Хроматин: определение, структура и роля в клетъчното делене. Три фракции на еукариотната ДНК, тяхната локализация в хромозомите и функции Структурни и функционални компоненти на хроматина

Хроматинът, основният компонент на клетъчното ядро, се получава доста лесно от изолирани интерфазни ядра и от изолирани митотични хромозоми. За да направят това, те използват способността му да преминава в разтворено състояние по време на екстракция с водни разтвори с ниска йонна сила или просто дейонизирана вода. В този случай участъци от хроматин набъбват и се превръщат в гел. За да се превърнат такива лекарства в истински разтвори, са необходими силни механични въздействия: разклащане, разбъркване, допълнителна хомогенизация. Това, разбира се, води до частично разрушаване на оригиналната структура на хроматина, раздробяването му на малки фрагменти, но практически не променя химичния му състав.

Хроматиновите фракции, получени от различни обекти, имат доста еднакъв набор от компоненти. Установено е, че общият химичен състав на хроматина от интерфазните ядра и митотичните хромозоми се различават малко един от друг. Основните компоненти на хроматина са ДНК и протеини, по-голямата част от които са хистони и нехистонови протеини (вижте таблица 3).

Таблица 3.Химичен състав на хроматина. Съдържанието на протеин и РНК е дадено спрямо ДНК

Средно около 40% от хроматина е ДНК и около 60% са протеини, включително специфични ядрени протеини - хистони, съставляват от 40 до 80% от всички протеини, които изграждат изолирания хроматин. Освен това хроматиновата фракция включва мембранни компоненти, РНК, въглехидрати, липиди и гликопротеини. Въпросът доколко тези второстепенни компоненти са включени в структурата на хроматина все още не е разрешен. Така, например, РНК може да бъде транскрибирана РНК, която все още не е загубила връзката си с ДНК шаблона. Други второстепенни компоненти могат да представляват вещества от коутаени фрагменти от ядрената мембрана.

Структурно, хроматинът е нишковиден комплекс от дезоксирибонуклеопротеинови (DNP) молекули, които се състоят от ДНК, свързана с хистони (виж Фиг. 57). Следователно друго име за хроматин се е вкоренило - нуклеохистон. Благодарение на свързването на хистоните с ДНК се образуват много лабилни, вариабилни комплекси нуклеинова киселина-хистон, където съотношението ДНК:хистон е приблизително едно, т.е. те присъстват в равни тегловни количества. Тези нишковидни DNP фибрили са елементарни хромозомни или хроматинови нишки, чиято дебелина, в зависимост от степента на пакетиране на ДНК, може да варира от 10 до 30 nm. Тези DNP фибрили могат от своя страна да бъдат допълнително уплътнени, за да образуват по-високи нива на DNP структуриране, до митотичната хромозома. Ролята на някои нехистонови протеини е именно в образуването на високи нива на уплътняване на хроматина.

ДНК хроматин

В хроматиновия препарат ДНК обикновено представлява 30-40%. Тази ДНК е двуверижна спирална молекула, подобна на чистата изолирана ДНК във водни разтвори. Това се доказва от много експериментални данни. По този начин, когато разтворите на хроматин се нагряват, се наблюдава повишаване на оптичната плътност на разтвора, така нареченият хиперхромен ефект, свързан с разкъсването на междунуклеотидните водородни връзки между ДНК веригите, подобно на това, което се случва, когато чистата ДНК се нагрява (стопи) .

Въпросът за размера и дължината на ДНК молекулите в хроматина е важен за разбирането на структурата на хромозомата като цяло. Използвайки стандартни методи за изолиране на ДНК, хроматинът има молекулно тегло 7-9 x 10 6, което е значително по-малко от молекулното тегло на ДНК от Escherichia coli (2,8 x 10 9). Такова относително ниско молекулно тегло на ДНК от хроматинови препарати може да се обясни с механично увреждане на ДНК по време на процеса на изолиране на хроматин. Ако ДНК се изолира при условия, които изключват разклащане, хомогенизиране и други влияния, е възможно да се получат много дълги ДНК молекули от клетките. Дължината на ДНК молекулите от ядрата и хромозомите на еукариотните клетки може да бъде изследвана с помощта на метода на светлинно-оптична авторадиография, точно както беше изследвано върху прокариотни клетки.

Установено е, че в рамките на хромозомите дължината на отделните линейни (за разлика от прокариотните хромозоми) ДНК молекули може да достигне стотици микрометри и дори няколко сантиметра. По този начин от различни обекти са получени ДНК молекули с размери от 0,5 мм до 2 см. Тези резултати показват, че има тясно съответствие между изчислената дължина на ДНК на хромозома и авторадиографското наблюдение.

След лек лизис на еукариотни клетки, молекулните тегла на ДНК могат да бъдат директно определени чрез физикохимични методи. Доказано е, че максималното молекулно тегло на ДНК молекула на Drosophila е 41 x 10 9, което съответства на дължина от около 2 см. При някои дрожди има ДНК молекула на хромозома с молекулно тегло 1 x 10 8 -10 9, което е с размери около 0,5 mm.

Такава дълга ДНК е една единствена молекула, а не няколко по-къси, зашити заедно в един файл с помощта на протеинови връзки, както смятат някои изследователи. До този извод се стигна, след като се оказа, че дължината на ДНК молекулите не се променя след третиране на лекарства с протеолитични ензими.

Общото количество ДНК, включено в ядрените структури на клетките, в генома на организмите, варира от вид на вид, въпреки че при микроорганизмите количеството ДНК на клетка е значително по-ниско, отколкото при безгръбначните, висшите растения и животните. Така една мишка има почти 600 пъти повече ДНК на ядро от Е. coli. Когато се сравнява количеството ДНК на клетка в еукариотните организми, е трудно да се установи някаква връзка между степента на сложност на организма и количеството ДНК на ядро. Такива различни организми като лен, морски таралеж, костур (1,4-1,9 pg) или овъглен и бик (6,4 и 7 pg) имат приблизително еднакво количество ДНК.

