Kromatiin: määratlus, struktuur ja roll rakkude jagunemisel. Eukarüootse DNA kolm fraktsiooni, nende lokaliseerimine kromosoomides ja funktsioonid Kromatiini struktuursed ja funktsionaalsed komponendid

Kromatiini, raku tuuma põhikomponenti, on üsna lihtne saada eraldatud interfaaside tuumadest ja isoleeritud mitootilistest kromosoomidest. Selleks kasutavad nad madala ioontugevusega vesilahuste või lihtsalt deioniseeritud veega ekstraheerimisel selle võimet minna lahustunud olekusse. Sel juhul kromatiini osad paisuvad ja muutuvad geeliks. Selliste ravimite reaalseteks lahusteks muutmiseks on vaja tugevaid mehaanilisi mõjutusi: loksutamist, segamist, täiendavat homogeniseerimist. See muidugi viib kromatiini algse struktuuri osalise hävimiseni, purustades selle väikesteks fragmentideks, kuid praktiliselt ei muuda selle keemilist koostist.

Erinevatelt objektidelt saadud kromatiini fraktsioonidel on üsna ühtlane komponentide komplekt. Leiti, et faasidevahelistest tuumadest ja mitootilistest kromosoomidest pärit kromatiini kogukeemiline koostis erineb üksteisest vähe. Kromatiini põhikomponendid on DNA ja valgud, millest põhiosa moodustavad histoonid ja mittehistoonvalgud (vt tabel 3).

Tabel 3. Kromatiini keemiline koostis. Valkude ja RNA sisaldus on antud DNA suhtes

Keskmiselt on umbes 40% kromatiinist DNA ja umbes 60% valgud, sealhulgas spetsiifilised tuumavalgud. histoonid, moodustavad 40–80% kõigist eraldatud kromatiini moodustavatest valkudest. Lisaks sisaldab kromatiini fraktsioon membraanikomponente, RNA-d, süsivesikuid, lipiide ja glükoproteiine. Küsimus, kui palju neid väiksemaid komponente kromatiini struktuuris sisaldub, pole veel lahendatud. Nii võib näiteks RNA transkribeerida RNA-d, mis ei ole veel kaotanud seost DNA matriitsiga. Teised väiksemad komponendid võivad kujutada endast tuumamembraani koossadestatud fragmentidest pärit aineid.

Struktuurselt on kromatiin desoksüribonukleoproteiini (DNP) molekulide filamentne kompleks, mis koosneb histoonidega seotud DNA-st (vt joonis 57). Seetõttu on kromatiini jaoks juurdunud teine nimi - nukleohistooni. Just tänu histoonide seostele DNA-ga tekivad väga labiilsed, varieeruvad nukleiinhappe-histooni kompleksid, kus DNA:histooni suhe on ligikaudu üks, s.o. neid leidub võrdsetes kogustes. Need filamentsed DNP fibrillid on elementaarsed kromosomaalsed või kromatiini kiud, mille paksus võib sõltuvalt DNA pakkimise astmest olla vahemikus 10 kuni 30 nm. Neid DNP fibrillid saab omakorda veelgi tihendada, et moodustada DNP struktureerimise kõrgem tase kuni mitootilise kromosoomini. Mõnede mittehistoonvalkude roll on just nimelt kõrge kromatiini tihendamise taseme moodustamises.

DNA kromatiin

Kromatiini preparaadis moodustab DNA tavaliselt 30-40%. See DNA on kaheahelaline spiraalne molekul, mis sarnaneb vesilahustes oleva puhta isoleeritud DNA-ga. Seda tõendavad paljud katseandmed. Seega, kui kromatiini lahuseid kuumutatakse, täheldatakse lahuse optilise tiheduse suurenemist, nn hüperkroomset efekti, mis on seotud DNA ahelate vaheliste nukleotiidsete vesiniksidemete katkemisega, sarnaselt sellele, mis juhtub puhta DNA kuumutamisel (sulatamisel). .

Kromosoomi kui terviku struktuuri mõistmiseks on oluline küsimus kromatiini DNA molekulide suuruse ja pikkuse kohta. Kasutades standardseid DNA eraldamise meetodeid, on kromatiini molekulmass 7-9 x 10 6, mis on oluliselt väiksem kui Escherichia coli DNA molekulmass (2,8 x 10 9). Kromatiinipreparaatidest pärit DNA suhteliselt madal molekulmass on seletatav DNA mehaanilise kahjustusega kromatiini eraldamise protsessis. Kui DNA eraldatakse tingimustes, mis välistavad raputamise, homogeniseerimise ja muud mõjud, on võimalik saada rakkudest väga pikki DNA molekule. Eukarüootsete rakkude tuumadest ja kromosoomidest pärinevate DNA molekulide pikkust saab uurida valgusoptilise autoradiograafia meetodil, nagu seda uuriti prokarüootsete rakkude puhul.

Avastati, et kromosoomides võib üksikute lineaarsete (erinevalt prokarüootsetest kromosoomidest) DNA molekulide pikkus ulatuda sadade mikromeetriteni ja isegi mitme sentimeetrini. Nii saadi erinevatelt objektidelt DNA molekulid vahemikus 0,5 mm kuni 2 cm. Need tulemused näitasid, et kromosoomi kohta arvutatud DNA pikkuse ja autoradiograafilise vaatluse vahel on tihe kokkulangevus.

Pärast eukarüootsete rakkude kerget lüüsimist saab DNA molekulmassi füüsikalis-keemiliste meetoditega otse määrata. On näidatud, et Drosophila DNA molekuli maksimaalne molekulmass on 41 x 10 9, mis vastab umbes 2 cm pikkusele. Mõnes pärmis on kromosoomi kohta DNA molekul molekulmassiga 1 x 10 8 -10 9, mis on umbes 0,5 mm .

Nii pikk DNA on üks molekul, mitte mitu lühemat, mis on valgusidemete abil ühte faili kokku õmmeldud, nagu mõned teadlased arvasid. Sellele järeldusele jõuti pärast seda, kui selgus, et pärast ravimite töötlemist proteolüütiliste ensüümidega DNA molekulide pikkus ei muutu.

Rakkude tuumastruktuuridesse, organismide genoomis sisalduva DNA koguhulk on liigiti erinev, kuigi mikroorganismides on DNA hulk raku kohta oluliselt väiksem kui selgrootutel, kõrgematel taimedel ja loomadel. Seega on hiirel peaaegu 600 korda rohkem DNA-d tuuma kohta kui E. coli-s. Kui võrrelda DNA kogust raku kohta eukarüootsetes organismides, on raske tuvastada mingit seost organismi keerukuse astme ja DNA koguse vahel tuuma kohta. Ligikaudu sama palju DNAd on sellistel erinevatel organismidel nagu lina, merisiilik, ahven (1,4-1,9 pg) või söe ja härjakala (6,4 ja 7 pg).

Suurtes taksonoomilistes rühmades esineb DNA koguses olulisi kõikumisi. Kõrgematel taimedel võib DNA hulk eri liikidel erineda sadu kordi, nii nagu kalade puhul erineb kahepaiksete DNA hulk kümneid kordi.

Mõne kahepaikse tuumas on 10–30 korda rohkem DNA-d kui inimese tuumades, kuigi inimese geneetiline ehitus on võrreldamatult keerulisem kui konnade oma. Seetõttu võib eeldada, et DNA “liigne” kogus madalamalt organiseeritud organismides kas ei ole seotud geneetilise rolli täitmisega või kordub geenide arv mitu korda.

Tabel 4. DNA sisaldus mõne objekti rakkudes (lk, 10 -12 g)

Selgus, et neid probleeme on võimalik lahendada renaturatsiooni või DNA hübridisatsiooni reaktsiooni kineetika uurimisega. Kui lahustes olevad fragmenteeritud DNA molekulid allutatakse termilisele denatureerimisele ja seejärel inkubeeritakse denaturatsioonist veidi madalamal temperatuuril, taastub DNA fragmentide algne kaheahelaline struktuur tänu komplementaarsete ahelate taasühendamisele – renaturatsioonile. DNA viiruste ja prokarüootsete rakkude puhul näidati, et sellise renaturatsiooni kiirus sõltub otseselt genoomi suurusest; mida suurem on genoom, seda suurem on DNA kogus osakese või raku kohta, seda rohkem aega kulub komplementaarsete ahelate juhuslikuks lähenemiseks ja suurema hulga nukleotiidjärjestuselt erinevate DNA fragmentide spetsiifiliseks taasassotsieerimiseks (joonis 53). Prokarüootsete rakkude DNA reassotsiatsioonikõvera olemus näitab korduvate alusjärjestuste puudumist prokarüootses genoomis; kõik nende DNA lõigud kannavad ainulaadseid järjestusi, mille arv ja mitmekesisus peegeldavad objektide geneetilise koostise keerukuse astet ja sellest tulenevalt ka nende üldist bioloogilist korraldust.

Täiesti erinev pilt DNA taasassotsiatsioonist on täheldatud eukarüootsetes organismides. Selgus, et nende DNA sisaldab fraktsioone, mis renatureerivad palju kiiremini, kui nende genoomi suuruse põhjal eeldada võiks, samuti osa DNAst, mis renatureerub aeglaselt, nagu prokarüootide ainulaadsed DNA järjestused. Eukarüootidel on aga selle fraktsiooni renatureerimiseks vaja oluliselt rohkem aega, mis on seotud nende genoomi üldise suure suuruse ja erinevate unikaalsete geenide suure hulgaga.

Eukarüootse DNA selles osas, mida iseloomustab kõrge renaturatsioonikiirus, eristatakse kahte alamfraktsiooni: 1) tugevalt või sageli korduvate järjestustega fraktsioon, kus sarnaseid DNA lõike saab korrata 10 6 korda; 2) murdosa mõõdukalt korduvaid järjestusi, mis esinevad genoomis 10 2 -10 3 korda. Seega sisaldab sageli korduvate järjestustega DNA fraktsioon hiirtel 10% DNA koguhulgast genoomi kohta ja 15% moodustab mõõdukalt korduvate järjestustega fraktsioon. Ülejäänud 75% kogu hiire DNA-st on esindatud ainulaadsete piirkondadega, mis vastavad suurele hulgale erinevatele mittekorduvatele geenidele.

