stoga je zaključeno da DNK povezana s proteinima HMG-14 i HMG-17 vjerojatno potječe iz transkripcijski aktivnog kromatina.

Svi ovi podaci, dobiveni neovisno, upućuju na to da su HMG-14 i HMG-17 nekako povezani s aktivacijom gena. Međutim, mehanizam aktivacije bio je potpuno nejasan. HMG-14 i HMG-17 ne mogu biti primarni čimbenici koji uključuju gen, budući da nemaju specifičnosti. Moglo bi se pomisliti da su oni uključeni u održavanje "otvorene konformacije" aktivnog kromatina.

Sljedećih godina pojavio se skepticizam u pogledu uloge HMG-14 i HMG-17 u aktivaciji kromatina. Konkretno, nedavno A. D. Mirzabekov et al. metodom hibridizacije s proteinskim tkivima dobili smo podatke o depleciji aktivnog kromatina HMG-14 i HMG-17. Međutim, budući da su svi gore navedeni podaci neizravni, općenito pitanje uloge HMG proteina ostaje otvoreno i zahtijeva daljnja istraživanja.

Topoizomeraza I i proteini čvrsto vezani za DNA dio su transkripcijski aktivnog kromatina 1* . S. Elgin (SAD), praćen nizom drugih autora, pokazao je da transkripcijski aktivan kromatin sadrži topoizomerazu I, enzim koji opušta supersmotanu DNA. To je prvi put pokazano na citološkim preparatima politenskih kromosoma Drosophile korištenjem fluorescentnih protutijela na topoizomerazu I. Ovaj enzim uvodi jednolančani prekid u DNA i kovalentno se veže na rezultirajući 5" kraj DNA. To omogućuje DNA da slobodno rotira na mjesto prekida. Zatim se fragment odcijepi i fosfodiesterska veza u DNK se obnovi. Što se tiče molekularne težine, topoizomeraza I ili skraćeno topo I je heterogena. Najteža komponenta ima molekularnu težinu 135 kDa, a najbogatije zastupljeni - 80 kDa. Kada ga cijepaju proteinaze, nastaju kraći polipeptidi, koji ipak zadržavaju enzimsku aktivnost.

Antibiotik kaptotecin je topo I inhibitor, a kada se njime tretiraju stanice, enzim stvara kovalentne veze s DNK na mjestu gdje je bio u trenutku kontakta s antibiotikom. Položaj takvih poprečnih veza može se lako odrediti mapiranjem upotrebom hibridizacijske oznake. Na taj je način otkriveno da je topo I prisutan isključivo u transkribiranim regijama genoma, odnosno najvjerojatnije radi u suradnji s RNA polimerazom II, uklanjajući lokalne zavoje DNA koji nastaju tijekom transkripcije.

Još jedna proteinska komponenta otkrivena u transkribiranim regijama genoma je skup proteina čvrsto vezanih za DNK (DBP), koji odgovara transkribiranoj DNK stanice (vidi Odjeljak 3.4).

S. V. Razin i V. V. Chernokhvostov Pokušalo se detaljno karakterizirati komplekse DNA s PBP-om. Fragmenti DNA duljine 1-2 kb povezani s PBP-om su pročišćeni i podvrgnuti ravnotežnom ultracentrifugiranju u gradijentu gustoće CsCl. Pokazalo se da im je uzgonska gustoća jednaka 1,7 g/cm3, tj. odgovaralo je uzgonskoj gustoći slobodne DNA koja ne sadrži protein. U eksperimentima osmišljenim da objasne ovaj paradoks, otkriveno je da tretman s DRNase dovodi do smanjenja uzgonske gustoće kompleksa 1,62-1,65 g/cm3. Približni izračuni temeljeni na gustoći proteina ( ~ 1,3 g/cm3) i RNA ( ~ 1,9 g/cm3), (pokažite da za svaku molekulu DNA postoji oko 150 kDa proteina i oko 200 nukleotida RNA. Priroda ove RNK je nejasna, ali su dobiveni dokazi o njenoj homogenosti i jedinstvenom nukleotidnom slijedu.

Dakle, mnogo toga o DNA-PBP kompleksima ostaje misteriozno, ali po svoj prilici igraju značajnu ulogu u organizaciji transkripcijskih strojeva. Njihovo istraživanje je trenutno u tijeku.

Demetilacija DNA u transkribiranim genima 2*. Druga važna značajka aktivnog kromatina je demetilacija određenih dijelova DNA. U neaktivnim genima, većina citidilnih ostataka unutar CG sekvenci je metilirana. Prvi B.V. Vanjušin u laboratoriju A. N. Belozerskog pokazalo se da se DNA u različitim tkivima iste životinje razlikuje u razini metilacije C. Na temelju toga, sugerirano je da metilacija može imati regulatornu ulogu u diferencijaciji. Kasnije su mnogi autori pokazali da su neke regije u transkribiranoj DNK nedovoljno metilirane. Najčešće korištena metoda analize je usporedba restrikcijskih mapa dobivenih restrikcijskim enzimima koji prepoznaju istu sekvencu, kao što su CGCG ili CCGG, ali imaju različite osjetljivosti na metilaciju. Jedan od restrikcijskih enzima cijepa i metilirane i nemetilirane sekvence, a drugi samo nemetilirane. Tipično, nemetilirane sekvence su lokalizirane u regulatornoj regiji gena. Regija samog gena, njegov kodirajući dio i introni jednako su metilirani iu radnim i u tihim genima.

Kada se metilirana DNA uvede u stanice, njezina ekspresija u stanici značajno je smanjena u usporedbi s nemetiliranom DNA. Dobiveni su podaci prema kojima se tijekom replikacije DNA reproducira stanje metilacije DNA: ako je jedan od lanaca metiliran, tada je na istom mjestu metiliran i novonastali lanac.

Jedno vrijeme se činilo da je metilacija-demetilacija citidina u CG sekvencama regulacijske regije glavni mehanizam inaktivacije-aktivacije gena. Međutim, nedavno su se pojavili brojni podaci koji su u suprotnosti s ovom hipotezom. Stoga se potpuno CG metilirana SV40 DNA aktivno eksprimira. U isto vrijeme, metilcitozin se uopće ne otkriva u DNA Drosophile. Moguće je da je demetilacija C posljedica aktivacije gena i samo održava stanje transkripcijske aktivnosti. Ovdje su, kao iu drugim područjima proučavanja aktivacije gena, potrebni novi eksperimenti.