Има значителни колебания в количеството на ДНК в големи таксономични групи. Сред висшите растения количеството на ДНК в различните видове може да се различава стотици пъти, точно както сред рибите количеството на ДНК в земноводните се различава десетки пъти.

Някои земноводни имат 10-30 пъти повече ДНК в ядрата си, отколкото в човешките ядра, въпреки че генетичната конституция на хората е несравнимо по-сложна от тази на жабите. Следователно може да се предположи, че „излишното“ количество ДНК в по-ниско организираните организми или не е свързано с изпълнението на генетична роля, или броят на гените се повтаря един или друг брой пъти.

Таблица 4. Съдържание на ДНК в клетките на някои обекти (pg, 10 -12 g)

Оказа се, че е възможно да се решат тези проблеми чрез изучаване на кинетиката на реакцията на ренатурация или ДНК хибридизация. Ако фрагментираните ДНК молекули в разтвори се подложат на термична денатурация и след това се инкубират при температура, малко по-ниска от тази, при която се извършва денатурацията, тогава първоначалната двойноверижна структура на ДНК фрагментите се възстановява поради повторното обединяване на комплементарни вериги - ренатурация. За ДНК вируси и прокариотни клетки беше показано, че скоростта на такава ренатурация директно зависи от размера на генома; колкото по-голям е геномът, толкова по-голямо е количеството ДНК на частица или клетка, толкова повече време е необходимо за случайния подход на комплементарни вериги и специфичното повторно свързване на по-голям брой ДНК фрагменти, различни по нуклеотидна последователност (фиг. 53). Характерът на кривата на реасоцииране на ДНК на прокариотните клетки показва липсата на повтарящи се базови последователности в прокариотния геном; всички участъци от тяхната ДНК носят уникални последователности, чийто брой и разнообразие отразяват степента на сложност на генетичния състав на обектите и, следователно, тяхната обща биологична организация.

Напълно различна картина на реасоциацията на ДНК се наблюдава при еукариотните организми. Оказа се, че тяхната ДНК съдържа фракции, които се ренатурират с много по-висока скорост, отколкото би се очаквало въз основа на размера на техния геном, както и фракция от ДНК, която се ренатурира бавно, като уникалните ДНК последователности на прокариотите. Еукариотите обаче изискват значително повече време, за да ренатурират тази фракция, което е свързано с общия голям размер на техния геном и големия брой различни уникални гени.

В тази част от еукариотната ДНК, която се характеризира с висока степен на ренатурация, се разграничават две подфракции: 1) фракция с много или често повтарящи се последователности, където подобни ДНК участъци могат да се повторят 10 6 пъти; 2) фракция от умерено повтарящи се последователности, които се срещат 10 2 -10 3 пъти в генома. Така при мишки фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности включва 10% от общото количество ДНК на геном и 15% се отчитат от фракцията с умерено повтарящи се последователности. Останалите 75% от цялата миша ДНК е представена от уникални региони, съответстващи на голям брой различни неповтарящи се гени.

Фракции с много повтарящи се последователности могат да имат различна плаваща плътност от по-голямата част от ДНК и следователно могат да бъдат изолирани в чиста форма като така наречените фракции сателитна ДНК. При мишката тази фракция е с плътност 1,691 g/ml, а основната част от ДНК е 1,700 g/ml. Тези разлики в плътността се определят от разликите в нуклеотидния състав. Например, в една мишка има 35% G и C двойки в тази фракция и 42% в основния пик на ДНК.

Както се оказа, сателитната ДНК, или фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности, не участва в синтеза на основните видове РНК в клетката и не е свързана с процеса на синтез на протеини. Това заключение е направено въз основа на факта, че нито един от видовете клетъчна РНК (tRNA, mRNA, rRNA) не хибридизира със сателитна ДНК. Следователно, тези ДНК не съдържат последователности, отговорни за синтеза на клетъчна РНК, т.е. сателитните ДНК не са матрици за синтеза на РНК и не участват в транскрипцията.

Съществува хипотеза, че много повтарящи се последователности, които не са пряко включени в протеиновия синтез, могат да носят информация, която играе важна структурна роля в поддържането и функционирането на хромозомите. Те могат да включват множество участъци от ДНК, свързани с основните протеини на интерфазното ядро (виж по-долу), места в началото на репликация или транскрипция, както и участъци от ДНК, които регулират тези процеси.

Използване на метода на хибридизация на нуклеинови киселини директно върху хромозоми ( на място) е изследвана локализацията на тази фракция. За да се направи това, РНК, белязана с 3Н-уридин, се синтезира върху изолирана сателитна ДНК с помощта на бактериални ензими. След това цитологичният препарат с хромозоми се подлага на такава обработка, че настъпва денатурация на ДНК (повишена температура, алкална среда и др.). След това върху препарата се поставя 3H-маркирана РНК и се постига хибридизация между ДНК и РНК. Авторадиографията показва, че по-голямата част от етикета е локализирана в зоната на първичните стеснения на хромозомите, в зоната на техните центромерни области. Белегът се открива и в други области на хромозомите, но много слабо (фиг. 54).