Väga korduvate järjestustega fraktsioonidel võib olla erinev ujuvustihedus kui DNA põhimassil ja seetõttu saab neid eraldada puhtal kujul niinimetatud fraktsioonidena satelliidi DNA. Hiirel on selle fraktsiooni tihedus 1,691 g/ml ja põhiosa DNA-st on 1700 g/ml. Need tiheduse erinevused on määratud nukleotiidide koostise erinevustega. Näiteks hiirel on selles fraktsioonis 35% G ja C paare ning DNA peamises piigis 42%.

Nagu selgus, ei osale satelliit-DNA ehk sageli korduvate järjestustega DNA fraktsioon rakus peamiste RNA tüüpide sünteesis ega ole seotud valgusünteesi protsessiga. See järeldus tehti tõsiasja põhjal, et ükski raku RNA tüüpidest (tRNA, mRNA, rRNA) ei hübridiseeru satelliidi DNA-ga. Järelikult ei sisalda need DNA-d järjestusi, mis vastutavad rakulise RNA sünteesi eest, st. satelliit-DNA-d ei ole RNA sünteesi mallid ega osale transkriptsioonis.

On olemas hüpotees, et väga korduvad järjestused, mis ei ole otseselt valgusünteesiga seotud, võivad kanda teavet, mis mängib olulist struktuurilist rolli kromosoomide säilimises ja toimimises. Nende hulka võivad kuuluda arvukad DNA lõigud, mis on seotud faasidevahelise tuuma tuumvalkudega (vt allpool), replikatsiooni või transkriptsiooni alguspunktis olevad kohad, samuti DNA lõigud, mis neid protsesse reguleerivad.

Kasutades nukleiinhapete hübridiseerimise meetodit otse kromosoomidel ( kohapeal) uuriti selle fraktsiooni lokaliseerimist. Selleks sünteesiti bakteriaalsete ensüümide abil eraldatud satelliit-DNA-l 3H-uridiiniga märgistatud RNA. Seejärel töödeldi kromosoomidega tsütoloogilist preparaati nii, et toimub DNA denaturatsioon (kõrgenenud temperatuur, aluseline keskkond jne). Pärast seda kanti preparaadile 3H-märgistatud RNA ning saavutati hübridisatsioon DNA ja RNA vahel. Autoradiograafia näitas, et suurem osa märgisest paikneb kromosoomide primaarsete kitsenduste tsoonis, nende tsentromeersete piirkondade tsoonis. Märk tuvastati ka teistes kromosoomide piirkondades, kuid väga nõrgalt (joon. 54).

Viimase 10 aasta jooksul on õppimises tehtud suuri edusamme tsentromeerne DNA, eriti pärmirakkudes. Tehke nii S. cerevisiae Tsentromeerne DNA koosneb korduvatest 110 aluspaari pikkustest piirkondadest. See koosneb kahest konserveerunud piirkonnast (I ja III) ja kesksest elemendist (II), mis on rikastatud AT aluspaaridega. Drosophila kromosoomidel on sarnane tsentromeeri DNA struktuur. Inimese tsentromeerne DNA (alfoidne satelliit-DNA) koosneb 170 bp monomeeride tandemist, mis on organiseeritud dimeeride või pentameeride rühmadesse, mis omakorda moodustavad suuri 1-6 x 10 3 bp järjestusi. Seda suurimat ühikut korratakse 100-1000 korda. Spetsiaalsed tsentromeersed valgud on selle spetsiifilise tsentromeerse DNA-ga kompleksis ja osalevad moodustumises kinetokoor, struktuur, mis tagab kromosoomide ühenduse spindli mikrotuubulitega ja kromosoomide liikumises anafaasis (vt allpool).

Samuti on leitud väga korduvate järjestustega DNA-d telomeersed piirkonnad paljude eukarüootsete organismide kromosoomid (pärmist kuni inimeseni). Siin leidub kõige sagedamini kordusi, mis sisaldavad 3-4 guaniini nukleotiidi. Inimestel sisaldavad telomeerid 500–3000 TTAGGG kordust. Need DNA lõigud täidavad erilist rolli – piiravad kromosoomi otste ja takistavad selle lühenemist korduva replikatsiooni käigus.

Hiljuti leiti, et faasidevaheliste kromosoomide väga korduvad DNA järjestused seonduvad spetsiifiliselt tuumaümbrise aluseks olevate lamineeritud valkudega ja osalevad pikendatud dekondenseeritud interfaasi kromosoomide ankurdamisel, määrates seeläbi kromosoomide lokaliseerimise järjekorra faasidevahelise tuuma mahus.

On oletatud, et satelliit-DNA võib olla seotud kromosoomide homoloogsete piirkondade äratundmisega meioosi ajal. Teiste eelduste kohaselt mängivad sageli korduvate järjestustega piirkonnad kromosomaalse DNA erinevate funktsionaalsete üksuste, näiteks replikonide vahel eraldajate (vahetükkide) rolli (vt allpool).

Nagu selgus, kuulub mõõdukalt korduvate (10 2 kuni 10 5 korda) järjestuste osa DNA piirkondade kirevasse klassi, millel on oluline roll valgusünteesiaparaadi loomise protsessis. See fraktsioon sisaldab ribosomaalseid DNA geene, mida saab erinevates liikides korrata 100 kuni 1000 korda. See fraktsioon sisaldab kõigi tRNA-de sünteesiks mitu korda korduvaid piirkondi. Veelgi enam, mõningaid struktuurseid geene, mis vastutavad teatud valkude sünteesi eest, saab ka mitu korda korrata, mida esindavad paljud koopiad. Need on kromatiini valkude – histoonide geenid, mida korratakse kuni 400 korda.

Lisaks sisaldab see fraktsioon erineva järjestusega DNA sektsioone (igaüks 100–400 nukleotiidipaari), mida korratakse samuti mitu korda, kuid on hajutatud kogu genoomis. Nende roll pole veel täiesti selge. On oletatud, et sellised DNA lõigud võivad esindada erinevate geenide aktseptor- või regulaatorpiirkondi.

Seega on eukarüootsete rakkude DNA koostiselt heterogeenne, sisaldades mitut klassi nukleotiidjärjestusi: sageli korduvad järjestused (> 10 6 korda), sisalduvad satelliit-DNA fraktsioonis ja ei ole transkribeeritud; murdosa mõõdukalt korduvatest järjestustest (10 2 -10 5), mis esindavad tõeliste geenide plokke, samuti lühikesi järjestusi, mis on hajutatud kogu genoomis; unikaalsete järjestuste murdosa, mis kannab teavet enamiku rakuvalkude kohta.

Nende ideede põhjal saavad selgeks erinevused DNA koguses, mida erinevates organismides täheldatakse: need võivad olla seotud teatud DNA klasside ebavõrdse osakaaluga organismide genoomis. Nii näiteks kahepaiksel Amphiuma(millel on 20 korda rohkem DNAd kui inimestel) korduvad järjestused moodustavad kuni 80% kogu DNA-st, sibulas kuni 70, lõhel kuni 60% jne. Geneetilise teabe tegelik rikkus peaks kajastuma unikaalsete järjestuste osana. Me ei tohi unustada, et kromosoomi natiivses, killustamata DNA molekulis on kõik piirkonnad, mis sisaldavad ainulaadseid, mõõdukalt ja sageli korduvaid järjestusi, ühendatud üheks hiiglaslikuks kovalentseks DNA ahelaks.

DNA molekulid on heterogeensed mitte ainult erinevate nukleotiidjärjestuste piirkondades, vaid erinevad ka oma sünteetilise aktiivsuse poolest.

Eukarüootse DNA replikatsioon

Bakteri kromosoom replitseerub ühe struktuuriüksusena, millel on üks replikatsiooni alguspunkt ja üks lõpp-punkt. Seega on bakteriaalne tsirkulaarne DNA üks replikon. Alguspunktist kulgeb replikatsioon kahes vastassuunas, nii et DNA sünteesimisel moodustub nn replikatsioonisilm, mis on mõlemalt poolt piiratud replikatsioonikahvlitega, mis on selgelt nähtav viiruste ja bakterite replikatsioonikromosoomide elektronmikroskoopilisel uurimisel. .

Eukarüootsetes rakkudes on replikatsioonikorraldus teistsuguse iseloomuga – polüreplikon.Nagu juba mainitud, tekib 3 HT impulss-inklusioonil peaaegu kõigis mitootilistes kromosoomides mitmekordne märgistus. See tähendab, et faasidevahelises kromosoomis on samaaegselt palju replikatsioonikohti ja palju autonoomseid replikatsiooni alguspunkte. Seda nähtust uuriti üksikasjalikumalt DNA-st eraldatud märgistatud molekulide autoradiograafia abil (joonis 55) Kui rakud olid impulssmärgistatud 3 HT-ga, siis valgusmikroskoobis on eraldatud DNA autogrammidel näha vähendatud hõbedaga alasid. punktiirjoonte kujul. Need on väikesed DNA lõigud, mis on suutnud paljuneda ja nende vahel on replitseerimata DNA lõigud, mis ei jätnud autoradiograafi ja jäävad seetõttu nähtamatuks. Kui 3 NT rakuga kokkupuute aeg pikeneb, suureneb selliste segmentide suurus ja nendevaheline kaugus väheneb. Nende katsete põhjal saab täpselt välja arvutada DNA replikatsiooni kiiruse eukarüootsetes organismides. Replikatsioonikahvli liikumiskiiruseks osutus 1-3 kb. minutis imetajatel umbes 1 kb. minutis mõnel taimel, mis on palju väiksem kui DNA replikatsiooni kiirus bakterites (50 kb minutis). Samades katsetes tõestati otseselt eukarüootsete kromosoomide DNA polüreplikonstruktuur: kogu kromosomaalse DNA pikkuses, piki seda, on palju sõltumatuid replikatsioonikohti - replikonid. Vastavalt kaugusele külgnevate märgistusreplikonide keskpunktide vahel, s.o. Kahe külgneva replikatsiooni alguspunkti vahelise kauguse põhjal saab määrata üksikute replikonide suuruse. Kõrgemate loomade replikoni suurus on keskmiselt umbes 30 µm või 100 kb. Seetõttu peaks imetajate haploidses komplektis olema 20 000–30 000 replikoni. Madalamatel eukarüootidel on replikonid väiksemad, umbes 40 kb. Seega on Drosophilas 3500 replikoni genoomi kohta ja pärmis – 400. Nagu mainitud, toimub DNA süntees replikonis kahes vastassuunas. Seda saab hõlpsasti tõestada autoradiograafiaga: kui rakkudel lastakse pärast impulssmärgistust mõnda aega jätkata DNA sünteesimist ilma 3 HT-ta söötmes, siis väheneb selle kaasamine DNA-sse, toimub märgise lahjendus ja autoradiograaf on võimalik näha sümmeetrilist mustrit replitseeritud piirkonna mõlemal küljel, vähendades vähendatud hõbeda terade arvu.