През последните 10 години бяха направени големи крачки в обучението центромерна ДНК, особено в клетките на дрождите. Така и направете S. cerevisiaeЦентромерната ДНК се състои от повтарящи се области от 110 bp. Състои се от две запазени области (I и III) и централен елемент (II), обогатен с AT базови двойки. Хромозомите на Drosophila имат подобна центромерна ДНК структура. Човешката центромерна ДНК (алфоидна сателитна ДНК) се състои от тандем от 170 bp мономери, организирани в групи от димери или пентамери, които на свой ред образуват големи последователности от 1-6 x 103 bp. Тази най-голяма единица се повтаря 100-1000 пъти. Специални центромерни протеини са в комплекс с тази специфична центромерна ДНК и участват в образуването кинетохор, структура, която осигурява връзката на хромозомите с вретеновидни микротубули и при движението на хромозомите в анафаза (виж по-долу).

ДНК със силно повтарящи се последователности също е открита в теломерни областихромозоми на много еукариотни организми (от дрожди до хора). Тук най-често се срещат повторения, които включват 3-4 гуанинови нуклеотида. При хората теломерите съдържат 500-3000 TTAGGG повторения. Тези участъци от ДНК изпълняват специална роля - да ограничат краищата на хромозомата и да предотвратят нейното скъсяване по време на процеса на повторна репликация.

Наскоро беше установено, че силно повтарящи се ДНК последователности на интерфазни хромозоми се свързват специфично с ламинови протеини, лежащи в основата на ядрената обвивка и участват в закрепването на разширени декондензирани интерфазни хромозоми, като по този начин определят реда в локализацията на хромозомите в обема на интерфазното ядро.

Предполага се, че сателитната ДНК може да участва в разпознаването на хомоложните области на хромозомите по време на мейозата. Според други предположения регионите с често повтарящи се последователности играят ролята на разделители (спейсъри) между различни функционални единици на хромозомна ДНК, например между репликони (виж по-долу).

Както се оказа, частта от умерено повтарящи се (от 10 2 до 10 5 пъти) последователности принадлежи към разнообразен клас от ДНК региони, които играят важна роля в процесите на създаване на апарата за синтез на протеини. Тази фракция включва рибозомни ДНК гени, които могат да се повторят 100 до 1000 пъти в различни видове. Тази фракция включва многократно повтарящи се региони за синтеза на всички тРНК. Освен това някои структурни гени, отговорни за синтеза на определени протеини, също могат да се повтарят много пъти, представени от много копия. Това са гените за хроматиновите протеини - хистоните, повтарящи се до 400 пъти.

В допълнение, тази фракция включва ДНК участъци с различни последователности (100-400 нуклеотидни двойки всяка), също многократно повтарящи се, но разпръснати из целия геном. Тяхната роля все още не е напълно ясна. Предполага се, че такива ДНК участъци могат да представляват акцепторни или регулаторни области на различни гени.

И така, ДНК на еукариотните клетки е хетерогенна по състав, съдържаща няколко класа нуклеотидни последователности: често повтарящи се последователности (> 10 6 пъти), включени в сателитната ДНК фракция и нетранскрибирани; фракция от умерено повтарящи се последователности (10 2 -10 5), представляващи блокове от истински гени, както и къси последователности, разпръснати из целия геном; част от уникални последователности, които носят информация за повечето клетъчни протеини.

Въз основа на тези идеи разликите в количеството ДНК, които се наблюдават в различните организми, стават ясни: те могат да бъдат свързани с неравномерно съотношение на определени класове ДНК в генома на организмите. Така например в амфибия Амфиума(който има 20 пъти повече ДНК от човека) повтарящите се последователности съставляват до 80% от общата ДНК, в лука - до 70, в сьомгата - до 60% и т.н. Истинското богатство на генетична информация трябва да бъде отразено от частта от уникални последователности. Не трябва да забравяме, че в естествена, нефрагментирана ДНК молекула на хромозомата, всички региони, които включват уникални, умерено и често повтарящи се последователности, са свързани в една гигантска ковалентна ДНК верига.

ДНК молекулите са хетерогенни не само в области на различни нуклеотидни последователности, но също така се различават по своята синтетична активност.

Репликация на еукариотна ДНК

Бактериалната хромозома се репликира като една структурна единица, имаща една начална точка на репликация и една крайна точка. Така бактериалната кръгова ДНК е една репликон. От началната точка репликацията протича в две противоположни посоки, така че докато се синтезира ДНК, се образува така нареченото репликационно око, ограничено от двете страни с репликационни вилици, което се вижда ясно по време на електронно микроскопско изследване на вирусни и бактериални репликиращи се хромозоми .

В еукариотните клетки организацията на репликация е от различно естество - полирепликон , Както вече беше споменато, с импулсното включване на 3 HT се появява множествен етикет в почти всички митотични хромозоми. Това означава, че едновременно има много места за репликация и много автономни източници на репликация в интерфазната хромозома. Това явление е изследвано по-подробно с помощта на авторадиография на белязани молекули, изолирани от ДНК (фиг. 55).Ако клетките са маркирани импулсно с 3НТ, тогава в светлинен микроскоп върху автографите на изолирана ДНК могат да се видят области с намалено сребро под формата на пунктирани линии. Това са малки участъци от ДНК, които са успели да се репликират, а между тях има участъци от нерепликирана ДНК, която не е напуснала авторадиограф и следователно остава невидима. Тъй като времето за контакт на 3 NT с клетката се увеличава, размерът на тези сегменти се увеличава и разстоянието между тях намалява. От тези експерименти скоростта на репликация на ДНК в еукариотните организми може да бъде точно изчислена. Скоростта на движение на вилицата за репликация се оказа 1-3 kb. на минута при бозайници, около 1 kb. на минута в някои растения, което е много по-ниско от скоростта на репликация на ДНК в бактерии (50 kb на минута). В същите експерименти беше пряко доказана полирепликонната структура на ДНК на еукариотните хромозоми: по дължината на хромозомната ДНК, по протежение на нея, има много независими места за репликация - репликони. Според разстоянието между средните точки на съседни маркиращи репликони, т.е. Въз основа на разстоянието между две съседни начални точки на репликация може да се определи размерът на отделните репликони. Средно размерът на репликона на висшите животни е около 30 µm или 100 kb. Следователно трябва да има 20 000-30 000 репликони в хаплоидния набор от бозайници. При нисшите еукариоти репликоните са по-малки, около 40 kb. Така при Drosophila има 3500 репликона на геном, а при дрождите – 400. Както беше споменато, синтезът на ДНК в репликона протича в две противоположни посоки. Това може лесно да се докаже чрез авторадиография: ако клетките, след импулсно маркиране, се оставят да продължат да синтезират ДНК за известно време в среда без 3 HT, тогава включването му в ДНК ще намалее, ще настъпи разреждане на етикета и на на авторадиографа ще бъде възможно да се види симетричен модел от двете страни на репликирания регион, намалявайки броя на зърната редуцирано сребро.