Replikoni kopeerivad otsad või kahvlid lõpetavad liikumise, kui nad kohtuvad naaberreplikonide harudega (naaberreplikonitele ühises lõpp-punktis). Sel hetkel liidetakse naaberreplikonide replitseeritud lõigud kahe äsja sünteesitud DNA molekuli üksikuteks kovalentseteks ahelateks. Kromosoomi DNA funktsionaalne jagunemine replikoniteks langeb kokku DNA struktuurse jagunemisega domeenideks ehk silmusteks, mille aluseid, nagu juba mainitud, hoiavad koos valkude sidemed.

Seega toimub kogu DNA süntees ühes kromosoomis sõltumatu sünteesi kaudu paljudel üksikutel replikonitel, millele järgneb külgnevate DNA segmentide otste ühendamine. Selle omaduse bioloogiline tähendus saab selgeks, kui võrrelda DNA sünteesi bakterites ja eukarüootides. Seega sünteesitakse umbes pooletunnise kiirusega bakteriaalne monoreplikoni kromosoom pikkusega 1600 mikronit. Kui ka imetaja kromosoomi sentimeetri pikkune DNA molekul replitseeritaks monoreplikonstruktuurina, kuluks selleks umbes nädal (6 päeva). Kuid kui selline kromosoom sisaldab mitusada replikoni, võtab selle täielik replikatsioon aega vaid umbes tund. Tegelikult on DNA replikatsiooniaeg imetajatel 6-8 tundi. See on tingitud asjaolust, et kõik üksiku kromosoomi replikonid ei lülitu korraga sisse.

Mõnel juhul täheldatakse kõigi replikonide samaaegset kaasamist või täiendavate replikatsiooni alguspunktide ilmnemist, mis võimaldab kõigi kromosoomide sünteesi lõpule viia minimaalselt lühikese ajaga. See nähtus esineb mõne looma embrüogeneesi alguses. Teadaolevalt küüniste konnade munade purustamisel Xenopus laevis DNA süntees võtab aega vaid 20 minutit, samas kui somaatiliste rakukultuuris kestab see protsess umbes ööpäeva. Sarnast pilti täheldatakse ka Drosophilas: varases embrüonaalses staadiumis võtab kogu DNA süntees tuumas aega 3,5 minutit ja koekultuuri rakkudes 600 minutit. Samal ajal osutus replikonite suurus kultuurirakkudes peaaegu 5 korda suuremaks kui embrüote puhul.

DNA süntees toimub üksiku kromosoomi pikkuses ebaühtlaselt. Leiti, et üksikus kromosoomis on aktiivsed replikonid koondatud rühmadeks, replikatiivseteks üksusteks, mis hõlmavad 20–80 replikatsiooni alguspunkti. See järgnes DNA autogrammide analüüsist, kus täheldati täpselt sellist replitseeruvate segmentide blokeerimist. Replikonide või replikatsiooniüksuste plokkide või klastrite olemasolu idee teiseks aluseks olid katsed tümidiini analoogi, 5'-bromodeoksüuridiini (BrdU) lisamisega DNA-sse. BrdU lisamine faasidevahelisse kromatiini toob kaasa asjaolu, et mitoosi ajal kondenseeruvad BrdU-ga piirkonnad vähemal määral (ebapiisav kondensatsioon) kui need piirkonnad, kus oli lisatud tümidiini. Seetõttu värvuvad need mitootiliste kromosoomide piirkonnad, milles on BrdU, diferentsiaalvärvimise ajal nõrgalt. See võimaldab määrata BrdU inkorporeerimise järjestust kasutades sünkroniseeritud rakukultuure, st. DNA sünteesi järjestus ühe kromosoomi pikkuses. Selgus, et toimub prekursori kaasamine suurtesse kromosoomi osadesse. Erinevate sektsioonide kaasamine toimub S-perioodil rangelt järjestikku. Iga kromosoomi iseloomustab replikatsioonijärjestuse kõrge stabiilsus kogu selle pikkuses ja sellel on oma spetsiifiline replikatsioonimuster.

Replikonite klastrid, mis on kombineeritud replikatsiooniüksusteks, on seotud tuumamaatriksi valkudega (vt allpool), mis koos replikatsiooniensüümidega moodustavad nn. klasterosoomid on faasidevahelise tuuma tsoonid, milles toimub DNA süntees.

Replikatsiooniüksuste aktiveerimise järjekorra võib tõenäoliselt määrata nende piirkondade kromatiini struktuur. Näiteks konstitutiivse heterokromatiini tsoonid (tsentromeeri lähedal) paljunevad tavaliselt S-perioodi lõpus, samuti kahekordistub osa fakultatiivsest heterokromatiinist S-perioodi lõpus (näiteks naise X-kromosoom). imetajad). Kromosoomilõikude replikatsioonijärjestus korreleerub ajaliselt eriti selgelt kromosoomide diferentsiaalse värvumise mustriga: R-segmendid kuuluvad varajase replikatsiooniga segmentidesse, G-segmendid vastavad hilise replikatsiooniga kromosoomilõikudele. C-segmendid (tsentromeerid) on viimase replikatsiooni kohad.

Kuna erinevates kromosoomides on erinevat värvi segmentide erinevate rühmade suurus ja arv erinev, loob see pildi erinevate kromosoomide kui terviku replikatsiooni asünkroonsest algusest ja lõpust. Igal juhul ei ole komplektis üksikute kromosoomide replikatsiooni alguse ja lõpu järjestus juhuslik. Kromosoomide paljunemisel on teiste komplekti kuuluvate kromosoomide suhtes range järjestus.

Üksikute kromosoomide replikatsiooniprotsessi kestus ei sõltu otseselt nende suurusest. Seega on A-rühma (1-3) suured inimese kromosoomid märgistatud kogu S-perioodi vältel, samuti rühma B (4-5) lühemad kromosoomid.

Seega algab DNA süntees eukarüootses genoomis S-perioodi alguses peaaegu üheaegselt kõigis tuuma kromosoomides. Kuid samal ajal toimub erinevate replikonide järjestikune ja asünkroonne kaasamine nii kromosoomide erinevates osades kui ka erinevates kromosoomides. Konkreetse genoomi piirkonna replikatsioonijärjestus on rangelt geneetiliselt määratud. Seda viimast väidet ei tõesta mitte ainult märgise kaasamise muster S-perioodi erinevatesse segmentidesse, vaid ka tõsiasi, et teatud geenide tundlikkuses mutageenide suhtes esineb S-perioodil range tippude järjestus. -periood.

1. Kromatiini tüübid

2. Geenid, vahetükid

3. Nukleotiidide järjestus DNA-s

4. DNA ruumiline korraldus

1. Jagunemistoimingute vahelise puhkuse ajal jäävad teatud kromosoomilõigud ja terved kromosoomid kompaktseks. Neid kromatiini piirkondi nimetatakse heterokromatiin. See värvib hästi.

Pärast tuuma jagunemist kromatiin lõdveneb ja sellisel kujul nimetatakse eukromatiin. Heterokromatiin on transkriptsiooni suhtes inaktiivne ja DNA replikatsiooni suhtes käitub see teisiti kui eukromatiin.

Fakultatiivne heterokromatiin on heterokromaatiline ainult kohati. See on informatiivne, st sisaldab geene. Kui see siseneb eukromaatilisesse olekusse, võivad need geenid saada transkriptsiooniks kättesaadavaks. Kahest homoloogsest kromosoomist võib üks olla heterokromaatiline. See fakultatiivne heterokromatiseerimine on koespetsiifiline ja seda ei esine teatud kudedes.

Konstitutiivne heterokromatiin alati heterokromaatiline. See koosneb korduvalt korduvatest aluste järjestustest, on väheinformatiivne (ei sisalda geene) ja on seetõttu alati transkriptsiooni suhtes passiivne. Sa näed teda Ja tuuma lõhustumise ajal. Ta käib kohtamas:

Kõige sagedamini tsentromeeris;

Kromosoomide otstes (sh satelliitidel);

Nucleoli korraldaja lähedal;

5S-RNA geeni lähedal.

Heterokromatiin, peamiselt fakultatiivne, võib interfaasi ajal ühineda intensiivselt värvunud kromotsentriks, mis enamikul juhtudel asub raku tuuma või tuuma serval.

2. Iga kromosoom on DNA pidev topeltheeliks, mis kõrgemates organismides koosneb enam kui 10 8 aluspaarist. Kõrgemate taimede ja loomade kromosoomides on iga DNA kaksikheeliksi (läbimõõt 2 nm) pikkus üks kuni mitu sentimeetrit. Korduva keeramise tulemusena pakitakse see mitme mikromeetri pikkuseks kromatiidiks.

Geenid on lineaarselt jaotunud piki seda topeltheeliksit, mis koos moodustavad kuni 25% DNA-st.

Geneon DNA funktsionaalne üksus, mis sisaldab teavet polüpeptiidi või RNA sünteesiks. Geeni keskmine pikkus on umbes 1000 aluspaari. Aluste järjestus igas geenis on ainulaadne.

Geenide vahel on vahetükid- erineva pikkusega (mõnikord üle 20 000 aluspaari) ebainformatiivsed DNA lõigud, mis on olulised naabergeeni transkriptsiooni reguleerimiseks.

Transkribeeritud vahetükid lõpetatakse transkriptsiooni ajal koos geeniga ja nende komplementaarsed koopiad ilmuvad pre-i-RNA-sse mõlemal pool geenikoopiat. Isegi geeni enda sees on (ainult eukarüootides ja nende viirustes) mitteinformatiivsed järjestused, nn intronid, mis samuti transkribeeritakse. Töötlemise käigus lõigatakse ensüümidega välja kõik intronite koopiad ja enamik vahetükkide koopiaid.