Репликиращите се краища или разклонения в репликон спират да се движат, когато срещнат разклоненията на съседни репликони (в крайна точка, обща за съседните репликони). В този момент репликираните участъци от съседни репликони се комбинират в единични ковалентни вериги от две новосинтезирани ДНК молекули. Функционалното разделяне на хромозомната ДНК на репликони съвпада със структурното разделяне на ДНК на домени или бримки, чиито основи, както вече беше споменато, се държат заедно чрез протеинови връзки.

По този начин целият ДНК синтез на една хромозома се осъществява чрез независим синтез на много отделни репликони, последван от свързване на краищата на съседни ДНК сегменти. Биологичният смисъл на това свойство става ясен при сравняване на синтеза на ДНК при бактерии и еукариоти. Така се синтезира бактериална монорепликонна хромозома с дължина 1600 микрона със скорост около половин час. Ако една сантиметър дълга ДНК молекула на хромозома на бозайник също се репликира като структура на монорепликон, това ще отнеме около седмица (6 дни). Но ако такава хромозома съдържа няколкостотин репликони, тогава пълната й репликация ще отнеме само около час. Всъщност времето за репликация на ДНК при бозайниците е 6-8 часа. Това се дължи на факта, че не всички репликони на отделна хромозома са включени по едно и също време.

В някои случаи се наблюдава едновременно включване на всички репликони или появата на допълнителни източници на репликация, което прави възможно завършването на синтеза на всички хромозоми за минимално кратко време. Това явление възниква в началото на ембриогенезата на някои животни. Известно е, че при смачкване на яйцата на ноктести жаби Ксенопус laevisСинтезът на ДНК отнема само 20 минути, докато в културата на соматичните клетки този процес продължава около един ден. Подобна картина се наблюдава при Drosophila: в ранните ембрионални стадии целият синтез на ДНК в ядрото отнема 3,5 минути, а в клетките на тъканната култура - 600 минути. В същото време размерът на репликоните в клетките на културата се оказа почти 5 пъти по-голям, отколкото в ембрионите.

Синтезът на ДНК протича неравномерно по дължината на отделната хромозома. Установено е, че в отделна хромозома активните репликони се събират в групи, репликативни единици, които включват 20-80 източника на репликация. Това следва от анализа на ДНК автографи, където се наблюдава точно такова блокиране на репликиращи се сегменти. Друга основа за идеята за съществуването на блокове или клъстери от репликони или репликационни единици са експерименти с включването на тимидинов аналог, 5'-бромодеоксиуридин (BrdU), в ДНК. Включването на BrdU в интерфазния хроматин води до факта, че по време на митоза областите с BrdU се кондензират в по-малка степен (недостатъчна кондензация) от тези области, където е включен тимидин. Следователно тези области на митотичните хромозоми, в които е включен BrdU, ще бъдат слабо оцветени по време на диференциалното оцветяване. Това прави възможно определянето на последователността на включване на BrdU с помощта на синхронизирани клетъчни култури, т.е. последователност на синтеза на ДНК по дължината на една хромозома. Оказа се, че включването на прекурсора в големи участъци от хромозомата се случва. Включването на различни секции става строго последователно през S-периода. Всяка хромозома се характеризира с висока стабилност на реда на репликация по дължината си и има свой собствен специфичен модел на репликация.

Клъстери от репликони, комбинирани в репликационни единици, са свързани с протеини на ядрената матрица (виж по-долу), които заедно с репликационните ензими образуват т.нар. клъстерозомите са зони в интерфазното ядро, в които се осъществява синтеза на ДНК.

Редът, в който се активират репликационните единици, вероятно може да се определи от структурата на хроматина в тези региони. Например, зоните на конститутивния хетерохроматин (близо до центромера) обикновено се репликират в края на S-периода; също така, в края на S-периода, част от факултативния хетерохроматин се удвоява (например X хромозомата на женската бозайници). Последователността на репликация на хромозомни участъци корелира особено ясно във времето с модела на диференциално оцветяване на хромозомите: R-сегментите принадлежат към ранно репликиращи се сегменти, G-сегментите съответстват на хромозомни участъци с късна репликация. С-сегментите (центромерите) са местата на последната репликация.

Тъй като в различните хромозоми размерът и броят на различните групи от различно оцветени сегменти са различни, това създава картина на асинхронното начало и край на репликацията на различните хромозоми като цяло. Във всеки случай последователността на началото и края на репликацията на отделните хромозоми в набора не е случайна. Съществува строга последователност на възпроизвеждане на хромозоми по отношение на другите хромозоми в набора.

Продължителността на процеса на репликация на отделните хромозоми не зависи пряко от техния размер. Така големите човешки хромозоми от група А (1-3) са белязани през целия S-период, както и по-късите хромозоми от група В (4-5).

По този начин синтезът на ДНК в еукариотния геном започва почти едновременно на всички хромозоми на ядрото в началото на S-периода. Но в същото време последователното и асинхронно включване на различни репликони се случва както в различни части на хромозомите, така и в различни хромозоми. Последователността на репликация на определен регион на генома е строго определена генетично. Това последно твърдение се доказва не само от модела на включване на етикета в различни сегменти на S-периода, но и от факта, че има строга последователност на поява на пикове в чувствителността на определени гени към мутагени по време на S -Период.

1. Видове хроматин

2. Гени, спейсъри

3. Последователност на нуклеотидите в ДНК

4. Пространствена организация на ДНК

1. По време на почивка между актовете на делене определени участъци от хромозоми и цели хромозоми остават компактни. Тези области на хроматина се наричат хетерохроматин. Рисува добре.

След ядреното делене хроматинът се разхлабва и в тази форма се нарича еухроматин. Хетерохроматинът е неактивен по отношение на транскрипцията и по отношение на репликацията на ДНК той се държи различно от еухроматина.

Факултативен хетерохроматине хетерохроматичен само на моменти. Той е информативен, т.е. съдържа гени. Когато влезе в еухроматично състояние, тези гени могат да станат достъпни за транскрипция. От две хомоложни хромозоми едната може да бъде хетерохроматична. Тази факултативна хетерохроматизация е тъканно специфична и не се среща в определени тъкани.

Конститутивен хетерохроматинвинаги хетерохроматичен. Състои се от многократно повтарящи се последователности от бази, не е информативен (не съдържа гени) и следователно винаги е неактивен по отношение на транскрипцията. Можете да го видите Ипо време на ядрено делене. Той се среща:

Най-често в центромера;

В краищата на хромозомите (включително сателитите);

В близост до организатора на ядрото;

Близо до гена 5S-RNA.

Хетерохроматинът, предимно факултативен, по време на интерфазата може да се обедини в интензивно оцветен хромоцентър, който в повечето случаи се намира на ръба на клетъчното ядро или ядро.

2. Всяка хромозома е непрекъсната двойна спирала на ДНК,който при висшите организми се състои от повече от 10 8 базови двойки. В хромозомите на висшите растения и животни всяка двойна спирала на ДНК (2 nm в диаметър) има дължина от един до няколко сантиметра. В резултат на многократно усукване, той се пакетира в хроматид с дължина няколко микрометра.

Гените са линейно разпределени по тази двойна спирала, които заедно съставляват до 25% от ДНК.

гене функционалната единица на ДНК,съдържащи информация за синтеза на полипептид или РНК. Средната дължина на гена е около 1000 базови двойки. Последователността на базите във всеки ген е уникална.

Между гените са разделители- неинформативни участъци на ДНК с различна дължина (понякога повече от 20 000 базови двойки), които са важни за регулиране на транскрипцията на съседен ген.

Транскрибирани разделителисе прекратяват по време на транскрипцията заедно с гена и техните комплементарни копия се появяват в пре-i-РНК от двете страни на генното копие. Дори в самия ген има (само при еукариотите и техните вируси) неинформативни последователности, така наречените интрони, които също се транскрибират. По време на обработката всички копия на интроните и повечето копия на спейсерите се изрязват от ензими.

Непреписваеми спейсеривъзникват между гени за хистони, както и между гени за рРНК.

Излишни гениса представени от голям брой (до 10 4 или повече) идентични копия. Това са гени:

За тРНК;

5S-РНК и хистони;

За продукти, синтезирани в големи количества.

Копията са разположени непосредствено едно до друго и са разрешени с еднакви разделители. В морския таралеж гените за хистоните H4, H2b, H2a и Hi лежат един след друг и тази генна последователност се повтаря в ДНК повече от 100 пъти.

3. Повтарящи се последователности - Това са последователности от нуклеотиди, присъстващи многократно в ДНК. Умерено повтарящи сепоследователности - последователности със средна дължина 300 базови двойки с 10 2 -10 4 повторения. Те включват излишни гени, както и повечето спейсъри.

Силно повтарящи сепоследователности с 10 5 -10 6 повторения образуват конститутивен хетерохроматин. Те винаги неинформативен.Това са предимно къси последователности, най-често в тях се срещат 7-10 и рядко - само 2 (например AT) или, обратно, над 300 нуклеотидни двойки. Те се групират заедно, като една повтаряща се последователност следва непосредствено другата. Силно повтарящите се хроматинови ДНК се наричат „сателитни ДНК“ поради тяхното поведение по време на аналитични процедури на фракциониране. Около 75% от целия хроматин не участва в транскрипцията: това са силно повтарящи се последователности и нетранскрипционни спейсери.

4. В изолиран хроматинучастъци от двойната спирала на ДНК се увиват около хистонови молекули, така че тук се появява суперспирала от първи ред. Комплекси от ДНК с хистон се наричат нуклеозоми. Те имат формата на диск или леща и размерите са около 10 x 10 x 5 nm. Една нуклеозома включени:

8 молекули хистони:

Централен тетрамер от две Н3 и две Н4 молекули; и отделно два Н2а и Н2b;

Част от ДНК (около 140 базови двойки), която образува приблизително 1,25 навивки на спирала и е здраво свързана с централния тетрамер.

Между нуклеозомите има участъци от спирала от 30-100 базови двойки без суперспирална структура; Хистонът се свързва тук Здравей

В зашит хроматинДНК допълнително се съкращава чрез малко разбрано допълнително навиване (суперспирала от по-висок порядък), което очевидно е фиксирано от хистон Hi (и някои нехистонови протеини). По време на прехода към интерфаза еухроматинът се разхлабва, тъй като някои от суперспиралите от по-висок порядък се развиват. Това вероятно се случва в резултат на конформационни промени в хистоните и отслабване на взаимодействията между Hi молекули.Хроматиновите структури с дебелина 10-25 nm (основни хроматинови нишки или спирали) също са видими по време на интерфазата.