Mittetranskripteeritavad vahetükid esinevad nii histoonide kui ka rRNA geenide vahel.

Üleliigsed geenid on esindatud suure hulga (kuni 10 4 või enama) ühesuguste koopiatega. See on geenid:

tRNA jaoks;

5S-RNA ja histoonid;

Toodete jaoks, mida sünteesitakse suurtes kogustes.

Koopiad asuvad vahetult üksteise kõrval ja on lahendatud identsete vahetükkide abil. Merisiilikul asuvad üksteise järel histoonide H4, H2b, H2a ja Hi geenid ning see geenijärjestus kordub DNA-s enam kui 100 korda.

3. Korduvad järjestused - Need on DNA-s mitu korda esinevad nukleotiidide järjestused. Mõõdukalt korduv järjestused - järjestused, mille keskmine pikkus on 300 aluspaari 10 2 -10 4 kordusega. Nende hulka kuuluvad nii üleliigsed geenid kui ka enamik vahetükke.

Väga korduv 10 5 - 10 6 kordusega järjestused moodustavad konstitutiivse heterokromatiini. Nad alati ebainformatiivne. Need on enamasti lühikesed järjestused, enamasti leidub neis 7-10 ja harva - ainult 2 (näiteks AT) või vastupidi, üle 300 nukleotiidipaari. Need koonduvad kokku, kusjuures üks korduv järjestus järgneb kohe teisele. Väga korduvaid kromatiini DNA-sid nimetatakse "satelliit-DNA-deks", kuna need käituvad analüütiliste fraktsioneerimisprotseduuride ajal. Umbes 75% kogu kromatiinist ei osale transkriptsioonis: need on väga korduvad järjestused ja mittetranskripteeritavad speisserid.

4. Eraldatud kromatiinis DNA kaksikheeliksi lõigud keerduvad ümber histooni molekulide, nii et siia ilmub esimest järku superheeliks. DNA komplekse histooniga nimetatakse nukleosoomid. Neil on ketta või läätse kuju ja mõõtmed on umbes 10 x 10 x 5 nm. Üks nukleosoom kaasatud:

8 molekuli histoonid:

Kahe H3 ja kahe H4 molekuli keskne tetrameer; ja eraldi kaks H2a ja H2b;

DNA osa (umbes 140 aluspaari), mis moodustab ligikaudu 1,25 keerdu spiraalist ja on tihedalt seotud keskse tetrameeriga.

Nukleosoomide vahel on 30-100 aluspaarist koosneva spiraali lõigud, millel puudub superhelikaalne struktuur; Histoon seob siia Tere

Õmmeldud kromatiiniga DNA-d lühendatakse veelgi vähearusaadava edasise kerimise (kõrgemat järku superspiraali) abil, mis on ilmselt fikseeritud histoon Hi (ja mõnede mittehistooni valkude) abil. Interfaasile ülemineku ajal eukromatiin lõdveneb, kui mõned kõrgemat järku superspiraalid eralduvad. Tõenäoliselt toimub see histoonide konformatsiooniliste muutuste ja Hi molekulide vaheliste interaktsioonide nõrgenemise tagajärjel.Interfaasi ajal on näha ka 10-25 nm paksused kromatiini struktuurid (kromatiini põhiniidid ehk heliksid).

1. Kromatiini tüübid

2. Geenid, vahetükid

3. Nukleotiidide järjestus DNA-s

4. DNA ruumiline korraldus

1. Jagunemistoimingute vahelise puhkuse ajal jäävad teatud kromosoomilõigud ja terved kromosoomid kompaktseks. Neid kromatiini piirkondi nimetatakse heterokromatiin. See värvib hästi.

Kõige sagedamini tsentromeeris;

Kromosoomide otstes (sh satelliitidel);

Nucleoli korraldaja lähedal;

5S-RNA geeni lähedal.

Heterokromatiin, peamiselt fakultatiivne, võib interfaasi ajal ühineda intensiivselt värvunud kromotsentriks, mis enamikul juhtudel asub raku tuuma või tuuma serval.

Geenid on lineaarselt jaotunud piki seda topeltheeliksit, mis koos moodustavad kuni 25% DNA-st.

Geneon DNA funktsionaalne üksus, mis sisaldab teavet polüpeptiidi või RNA sünteesiks. Geeni keskmine pikkus on umbes 1000 aluspaari. Aluste järjestus igas geenis on ainulaadne.

Geenide vahel on vahetükid- erineva pikkusega (mõnikord üle 20 000 aluspaari) ebainformatiivsed DNA lõigud, mis on olulised naabergeeni transkriptsiooni reguleerimiseks.

Mittetranskripteeritavad vahetükid esinevad nii histoonide kui ka rRNA geenide vahel.

Üleliigsed geenid on esindatud suure hulga (kuni 10 4 või enama) ühesuguste koopiatega. See on geenid:

tRNA jaoks;

5S-RNA ja histoonid;

Toodete jaoks, mida sünteesitakse suurtes kogustes.

8 molekuli histoonid:

Kahe H3 ja kahe H4 molekuli keskne tetrameer; ja eraldi kaks H2a ja H2b;

DNA osa (umbes 140 aluspaari), mis moodustab ligikaudu 1,25 keerdu spiraalist ja on tihedalt seotud keskse tetrameeriga.

Nukleosoomide vahel on 30-100 aluspaarist koosneva spiraali lõigud, millel puudub superhelikaalne struktuur; Histoon seob siia Tere

Transkriptsiooniliselt aktiivne kromatiin – geenid, mis edastavad oma informatsiooni sünteesi teel RNA, edasise despiraliseerimise tulemusena lõdveneb veelgi. Mõnedel andmetel puudub DNA spiraali vastavates lõikudes histoon Hi või on see keemiliselt muudetud, näiteks fosforüülitud.

Nukleosoomi struktuur samuti muutub või hävib täielikult (r-RNA geenides tuumas). Topeltheeliks keerdub teatud kohtades lahti. Need protsessid hõlmavad ilmselt teatud mittehistooni valke, mis kogunevad DNA transkribeeritud piirkondadesse.

Küsimus 38. Kromosoomide komplekt

/. Genoom. Rakkude ploidsus

2. Polüteenkromosoomid

1. Iga raku tuuma kogu geneetilise teabe fond - genoom- jaotatud teatud konstantse arvu kromosoomide vahel (n). See arv on iga liigi või alamliigi jaoks spetsiifiline. Hobuste ümarusside puhul on see 1, maisil - 10, inimestel - 23, vetikatel Netrium digitus - umbes 600. Sama komplekti kromosoomid on erinevad vastavalt järgmistele kriteeriumidele:

suurus;

Kromomeetri pilt;

Kitsenduste asukoht;

Sõltuvalt sellest, kromosoomikomplekti paljusus - ploidsus- rakud jagunevad:

Haploidseks;

Diploid;

Polüploidne.

Haploidne nimetatakse rakkudeks, mis sisaldavad ühte kromosoomikomplekti (“), näiteks sugurakkudeks.

Kui rakud sisaldavad kahekordset kromosoomikomplekti (2 P), siis need diploidne, kuna geneetiline teave esitatakse neis kaks korda. Peaaegu kõik kõrgemate taimede ja loomade somaatilised rakud on diploidsed. Need sisaldavad ühte isa- ja ühte emapoolset kromosoomikomplekti.

IN polüploidne rakkudel on mitu kromosoomikomplekti (4 P, 8 P, 16 P jne). Need rakud on sageli eriti metaboolselt aktiivsed, näiteks paljud imetajate maksarakud.

Diploidsetest rakkudest tekivad meioosi tulemusena haploidsed rakud ja haploidsetest rakkudest viljastamise tulemusena diploidsed rakud.

Polüploidsed rakud tekivad diploidsetest endomitoosi kaudu – enneaegselt katkenud tuumajagunemine: pärast täielikku replikatsiooni ja kromatiidide eraldumist jäävad tütarkromosoomid ühte rakutuuma, selle asemel, et jaguneda kahe tuuma vahel. Seda protsessi saab korrata mitu korda.

Anomaaliad sugurakkude moodustumise ajal võib põhjustada kogu organismi polüploidsust. Kell mittetäielik replikatsioon Mõned genoomi osad, nagu heterokromatiin, ei replitseeru ja jäävad pärast endomitoosi diploidseks, erinevalt teistest osadest, mis muutuvad polüploidseks.

Geeni võimendamine - see on mitmekordne superreplikatsioon, kui ainult teatud geenid replitseeritakse ja muutuvad polüploidseks (rRNA geenid tuumas).

Kromosoomid diploidne tuum saab rühmitada paaridesse, kaheks homoloogseks kromosoomiks. Enamik neist (nn autosoomid) paarikaupa identsed. Ainult kaks sugukromosoomi, mis määravad isendi soo, ei ole meestel samad – need on X- ja Y-kromosoomid (heterokromosoomid). Suurema osa Y-kromosoomist hõivab konstitutiivne heterokromatiin. Naistel on kaks X-kromosoomi. Liblikate, lindude ja paljude teiste loomade puhul on aga olukord vastupidine: isastel on komplekt XX, emastel XY.

2. Polüteenkromosoomid(hiiglaslikud kromosoomid) sisaldavad kordades rohkem DNA-d kui tavalised. Nad ei muuda oma kuju kogu jagamistsükli jooksul ja ulatuvad kuni 0,5 mm pikkuseni ja paksuseni 25 mikronit. Neid leidub näiteks kahesilmaliste (kärbsed ja sääsed) süljenäärmetes, ripslaste makrotuumas ja ubade munasarjakudedes. Enamasti on need nähtavad haploidses numbris, kuna homoloogsed kromosoomid on omavahel tihedalt seotud. Polüteenia tekib endoreplikatsiooni tulemusena. Võrreldes endomitoosiga on see veelgi vähendatud jagunemisprotsess – pärast replikatsiooni kromatiidid ei eraldu (protsess kordub mitu korda). Kus erinevad DNA lõigud korrutatakse erineval määral:

Tsentromeeri alad - ebaolulised;

Enamik informatiivseid alasid on ligikaudu 1000 korda;

Mõned - rohkem kui 30 000 korda.

Sellepärast polüteenkromosoomid Need on kimbud lugematutest kromatiididest, mis ei ole täielikult eraldatud. Kromatiidid on venitatud, homoloogsed kromomeerid moodustavad tumedad kettad, mis paiknevad tihedalt piki kromosoomi. Neid plaate eraldavad heledamad triibud. Tõenäoliselt moodustub kromatiidil üks ketas ja üks vahepealne triip, lisaks speisserile üks geen (harvemini mitu geeni), mis ilmselt asub kettal. Polüteenkromosoomid on heterokromatiini suhtes äärmiselt vaesed.

Polüteenkromosoomidel eraldi kettad vahel paisuda puffid(Balbiani rõngad). Seal eralduvad homoloogsed kromatiidid üksteisest, homoloogsed kromomeerid eralduvad ja tekib transkriptsiooniliselt aktiivse kromatiini lahtine struktuur. Puffs sisaldab vähem histooni Hi kui kettad ja selle asemel sisaldavad ensüümi RNA polümeraas (mis näitab RNA sünteesi). Samuti on vahepealsetes ribades vähe histooni Hi, kuid seal on RNA polümeraas ja võib-olla toimub vähemalt väike süntees RNA.

Kromatiini preparaadis moodustab DNA tavaliselt 30-40%. See DNA on kaheahelaline spiraalne molekul. Kromatiini DNA molekulmass on 7-9*106. Sellist suhteliselt väikest DNA massi preparaatidest võib seletada DNA mehaanilise kahjustusega kromatiini eraldamise protsessis.

Rakkude tuumastruktuurides, organismide genoomis sisalduva DNA koguhulk on liigiti erinev. Kui võrrelda DNA kogust raku kohta eukarüootsetes organismides, on raske tuvastada mingit seost organismi keerukuse astme ja DNA koguse vahel tuuma kohta. Erinevatel organismidel, nagu lina, merisiilik, ahven (1,4-1,9 pg) või söel ja härjal (6,4 ja 7 pg), on ligikaudu sama palju DNA-d.

Mõne kahepaikse tuumas on 10–30 korda rohkem DNA-d kui inimese tuumades, kuigi inimese geneetiline ehitus on võrreldamatult keerulisem kui konnade oma. Sellest tulenevalt võib eeldada, et DNA “liigne” kogus madalamalt organiseeritud organismides kas ei ole seotud mingi geneetilise rolli täitmisega või kordub geenide arv mitu korda.

Satelliit-DNA või sageli korduvate järjestustega DNA osa võib olla seotud kromosoomide homoloogsete piirkondade äratundmisega meioosi ajal. Teiste eelduste kohaselt mängivad need piirkonnad kromosomaalse DNA erinevate funktsionaalsete üksuste vahel eraldajate (vahetükkide) rolli.

Nagu selgus, kuulub mõõdukalt korduvate (10 2 kuni 10 5 korda) järjestuste murdosa DNA piirkondade kirevasse klassi, millel on oluline roll metaboolsetes protsessides. See fraktsioon sisaldab ribosomaalseid DNA geene, korduvalt korduvaid sektsioone kõigi tRNA-de sünteesiks. Veelgi enam, mõningaid struktuurseid geene, mis vastutavad teatud valkude sünteesi eest, saab ka mitu korda korrata, mida esindavad paljud koopiad (kromatiini valkude geenid - histoonid).

Niisiis on eukarüootsete rakkude DNA koostiselt heterogeenne ja sisaldab mitmeid nukleotiidjärjestuste klasse:

sageli korduvad järjestused (>10 6 korda), mis sisalduvad satelliit-DNA fraktsioonis ja ei ole transkribeeritud;

murdosa mõõdukalt korduvatest järjestustest (10 2 -10 5), mis esindavad tõeliste geenide plokke, samuti lühikesi järjestusi, mis on hajutatud kogu genoomis;

unikaalsete järjestuste murdosa, mis kannab teavet enamiku rakuvalkude kohta.

Prokarüootse organismi DNA on üks hiiglaslik tsükliline molekul. Eukarüootsete kromosoomide DNA on lineaarsed molekulid, mis koosnevad tandemina (üksteise järel) paiknevatest erineva suurusega replikonitest. Replikoni keskmine suurus on umbes 30 mikronit. Seega peaks inimese genoom sisaldama üle 50 000 replikoni, DNA osa, mis sünteesitakse iseseisvate ühikutena. Nendel replikonitel on DNA sünteesi algus- ja lõpp-punkt.

Kujutagem ette, et eukarüootsetes rakkudes on iga kromosomaalne DNA, nagu bakterites, üks replikon. Sellisel juhul peaks sünteesikiirusel 0,5 mikronit minutis (inimeste puhul) esimese kromosoomi, mille DNA pikkus on umbes 7 cm, reduplikatsioon aega võtma 140 000 minutit ehk umbes kolm kuud. Tegelikult võtab kogu protsess DNA molekulide polüreplikonstruktuuri tõttu aega 7-12 tundi.

Histooni H1 eemaldamine transkriptsiooniliselt aktiivsest kromatiinist 1*2*. J. Bonneri (USA) varased katsed näitasid, et kromatiini DNA on palju halvem maatriks kui vaba DNA. Nende tähelepanekute põhjal on tehtud ettepanek, et histoonid on transkriptsiooni repressorid.

L. N. Ananyeva ja Yu. V. Kozlov Meie labor püüdis välja selgitada, kas kõigil histoonidel on inhibeeriv toime või ainult mõnel neist. Selleks eemaldati hiire Ehrlichi astsiidivähirakkude kromatiinist histoonid, ekstraheerides järk-järgult kasvavate kontsentratsioonidega NaCl lahustega. Saadud preparaadid toimisid RNA sünteesi mallina. Transkriptsioon viidi läbi Escherichia coli, E. coli RNA polümeraasi, mida võeti liias, ja nukleosiidtrifosfaatide segu juuresolekul. Vahemikus 0,4–0,6 M NaCl toimus materjali järsk dekondenseerumine, mis väljendus tuumageeli paisumises ja isegi DNP lahustumises (kui viidi läbi edasine mehaaniline töötlemine). Näidati, et see eemaldab selektiivselt histooni HI. Samaaegselt kromatiini dekondenseerumisega suurenes järsult selle maatriksi aktiivsus (joonis 26). Soola kontsentratsiooni edasine tõus ekstraheerimislahuses tõi kaasa teiste histoonide eemaldamise ja maatriksi aktiivsuse vähese, kuid mitte väga väljendunud täiendava suurenemise.

0 t. Seega näitab hübridiseeritavus korduvate järjestuste protsenti sünteesitud RNA-s (vastavalt L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlovi ja autori saadud tulemustele); b - RNA sünteesi peamised parameetrid erinevatel maatriksitel: vaba DNA, algne kromatiin (DNP 0) ja kromatiin, millest on 0,6 M NaCl-ga ekstraheerimisel eemaldatud histoon H1 (DNP 0,6). RNA süntees viidi läbi Escherichia coli RNA polümeraasi abil märgistatud nukleosiidtrifosfaatide: [14C]-ATP ja kas [y-32P]-ATP või [y-32P]-GTP juuresolekul. [14C]-UMP sisaldus kogu RNA-s ja [γ-32P] ainult ahela alguses (pp x A- või pp x G). Teisisõnu, [ 32 P] kaasamine andis teavet sünteesi initsiatsiooni kohta ja [ 14 C] - RNA sünteesi enda kohta. Mõnes katses lisati 3-4 minutit pärast inkubatsiooni algust söötmele antibiootikum rifampitsiin, mis takistas uute RNA ahelate initsiatsiooni, kuid ei mõjutanud juba alanud sünteesi ehk pikenemist. 1 - [14 C] lisamine - UMP, 2 - sama pärast rifampitsiini lisamist; 3 - [y-32P]-ATP + GTP kaasamine; 4 - sama pärast rifampitsiini lisamist. Nende kaasamiskõverate põhjal on võimalik välja arvutada RNA polümeraasi reaktsiooni peamised parameetrid (Yu. V. Kozlovi ja autori saadud tulemuste põhjal)">
Riis. 26. Histooni H1 mõju DNA matriitsi aktiivsusele kromatiinis. a - kromatiinist (1) valkude eemaldamise mõju viimase maatriksi aktiivsusele (2) Escherichia coli eksogeense RNA polümeraasi juuresolekul, samuti sünteesitud RNA hübridiseeritavusele (3). Histoonid ja mittehistooni valgud ekstraheeriti NaCl lahuste kasvavate kontsentratsioonidega. Vahemikus 0,4 M NaCl - 0,6 M NaCl eemaldati histoon H1 selektiivselt. Sünteesitud RNA hübridiseeriti liigse DNA-ga C0 t vahepealsete väärtuste juures. Seega näitab hübridiseeritavus korduvate järjestuste protsenti sünteesitud RNA-s (vastavalt L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlovi ja autori saadud tulemustele); b - RNA sünteesi peamised parameetrid erinevatel maatriksitel: vaba DNA, algne kromatiin (DNP 0) ja kromatiin, millest on 0,6 M NaCl-ga ekstraheerimisel eemaldatud histoon H1 (DNP 0,6). RNA süntees viidi läbi Escherichia coli RNA polümeraasi abil märgistatud nukleosiidtrifosfaatide: [14C]-UTP ja kas [y-32P]-ATP või [y-32P]-GTP juuresolekul. [14C]-UMP sisaldus kogu RNA-s ja [γ-32P] ainult ahela alguses (pp x A- või pp x G). Teisisõnu, [ 32 P] kaasamine andis teavet sünteesi initsiatsiooni kohta ja [ 14 C] - RNA sünteesi enda kohta. Mõnes katses lisati 3-4 minutit pärast inkubatsiooni algust söötmele antibiootikum rifampitsiin, mis takistas uute RNA ahelate initsiatsiooni, kuid ei mõjutanud juba alanud sünteesi ehk pikenemist. 1 - [14 C] lisamine - UMP, 2 - sama pärast rifampitsiini lisamist; 3 - [y-32P]-ATP + GTP kaasamine; 4 - sama pärast rifampitsiini lisamist. Nende kaasamiskõverate põhjal saab välja arvutada RNA polümeraasi reaktsiooni peamised parameetrid (Yu. V. Kozlovi ja autori saadud tulemuste põhjal)

Sünteesitava omadused in vitro RNA hübridisatsiooni teel kogu hiire DNA-ga. Sel juhul tuvastati korduvatel DNA järjestustel sünteesitud RNA fraktsioon. Selgus, et kromatiini puhul on korduvate DNA järjestuste transkriptsioon piiratud. Kuid pärast kromatiini ekstraheerimist 0,6 M NaCl-ga, kui histoon H1 eemaldati, muutusid sellise kromatiini maatriksil ja vaba DNA maatriksil sünteesitud RNA hübridisatsiooniomadused eristamatuteks. Esitasime hüpoteesi, et histoonid H2a, H2b, H3 ja H4 (mida nimetati siis erinevalt – mõõdukalt lüsiini- ja arginiinirikkad histoonid) ei osale transkriptsiooni pärssimises, vaid mängivad kromatiini organiseerimises puhtalt struktuurset rolli, samas kui histoon H1 (vanasti terminoloogia histoon, rikas lüsiini poolest) on RNA sünteesi inhibiitor. Samal ajal on see ka kromatiini kondenseerumist põhjustav tegur (vt eespool).