1. Видове хроматин

2. Гени, спейсъри

3. Последователност на нуклеотидите в ДНК

4. Пространствена организация на ДНК

Най-често в центромера;

В краищата на хромозомите (включително сателитите);

В близост до организатора на ядрото;

Близо до гена 5S-RNA.

Гените са линейно разпределени по тази двойна спирала, които заедно съставляват до 25% от ДНК.

Непреписваеми спейсеривъзникват между гени за хистони, както и между гени за рРНК.

Излишни гениса представени от голям брой (до 10 4 или повече) идентични копия. Това са гени:

За тРНК;

5S-РНК и хистони;

За продукти, синтезирани в големи количества.

8 молекули хистони:

Централен тетрамер от две Н3 и две Н4 молекули; и отделно два Н2а и Н2b;

Транскрипционно активенхроматин - гени, които предават информацията си чрез синтез РНК,в резултат на по-нататъшната деспирализация се разхлабва още повече. Според някои данни в съответните участъци на спиралата на ДНК хистонът Hi или отсъства, или е химически променен, например фосфорилиран.

Нуклеозомна структурасъщо се променя или напълно се унищожава (в гените за r-RNA в нуклеола). Двойната спирала се развива на определени места. Тези процеси очевидно включват определени нехистонови протеини, които се натрупват в транскрибираните региони на ДНК.

Въпрос 38. Набор от хромозоми

/. Геном. Клетъчна плоидност

2. Политенни хромозоми

1. Целият фонд от генетична информация на всяко клетъчно ядро - геном- разпределени между определен постоянен брой хромозоми (n). Този номер е специфичен за всеки вид или подвид. При конските кръгли червеи е 1, при царевицата - 10, при човека - 23, при водораслите Netrium digitus -около 600. Хромозомите от един и същ набор са различни според следните критерии:

размер;

Снимка на хромометър;

Позицията на стеснения;

Зависи от множество хромозомни набори - плоидност- клетките се делят:

До хаплоиден;

Диплоиден;

Полиплоид.

Хаплоиденсе наричат клетки, които съдържат един набор от хромозоми (“), например полови клетки.

Ако клетките съдържат двоен набор от хромозоми (2 P), те диплоиден,тъй като в тях генетичната информация е представена два пъти. Почти всички соматични клетки на висшите растения и животни са диплоидни. Те съдържат един бащин и един майчин набор от хромозоми.

IN полиплоиденклетките имат няколко комплекта хромозоми (4 P, 8 P, 16 P и т.н.). Тези клетки често са особено метаболитно активни, като много чернодробни клетки при бозайници.

Хаплоидните клетки се образуват от диплоидни клетки в резултат на мейоза, а диплоидните клетки се образуват от хаплоидни клетки в резултат на оплождане.

Полиплоидните клетки възникват от диплоидните чрез ендомитоза - преждевременно прекъснато ядрено делене: след пълна репликация и разделяне на хроматидите дъщерните хромозоми остават в едно клетъчно ядро, вместо да бъдат разпределени между две ядра. Този процес може да се повтори много пъти.

Аномалиипо време на образуването на зародишни клетки може да доведе до полиплоидия на целия организъм. При непълна репликацияНякои части от генома, като хетерохроматин, не се репликират и остават диплоидни след ендомитоза, за разлика от други части, които стават полиплоидни.

Генно усилване -това е многократна суперрепликация, когато само определени гени се репликират и стават полиплоидни (гени за рРНК в нуклеола).

Хромозоми диплоидно ядромогат да бъдат групирани по двойки, две хомоложни хромозоми. Повечето от тях (т.нар автозоми)по двойки идентични. Само две полови хромозоми, които определят пола на индивида, не са еднакви при мъжете - това са X и Y хромозомите (хетерохромозоми).По-голямата част от Y хромозомата е заета от конститутивен хетерохроматин. Жените имат две Х хромозоми. При пеперудите, птиците и редица други животни обаче ситуацията е обратната: мъжките имат набор XX, женските имат набор XY.

2. Политенни хромозоми(гигантски хромозоми)съдържат в пъти повече ДНК от нормалните. Те не променят формата си през целия цикъл на делене и достигат дължина до 0,5 mm и дебелина 25 микрона. Те се намират например в слюнчените жлези на двукрилите (мухи и комари), в макронуклеуса на ресничките и в тъканите на яйчниците на боба. Най-често те се виждат в хаплоидния брой, тъй като хомоложните хромозоми са тясно сдвоени. Политениявъзниква в резултат на ендорепликация. В сравнение с ендомитоза, това е още по-редуциран процес на делене - след репликация хроматидите не се разделят (процесът се повтаря многократно). При което различни участъци от ДНК се умножават в различна степен:

Центромерни площи - незначителни;

Най-информативните области са приблизително 1000 пъти;

Някои – повече от 30 000 пъти.

Ето защо политенови хромозомиТе са снопове от безброй хроматиди, които не са напълно разделени. Хроматидите са разтегнати, хомоложните хромомери образуват тъмни дискове, разположени близо до хромозомата. Тези дискове са разделени от по-светли ивици. Вероятно на хроматида един диск и една междинна ивица образуват, в допълнение към спейсера, един ген (по-рядко няколко гена), който очевидно се намира в диска. Политеновите хромозоми са изключително бедни на хетерохроматин.