Hiljem uuris Yu. V. Kozlov histooni H1 transkriptsiooni pärssimise mehhanismi, taaskord rakuvaba süsteemiga E, coli-st eraldatud RNA polümeraasiga. Uuriti histooni H1 mõju initsiatsiooni- ja elongatsiooniprotsessidele (vt joonis 26, tabel 4). Selgus, et see vähendab mitu korda natiivsel kromatiini maatriksil algatatud RNA ahelate arvu. Eriti järsult on pikenemine pärsitud: RNA polümeraas ei loe rohkem kui 100-150 bp. DNA ja siis peatub. Samal ajal loeb RNA polümeraas kromatiinil, millest on eemaldatud histoon H1, mitu tuhat nukleotiidipaari korraga ja ahelate pikkus ei erine vabal DNA matriitsil sünteesitud ahelate pikkusest. Tõsi, vabal DNA-l, võrreldes kromatiiniga, millest on eemaldatud histoon H1, toimuvad RNA sünteesi initsiatsiooniprotsessid tõhusamalt. Jõuti järeldusele, et histoon H1 tekitab kromatiini kondenseerumisel takistusi RNA polümeraasi teel ja peatab seeläbi RNA sünteesi.

* (DNPM on uureaga töötlemisega eraldatud DNP, mis on täielikult solubiliseeritud, kuid säilitab histooni H1.)

Võttes arvesse kaasaegseid andmeid 300 A-DNP fibrilli solenoidstruktuuri kohta, mis sõltub histooni H1 olemasolust, on see tulemus kergesti seletatav. Tõepoolest, RNA polümeraas ei saa solenoidist ilmselt lugeda rohkem kui 100 aluspaari. puhtalt topoloogiliste piirangute tõttu.

Meie hüpoteesi kohaselt tuleks geeni aktiveerimisel histoon H1 eemaldada. Seda ei olnud aga toona võimalik kontrollida. Alles suhteliselt hiljuti on ilmnenud tõendeid histooni H1 kadumise kohta kromatiinist geeni aktiveerimise ajal. Seega, kui paljudest organismidest eraldati aktiivselt transkribeeritud kromatiini piirkondi, näiteks mini-nukleoole, ei tuvastatud neis histooni H1. Seda ei leidu ka pärmis, kus kõik geenid on potentsiaalselt aktiivsed.

Laboris saadi veenvad tulemused A. D. Mirzabekova V. L. Karpov ja O. V. Preobraženskaja. Nad töötasid välja meetodi, mida nimetatakse "histooni varjuhübridisatsiooniks". Selleks ristseoti DNA histoonidega, kasutades dimetüülsulfaati tingimustes, kus keskmiselt on üks histooni molekul ristseotud umbes 200-300 bp pikkuse DNA segmendi kohta. Seejärel DNA fragmenteeriti ja viidi läbi kahemõõtmeline naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforees. Pärast esimeses suunas jooksmist hävitati proteinaasi toimel DNA-le kinnitunud histoonid ja teises suunas kiirendati juba vaba DNA-d. Kuna esimeses elektroforeesivoorus aeglustasid erinevad histoonid DNA fragmentide liikumist erineval viisil, ilmnes pärast teist jooksu mitu diagonaali (joonis 27). Tavaliselt on kolm selgelt nähtavad: üks vastab algselt vabale DNA-le, teine algsetele DNA kompleksidele tuuma histoonidega ja kolmas (alumine) algsele DNA kompleksile histooniga H1. Saadud DNA kantakse filtrisse ja hübridiseeritakse konkreetse prooviga. Kui hübridiseerimiseks võeti genoomi inaktiivne piirkond, näiteks Drosophila ribosomaalse geeni speisser, siis seostati märgis kõigi diagonaalidega. Kui aga proovina kasutati kuumašoki geeni, mis transkribeeriti rakkudes, millest kromatiin eraldati, siis hübridisatsioon diagonaaliga, mis vastab DNA kompleksidele histooni H1-ga, oli järsult nõrgenenud või puudus täielikult. Teisisõnu, tuumades ei olnud transkribeeritud geeni DNA-l enne kinnitumist kontakti histooniga H1.

Riis. 27. Histooni H1 ja tuuma histoonide kadu transkriptsiooni aktiveerimisel. Katsed viidi läbi D. melanogasteri kultuurirakkudega (a, b) kultiveerimistingimustes 25° (a) ja kuumašoki (b) tingimustes. Juhul a ei avaldu kuumašoki geenid, juhul b on see väga aktiivne. Lisaks viidi läbi katsed dekoorioniseeritud embrüotega (c), kus kuumašoki geenide ekspressioon on keskmisel tasemel. Pärast DNA-valgu komplekside moodustumist, DNA fragmentide eraldamist, nende kahemõõtmelist eraldamist (vertikaalses suunas pärast valgu eemaldamist) ja filtrisse ülekandmist hübridiseeriti samad filtrid erinevate proovidega: reguleerimispiirkonnaga. p70 kuumašoki geen (HS-5") ; sama geeni kodeeriva piirkonnaga (TS-kood); rDNA geeni transkriptsiooniliselt inaktiivse insertsiooni prooviga (inaktiivne). Inaktiivses geenis on näha kolm diagonaali 1 - vaba DNA, 2 - DNA kompleksid oktameeride histoonidega; 3 - DNA kompleksid histooniga H1. Nähtav on DNA-histooni komplekside nõrgenemine või kadumine kromatiini aktiveerimisel (vastavalt A. D. Mirzabekovi jt tulemustele)

Kuigi kõik praegu saadaolevad andmed eraldi võetuna võimaldavad teisi tõlgendusi, annavad need koos tugevaid tõendeid histooni H1 eemaldamise kasuks aktiivsest kromatiinist. Selle protsessi mehhanism on aga endiselt täiesti ebaselge.

Nukleosoomide saatus kromatiini aktiveerimise ajal 2* [ 154-157]. Vähem selge on küsimus histoonide H2a, H2b, H3 ja H4 saatusest, mis moodustavad nukleosoomi tuuma. Ülaltoodud katsetes Yu. V. Kozlova nende olemasolu ei avaldanud praktiliselt mingit mõju DNA transkriptsioonile RNA polümeraasi poolt E. coli. Eukarüootse kromatiini hüdrolüüsi saadusi uurides leidsid paljud autorid, et nukleosoomid sisaldavad aktiivsete geenide DNA-d, st viimased on samuti organiseeritud nukleosoomideks. Andmed on saadud suurest katsematerjalist A. D. Mirzabekova et al. näitavad, et aktiivselt transkribeeritud DNA-d sisaldavad nukleosoomid on põhimõtteliselt konstrueeritud samamoodi nagu inaktiivset DNA-d sisaldavad nukleosoomid, kuigi mõned DNA-histooni kontaktid neis on muutunud.

Samuti viidi läbi katseid hübridiseerimisel histooni varjudega, millest oli juttu eelmises osas (vt joonis 27). Drosophila rakkudest valmistati diagonaalidega preparaadid, milles kuumašoki geenid kas üldse ei töötanud, see tähendab, et need olid välja lülitatud või töötasid madalal tasemel, või lõpuks stimuleeriti neid kuumašokiga aktiivseks transkriptsiooniks. Kõigil juhtudel oli kontrollprooviks ribosomaalse geeni vahetüki DNA, mis hübridiseerus kõigis kolmes diagonaalis, kaasa arvatud diagonaalis, mis tulenes DNA kompleksidest tuuma histoonidega.

Kuumašoki geen hübridiseerus normaalselt ka selle diagonaaliga rakkudest, kus seda ei transkribeeritud. Kuid soojusšoki geeni mõõduka transkriptsiooniga rakkudest saadud materjaliga vähenes teise diagonaali hübridisatsioon oluliselt. Lõpuks, kui diagonaalid saadi kuumašoki mRNA väga aktiivse sünteesiga rakkudest, siis teist diagonaali ei olnud hübridisatsiooni ajal üldse näha (nagu ka kolmas) ja selgus ainult diagonaal, mis vastas DNA-le, mis ei olnud ristseotud. histoonidega.Üldine järeldus, mis tehti uuringutest, milles kasutati DNA-valgu ristsidumise meetodit, et transkriptsiooni käigus põrkab mööda DNA ahelat liikuv RNA polümeraas pöörduvalt kokku nukleosoomid DNA-ga ja transkribeerib praktiliselt palja DNA. Kui transkriptsioonitase on madal ja RNA polümeraase roomab vähe mööda DNA-d, siis on nukleosoomidel aega uuesti moodustuda piirkonnas, millest RNA polümeraas on juba läbi käinud. Kui transkriptsioon on aktiivne, ei ole DNA nukleosomaalsel struktuuril aega taastuda ja DNA-s puuduvad üldiselt histoonid. Samal ajal oletatakse, et nukleosoomide korraldus aktiivses kromatiinis praktiliselt ei erine mitteaktiivse kromatiini omast. Hiljuti A.D. Mirzabekov jt. reprodutseeris katseid histoonide DNA-ga kinnitamiseks, kasutades teistsugust meetodit, töödeldes eraldatud tuumasid plaatinapreparaatidega. See meetod on leebem kui dimetüülsulfaat. Põhimõtteliselt saadi samad tulemused.