На политенни хромозоми отделни дисковепонякога набъбват в пуфове(Балбиани пръстени). Там хомоложните хроматиди се отделят един от друг, хомоложните хромомери се раздалечават и се появява рехава структура от транскрипционно активен хроматин. Пуфовете съдържат по-малко хистон Hi от дисковете и вместо това съдържат ензима РНК полимераза (което показва синтеза на РНК). Има също малко хистон Hi в междинните ивици, но има РНК полимераза и е възможно да се получи поне малък синтез РНК.

В хроматиновия препарат ДНК обикновено представлява 30-40%. Тази ДНК е двуверижна спирална молекула. Хроматиновата ДНК има молекулно тегло 7-9*10 6 . Такава относително малка маса на ДНК от препаратите може да се обясни с механично увреждане на ДНК по време на процеса на изолиране на хроматин.

Общото количество ДНК, включено в ядрените структури на клетките, в генома на организмите, варира от вид до вид. Когато се сравнява количеството ДНК на клетка в еукариотните организми, е трудно да се установи някаква връзка между степента на сложност на организма и количеството ДНК на ядро. Различни организми, като лен, морски таралеж, костур (1,4-1,9 pg) или овъглен и бик (6,4 и 7 pg), имат приблизително еднакво количество ДНК.

Сателитната ДНК или фракцията от ДНК с често повтарящи се последователности може да участва в разпознаването на хомоложни области на хромозомите по време на мейозата. Според други предположения тези участъци играят ролята на разделители (спейсъри) между различните функционални единици на хромозомната ДНК.

Както се оказа, частта от умерено повтарящи се (от 10 2 до 10 5 пъти) последователности принадлежи към разнообразен клас от ДНК региони, които играят важна роля в метаболитните процеси. Тази фракция включва рибозомни ДНК гени, многократно повтарящи се участъци за синтеза на всички тРНК. Освен това някои структурни гени, отговорни за синтеза на определени протеини, също могат да се повтарят многократно, представени от много копия (гени за хроматинови протеини - хистони).

И така, ДНК на еукариотните клетки е хетерогенна по състав и съдържа няколко класа нуклеотидни последователности:

често повтарящи се последователности (>10 6 пъти), включени в сателитната ДНК фракция и нетранскрибирани;

фракция от умерено повтарящи се последователности (10 2 -10 5), представляващи блокове от истински гени, както и къси последователности, разпръснати из целия геном;

част от уникални последователности, които носят информация за повечето клетъчни протеини.

ДНК на прокариотен организъм е една гигантска циклична молекула. ДНК на еукариотните хромозоми е линейна молекула, състояща се от репликони с различни размери, подредени в тандем (един след друг). Средният размер на репликона е около 30 микрона. По този начин човешкият геном трябва да съдържа повече от 50 000 репликони, ДНК участъци, които се синтезират като независими единици. Тези репликони имат начална точка и крайна точка за синтеза на ДНК.

Нека си представим, че в еукариотните клетки всяка хромозомна ДНК, както при бактериите, е един репликон. В този случай, при скорост на синтез от 0,5 микрона в минута (за хора), редупликацията на първата хромозома с дължина на ДНК около 7 см трябва да отнеме 140 000 минути, или около три месеца. Всъщност, поради полирепликонната структура на ДНК молекулите, целият процес отнема 7-12 часа.

Отстраняване на хистон H1 от транскрипционно активен хроматин 1*2*. Ранните експерименти на J. Bonner (САЩ) показват, че ДНК в хроматина е много по-лоша матрица от свободната ДНК. Въз основа на тези наблюдения се предполага, че хистоните са транскрипционни репресори.

Л. Н. Ананьева и Ю. В. КозловНашата лаборатория се зае да установи дали всички хистони имат инхибиторен ефект или само някои от тях. За да се направи това, хистоните бяха отстранени от хроматина на миши асцитни ракови клетки на Ehrlich чрез екстракция с разтвори на NaCl с постепенно нарастващи концентрации. Получените препарати послужиха като матрица за синтеза на РНК. Транскрипцията се извършва в присъствието на РНК полимераза от Escherichia coli, E. coli, която е взета в излишък, и смес от нуклеозидни трифосфати. В диапазона от 0,4-0,6 М NaCl настъпва рязка декондензация на материала, изразяваща се в набъбване на ядрения гел и дори разтваряне на DNP (ако се извърши допълнителна механична обработка). Показано е, че това селективно премахва хистон HI. Едновременно с декондензацията на хроматина се наблюдава рязко повишаване на неговата матрична активност (фиг. 26). По-нататъшно увеличаване на концентрацията на сол в екстракционния разтвор доведе до отстраняване на други хистони и леко, но не много изразено, допълнително увеличение на матричната активност.