Selle andmehulga kõrval on ka uuringuid, milles autorid jõuavad veidi erinevatele järeldustele. W. Garrard ja A. Worsel(USA), uurides nukleaasi hüdrolüüsi ja elektronmikroskoopia abil kromatiini aktiivsete geenide seisundit, jõudis järeldusele, et nukleosoomid jäävad aktiivsesse kromatiini, kuid läbivad struktuurseid muutusi, näiteks pöörduvad ümber, muutuvad poolnukleosoomideks. Selle tulemusena on mikrokoki nukleaasiga hüdrolüsaatide elektroferogrammides perioodilisus ~200 aluspaari. asendatakse perioodilisusega ~100 bp. Elektronmikroskoopiaga helmeste arv kahekordistub ja nende suurus väheneb. Eeldatakse, et RNA polümeraas suudab selliseid voltimata nukleosoome läbida.

Seda võimalust toetavad ka saadud andmed T. Koller(Šveits). Ta töötas välja originaalse meetodi nukleosoomide uurimiseks. Rakke töödeldakse psoraleeniga, ainega, mis seondub DNA-ga ja seejärel ristseob kaks DNA ahelat UV-valgusega. Kui aga DNA on osa nukleosoomidest, siis selle reaktsiooni psoraleeniga ei toimu. Seega, kui töödeldud rakkudest eraldatud DNA denatureeritakse formaldehüüdi juuresolekul (see takistab DNA renatureerumist), siis elektronmikroskoopias vahelduvad mullid (kaks denatureeritud DNA ahelat), mis vastavad nukleosoomidele, mis on omavahel ühendatud üksikute ahelatega (rist). -seotud, ei ole võimelised denatureerima) on DNA-l nähtavad. DNA) mis vastavad nukleosoomidevahelistele linkeritele. Esiteks uuriti aktiivselt transkribeeritud ribosomaalseid RNA geene, mis on osa ekstrakromosomaalsetest struktuuridest ja on seetõttu elektronmikroskoopia abil kergesti analüüsitavad. Nendes ei ole nukleosoomidele vastavad vesiikulid nähtavad, st suure tõenäosusega eemaldatakse histoonid transkribeeritud piirkondadest täielikult. Huvitav on see, et transkribeerimata piirkondades on vahetükid, DNA mullid (nukleosoomid) selgelt nähtavad.

Erinevad tulemused saadi aga SV40 minikromosoomide puhul, mida transkribeerib pigem RNA polümeraas II kui RNA polümeraas I, nagu ribosomaalsed RNA geenid (joonis 28). Transkriptsiooniliselt aktiivsed minikromosoomid tuvastatakse nende kasvavate RNA ahelate (tavaliselt üks või kaks) tõttu. Sellised minikromosoomid moodustavad 1-2% kõigist rakust eraldatud minikromosoomidest. Need sisaldavad aga sama palju vesiikuleid kui inaktiivsed minikromosoomid ja nende suurus on mõlemal juhul sama. Kõige huvitavam on see, et RNA ahelad ulatuvad nii linkeritest kui ka otse vesiikulitest, st RNA polümeraas transkribeerib ilmselt nukleosoome. Need andmed toetavad nukleosoomide lahtivoltimist ja nende transkriptsiooni RNA polümeraasi poolt.

Kõik ülaltoodud tulemused ei ole otsesed ja seetõttu peaksid tulevased katsed andma lõpliku lahenduse nukleosoomide saatuse küsimusele transkriptsiooni ajal.

Histooni modifikatsioon ja histooni variandid: seos aktiivse kromatiiniga. Allfrey (USA) näitas 60ndate alguses, et histoonid võivad läbida mitmesuguseid modifikatsioone. Seega on histoon HI fosforüülitud lüsiinide ε-aminorühmades. Histoonid H3 ja H4 on atsetüülitud samadel rühmadel. On mitmeid teisi modifikatsioone (metüülimine, ADP - ribosüülimine, ubikvitineerimine jne).

Kohe eeldati, et histoonide ensümaatilised modifikatsioonid võivad mõjutada kromatiini struktuuri ja selle aktiivsust. Tõepoolest, lüsiini fosforüülimisel asendub histooni üks positiivne laeng negatiivsega, ahvatlemisel kaob positiivne laeng jne. Just tänu sellistele laengumuutustele saab modifitseeritud histoone teostamisel eraldada modifitseerimata omadest. geelelektroforees atsetaatpuhvris uureaga. Seega annab histoon H4 kõrge eraldusvõimega elektroforeesis mitte ühe, vaid neli riba, mis vastavad molekulidele, mis ei ole atsetüülitud ja atsetüülitud ühes, kahes ja kolmes lüsiinijäägis. Erinevates kudedes fraktsioonide suhe muutub. Histoonid H3, H2a, H2b ja H1 jagunevad mitmeks fraktsiooniks (erinevad atsetüülimise ja fosforüülimise astmed).

Kahjuks puuduvad siiani head meetodid transkriptsiooniliselt aktiivse ja inaktiivse kromatiini eraldamiseks ning seetõttu on muutunud histooni vorme raske ühele või teisele kromatiini olekule omistada. Kõige huvitavamad andmed selles suunas saadi sama W. Alfrey(USA). Aktiivse kromatiini hüdrolüüsi käigus eraldas ta ebaharilikke osakesi, mis settisid sahharoosigradiendis aeglasemalt kui tavalised nukleosoomid ja autori arvates vastasid voltimata nukleosoomidele. Need osakesed, mida nimetatakse A-osakesteks, sisaldasid kõiki histoone. Erinevalt tavalistest nukleosoomidest olid A osakestes olevad histooni H3 SH-rühmad juurdepääsetavad paljudele keemilistele reaktiividele ja seetõttu sai A-osakesi nukleosoomidest eraldada fraktsioneerimise teel kloromercuribensoaadi kolonnidel (SH rühma siduv reagent). A-osakesed sisaldavad suurenenud histoonide atsetüülitud vormide sisaldust. Autor viitab sellele, et histooni atsetüülimine kromatiini aktiveerimisel viib nukleosomaalsete osakeste lahtirullumiseni ja see omakorda suurendab histooni H3 SH-rühmade kättesaadavust.

Mõned histoonid on kodeeritud rohkem kui ühe geenitüübi poolt. Selle tulemusena on nendel histoonidel mitu varianti, mis erinevad oma aminohappejärjestuse poolest veidi. Mõnikord toimub ontogeneesi protsessis ühe histooni alamklassi loomulik asendamine teisega. Siiski jääb ebaselgeks, kas sellel on regulatiivset tähtsust. Ilmselt saab probleemi lahendada ka pärast sobivate meetodite väljatöötamist transkriptsiooniliselt aktiivse kromatiini eraldamiseks.

Erilise positsiooni hõivab histoon H1. Selle jaoks on valikuid, mis erinevad järsult oma struktuurilise korralduse poolest. See valik on näiteks histoon H5, mis asendab olulise osa histoonist H1 lindude erütrotsüütide tuumades. Suure tõenäosusega on see asendus oluline tegur transkriptsiooni täielikul väljalülitamisel erütrotsüütide tuumades. Normaalsetes rakkudes on histooni H1 variant - histoon H1 0. Selle sisaldus moodustab väikese osa histooni H1 koguhulgast. On mitmeid vastuolulisi andmeid, et H1 0 on seotud aktiivsete geenidega või vastupidi, stabiilselt välja lülitatud geenidega. Küsimus jääb lahtiseks.

HMG valgud võivad olla seotud aktiivse kromatiini organiseerimisega 1*. Lisaks histoonidele sisaldab kromatiin palju mittehistoonvalke, mille funktsioon on teadmata. Ilmselgelt peaksid nende hulgas olema struktuurvalgud, replikatsiooni-, transkriptsiooni- jne protsesse tagavad ensüümid ning regulaatorvalgud. E. Jones(Suurbritannia) püüdsid eraldada piisavalt suurtes kogustes esinevaid valgukomponente, et võimaldada nende analüüsimist ja tuvastamist. Tal õnnestus tegelikult isoleerida uus klass tuumavalke, mida ta nimetas "suure liikuvusega valkude rühmaks" ( suure liikuvusega rühm) või HMG valgud. Nimetus sõltus nende valkude suurest liikuvusest geelelektroforeesi ajal. HMG valgufraktsioon laguneb mitmeks üksikuks komponendiks. Nende hulgas on kõige tüüpilisemad ja paremini iseloomustatud HMG-1, HMG-2, HMG-14 ja HMG-17.

HMG valkudel on madal molekulmass. Neid on rikastatud nii aluseliste kui ka dikarboksüülaminohapetega. HMG valkude sisaldus on ligikaudu 7% histoonide sisaldusest. See võib eri tüüpi rakkude tuumades erineda. Selles kontekstis huvitavad meid kõige rohkem valgud HMG-14 ja HMG-17, mille kohta on saadud tõendeid võimaliku rolli kohta transkriptsiooni aktiveerimisel. H. Weintraub(USA) näitas, et tuuma ekstraheerimine 0,35 M NaCl-ga, mis ekstraheerib HMG valke, muudab aktiivse kromatiini mõningaid omadusi, mis taastuvad, kui kromatiinile lisada HMG-14 ja HMG-17. G. Dixon(Kanada) avastas need valgud kromatiinist nukleaasi poolt hüdrolüüsi varases staadiumis vabanenud nukleosoomide koostises, mis tema andmetel olid rikastatud tõmbeaktiivsete geenide DNA-ga.

lõpeb [32 P] ja seejärel hübridiseeritakse L-rakkude hnRNA-ga. Hübriidid tuvastati geelfiltrimisega. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - raku kogu DNA (vastavalt V.V. Bakaevi jt tulemustele)">
Riis. 29. HMG valkude (14 ja 17) võimalik seos aktiivse kromatiiniga. a - subnukleosoomide tuvastamine kromatiini hüdrolüsaatides mikrokoki nukleaasi abil. Hüdrolüüsi erinevatel etappidel ilmnevad teatud subnukleosoomide fraktsioonid. Elektroforees viidi läbi polüakrüülamiidgeelis mittedenatureerivates tingimustes. Värvimine etiidiumbromiidiga, fluorograafia parempoolses kolonnis; b - kahemõõtmelise elektroforeesi kasutamine CH2 ja CH3 subnukleosoomide valgu koostise määramiseks. [14 C] valguga märgistatud kromatiin hüdrolüüsiti mikrokoki nukleaasiga ja eraldati kahedimensioonilise elektroforeesiga (1. suund - mittedissotsieeruv sööde, 2. suund - naatriumdodetsüülsulfaadi lahus), misjärel teostati valkude tuvastamiseks autoradiograafia. Tähed tähistavad HMG valke, mida ei olnud katse ajal veel identifitseeritud teadaolevatega. Nüüd teame, et A on HMG-1, B on HMG-2, E on HMG-14, G on HMG-17, HMG valgud F ja H pole selgelt identifitseeritud, tõenäoliselt vastab H ka HMG-17-le. On näha, et HMG valgud on osa mononukleosoomidest (MH-2 ja MH-3) ning subnukleosoomidest CH-2 (HMG-17) ja CH-3 (HMG-14); c - CH-2 ja CH-3 transkribeeritud järjestuste DNA rikastamise demonstreerimine. L-rakkude CH-2 ja CH-3 ribadest eraldatud DNA märgistati 5" otstes [32 P] ja seejärel hübridiseeriti L-rakkude hnRNA-ga. Hübriidid tuvastati geelfiltrimisega. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - raku kogu DNA (vastavalt V. V. Bakaevi jt tulemustele)

V. V. Bakaev meie laboris jõudis teistsuguse eksperimentaalse lähenemisviisi abil järeldusele HMG valkude rolli kohta transkriptsioonis. Kromatiini hüdrolüsaatide elektroforeetilise analüüsi käigus avastas ta lisaks nukleosoomidele ja oligonukleosoomidele ka väiksemaid suurema liikuvusega komponente. Neid nimetati subnukleosoomideks ja need olid ilmselgelt nukleosoomi edasise lagunemise saadused (joonis 29, tabel 5). Subnukleosoom CH-7 vastas nukleosoomile, mis oli kaotanud ühe molekuli H2a ja H2b ning sisaldas 40 aluspaari võrra lühendatud DNA-d; CH-6 vastas 30–40 aluspaari pikkusele DNA kompleksile. histooniga H1, mis eraldub MH-2-st selle muundumisel MH-1-ks. CH-4 sisaldas DNA segmenti ja histoonide paari H2a ja H2b (reaktsiooni MH-1 → CH-7 → CH-4 saadus). Kaks subnukleosoomi, CH-3 ja CH-2, koosnesid lühikesest DNA-st ja HMG-valkudest (HMG-14 ja HMG-17). Võib eeldada, et need on HMG-14 ja HMG-17 valkudega seotud linkerpiirkonnad, mis vastavate nukleosoomide seedimisel lahustuvad. CH-2 ja CH-3 koguti, nendest eraldati DNA, märgistati ots ja uuriti selle hübridisatsiooni tuuma RNA-ga. Selgus, et CH-2 ja CH-3 DNA hübridiseerub tuuma RNA-ga palju tõhusamalt kui sama suurusega fragmenteeritud raku kogu DNA.

Seetõttu jõuti järeldusele, et HMG-14 ja HMG-17 valkudega seotud DNA pärines tõenäoliselt transkriptsiooniliselt aktiivsest kromatiinist.

Kõik need sõltumatult saadud andmed viitasid sellele, et HMG-14 ja HMG-17 on kuidagi seotud geenide aktiveerimisega. Aktiveerimismehhanism oli aga täiesti ebaselge. HMG-14 ja HMG-17 ei saa olla peamised geeni sisselülitavad tegurid, kuna neil puudub spetsiifilisus. Võib arvata, et nad on seotud aktiivse kromatiini "avatud konformatsiooni" säilitamisega.

Järgnevatel aastatel ilmnes skeptitsism HMG-14 ja HMG-17 rolli suhtes kromatiini aktiveerimisel. Eelkõige hiljuti A. D. Mirzabekov et al. kasutades valgukudedega hübridisatsiooni meetodit, saime andmeid HMG-14 ja HMG-17 aktiivse kromatiini ammendumise kohta. Kuna aga kõik ülaltoodud andmed on kaudsed, jääb HMG-valkude rolli küsimus üldiselt lahtiseks ja vajab täiendavat uurimist.

Topoisomeraas I ja DNA-ga tihedalt seotud valgud on osa transkriptsiooniliselt aktiivsest kromatiinist 1*. S. Elgin (USA), millele järgnesid mitmed teised autorid, näitasid, et transkriptsiooniliselt aktiivne kromatiin sisaldab topoisomeraas I – ensüümi, mis lõdvestab ülikeerdunud DNA-d. Seda demonstreeriti esmakordselt Drosophila polüteenkromosoomide tsütoloogilistel preparaatidel, kasutades topoisomeraas I vastaseid fluorestseeruvaid antikehi. See ensüüm viib DNA-sse üheahelalise katkestuse ja seostub kovalentselt DNA 5-tollise otsaga. See võimaldab DNA-l vabalt pöörlema murdekoht. Seejärel lõigatakse fragment ära ja taastatakse fosfodiesterside DNA-s. Molekulmassi poolest on topoisomeraas I ehk lühidalt topo I heterogeenne. Raskeim komponent on molekulmassiga 135 kDa ja kõige rikkalikumalt esindatud - 80 kDa. Kui see lõhustatakse proteinaaside poolt, moodustuvad lühemad polüpeptiidid, mis siiski säilitavad ensümaatilise aktiivsuse.

Antibiootikum kaptotetsiin on topo I inhibiitor ja sellega rakkude töötlemisel moodustab ensüüm DNA-ga kovalentseid ristsidemeid kohas, kus see oli antibiootikumiga kokkupuute ajal. Selliste ristsidemete asukohta saab hõlpsasti määrata hübridisatsioonimärgise kaardistamise teel. Sel moel avastati, et topo I esineb eranditult genoomi transkribeeritud piirkondades, st suure tõenäosusega töötab see koostöös RNA polümeraas II-ga, eemaldades transkriptsiooni käigus tekkivad lokaalsed DNA keerdumised.

Teine genoomi transkribeeritud piirkondades tuvastatud valgukomponent on DNA-ga tihedalt seotud valkude kogum (DBP), mis vastab raku transkribeeritud DNA-le (vt jaotis 3.4).

S. V. Razin ja V. V. Tšernohvostov PBP-ga DNA komplekse üritati üksikasjalikult iseloomustada. PBP-ga seotud 1–2 kb pikkused DNA fragmendid puhastati ja allutati tasakaalustatud ultratsentrifuugimisele CsCl tihedusgradiendis. Nende ujuvustihedus osutus võrdseks 1,7 g/cm3, st see vastas valku mitte sisaldava vaba DNA ujuvtihedusele. Selle paradoksi selgitamiseks kavandatud katsetes leiti, et ravi DRNaasiga viib komplekside ujuvustiheduse vähenemiseni. 1,62-1,65 g/cm3. Ligikaudsed arvutused valgu tiheduse põhjal ( ~ 1,3 g/cm3) ja RNA ( ~ 1,9 g/cm3), (näidake, et iga DNA molekuli jaoks on umbes 150 kDa valku ja umbes 200 nukleotiidi RNA-d. Selle RNA olemus on ebaselge, kuid on saadud tõendeid selle homogeensuse ja ainulaadse nukleotiidjärjestuse kohta.

Seega jääb palju DNA-PBP kompleksidest salapäraseks, kuid suure tõenäosusega mängivad nad olulist rolli transkriptsioonimasinate korraldamisel. Nende uurimine on praegu pooleli.

DNA demetüleerimine transkribeeritud geenides 2*. Aktiivse kromatiini teine oluline tunnus on teatud DNA lõikude demetüleerimine. Inaktiivsetes geenides on enamik CG järjestuste tsütidüüljääke metüülitud. Esiteks B. V. Vanjušin laboris A. N. Belozersky demonstreeriti, et sama looma erinevates kudedes olev DNA erineb C metüülimise taseme poolest.Selle põhjal tehti ettepanek, et metüülimisel võib olla diferentseerumist reguleeriv roll. Hiljem näitasid paljud autorid, et mõned transkribeeritud DNA piirkonnad on alametüleeritud. Kõige laialdasemalt kasutatav analüüsimeetod on restriktsioonikaartide võrdlemine, mis on saadud restriktsiooniensüümidega, mis tunnevad ära sama järjestuse, nagu CGCG või CCGG, kuid millel on erinev metüülimise tundlikkus. Üks restriktsiooniensüümidest lõikab nii metüleeritud kui ka metüleerimata järjestusi ja teine lõikab ainult metüleerimata järjestusi. Tavaliselt paiknevad metüleerimata järjestused geeni regulatoorses piirkonnas. Geeni enda piirkond, seda kodeeriv osa ja intronid on võrdselt metüleeritud nii töö- kui ka vaikivates geenides.

Metüleeritud DNA sisestamisel rakkudesse väheneb selle ekspressioon rakus oluliselt võrreldes metüleerimata DNA-ga. On saadud andmed, mille järgi DNA replikatsiooni käigus taastoodetakse DNA metüülimise olek: kui üks ahelatest on metüleeritud, siis metüleeritakse samas kohas ka vastmoodustunud ahel.

Korraga tundus, et tsütidiini metüülimine-demetüleerimine regulatoorse piirkonna CG järjestustes on geenide inaktiveerimise-aktiveerimise peamine mehhanism. Hiljuti on aga ilmunud mitmeid andmeid, mis on selle hüpoteesiga vastuolus. Seega ekspresseeritakse aktiivselt täielikult CG-ga metüleeritud SV40 DNA-d. Samal ajal ei tuvastata Drosophila DNA-s metüültsütosiini üldse. Võimalik, et C demetüleerimine on geeni aktiveerimise tagajärg ja ainult põlistab transkriptsioonilise aktiivsuse seisundit. Siin, nagu ka teistes geenide aktiveerimise uurimise valdkondades, on vaja uusi katseid.