0 т. Така хибридизираемостта разкрива процента на повтарящи се последователности в синтезираната РНК (според резултатите, получени от L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov и автора); b - основни параметри на синтеза на РНК върху различни матрици: свободна ДНК, оригинален хроматин (DNP 0) и хроматин, от който хистон H1 е отстранен чрез екстракция с 0,6 М NaCl (DNP 0,6). Синтезът на РНК се провежда с помощта на РНК полимераза на Escherichia coli в присъствието на белязани нуклеозидни трифосфати: [14С]-АТР и или [у-32Р]-АТР, или [у-32Р]-GTP. [ 14 C]-UMP беше включен в цялата РНК, а [γ- 32 P] - само в началото на веригата (pp x A- или pp x G). С други думи, включването на [ 32 P] предоставя информация за започването на синтеза, а [ 14 C] - за самия синтез на РНК. В някои експерименти, 3-4 минути след началото на инкубацията, към средата се добавя рифампицин, антибиотик, който предотвратява инициирането на нови вериги на РНК, но не засяга синтеза, който вече е започнал, т.е. удължаването. 1 - включване на [14 C] - UMP, 2 - същото след добавяне на рифампицин; 3 - включване на [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - същото след добавяне на рифампицин. Въз основа на тези криви на включване е възможно да се изчислят основните параметри на РНК полимеразната реакция (въз основа на резултатите, получени от Ю. В. Козлов и автора)">
Ориз. 26. Влиянието на хистон Н1 върху матричната активност на ДНК в хроматина. а - ефектът от отстраняването на протеини от хроматина (1) върху матричната активност (2) на последния в присъствието на екзогенна РНК полимераза на Escherichia coli, както и върху способността за хибридизация на синтезираната РНК (3). Хистоните и нехистоновите протеини се екстрахират с нарастващи концентрации на разтвори на NaCl. В диапазона от 0,4 М NaCl - 0,6 М NaCl, хистон Н1 беше селективно отстранен. Синтезираната РНК се хибридизира с излишък от ДНК при междинни стойности на CO t. Така хибридизираемостта разкрива процента на повтарящи се последователности в синтезираната РНК (според резултатите, получени от L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov и автора); b - основни параметри на синтеза на РНК върху различни матрици: свободна ДНК, оригинален хроматин (DNP 0) и хроматин, от който хистон H1 е отстранен чрез екстракция с 0,6 М NaCl (DNP 0,6). Синтезът на РНК се провежда с помощта на РНК полимераза на Escherichia coli в присъствието на белязани нуклеозидни трифосфати: [ 14 C]-UTP и или [γ-32 P]-ATP, или [y-32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP беше включен в цялата РНК, а [γ- 32 P] - само в началото на веригата (pp x A- или pp x G). С други думи, включването на [ 32 P] предоставя информация за започването на синтеза, а [ 14 C] - за самия синтез на РНК. В някои експерименти, 3-4 минути след началото на инкубацията, към средата се добавя рифампицин, антибиотик, който предотвратява инициирането на нови вериги на РНК, но не засяга синтеза, който вече е започнал, т.е. удължаването. 1 - включване на [14 C] - UMP, 2 - същото след добавяне на рифампицин; 3 - включване на [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - същото след добавяне на рифампицин. Въз основа на тези криви на включване могат да се изчислят основните параметри на РНК полимеразната реакция (въз основа на резултатите, получени от Ю. В. Козлов и автора)

Свойствата на синтезирания инвитроРНК чрез хибридизация с тотална миша ДНК. В този случай беше открита част от РНК, синтезирана върху повтарящи се ДНК последователности. Оказа се, че в хроматина транскрипцията на повтарящи се ДНК последователности е ограничена. Въпреки това, след екстракция на хроматин с 0, 6 М NaCl, когато хистонът Н1 беше отстранен, хибридизационните свойства на РНК, синтезирана върху матрицата на такъв хроматин и върху матрицата на свободната ДНК, станаха неразличими. Ние предположихме, че хистоните H2a, H2b, H3 и H4 (тогава наричани по различен начин - умерено богати на лизин и богати на аргинин хистони) не участват в потискането на транскрипцията, а играят чисто структурна роля в организацията на хроматина, докато хистонът H1 (в стария терминология хистон , богат на лизин) е инхибитор на синтеза на РНК. В същото време това е и фактор, причиняващ кондензация на хроматин (виж по-горе).

По-късно Ю. В. Козлов изследва механизма на инхибиране на транскрипцията от хистон Н1, отново върху безклетъчна система с РНК полимераза, изолирана от E, coli. Изследван е ефектът на хистон Н1 върху процесите на иницииране и елонгация (виж Фиг. 26, Таблица 4). Оказа се, че той няколко пъти намалява броя на РНК веригите, инициирани върху нативната хроматинова матрица. Особено рязко се инхибира удължаването: РНК полимеразата отчита не повече от 100-150 bp. ДНК и след това спира. Междувременно върху хроматина, от който е отстранен хистон H1, РНК полимеразата чете няколко хиляди нуклеотидни двойки наведнъж и дължината на веригите не се различава от дължината на веригите, синтезирани върху свободната ДНК матрица. Вярно е, че върху свободната ДНК, в сравнение с хроматина, от който е отстранен хистон H1, процесите на иницииране на синтеза на РНК протичат по-ефективно. Беше заключено, че хистон H1, чрез кондензиране на хроматин, създава пречки по пътя на РНК полимеразата и по този начин спира синтеза на РНК.

* (DNPM е DNP, изолиран чрез третиране с урея, който е напълно разтворен, но запазва хистон H1.)

В светлината на съвременните данни за соленоидната структура на 300 A-DNP фибрила, която зависи от наличието на хистон H1, този резултат е лесно обясним. Наистина РНК полимеразата очевидно не може да прочете повече от 100 bp в соленоида. поради чисто топологични ограничения.

Според нашата хипотеза, когато генът е активиран, хистон H1 трябва да бъде отстранен. По това време обаче не беше възможно да се провери. Едва сравнително наскоро се появиха доказателства за загубата на хистон H1 от хроматин по време на генно активиране. По този начин, когато активно транскрибираните области на хроматина, например мининуклеоли, са изолирани от редица организми, хистон Н1 не е открит в тях. Не се среща и в дрождите, където всички гени са потенциално активни.

В лабораторията са получени убедителни резултати А. Д. Мирзабекова, В. Л. Карпов и О. В. Преображенская. Те разработиха метод, наречен „хибридизация в сянка на хистони“. За да се направи това, ДНК е омрежена с хистони с помощта на диметил сулфат при условия, при които средно една хистонова молекула е омрежена на ДНК сегмент с дължина около 200-300 bp. След това ДНК се фрагментира и се извършва двумерна електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел. След движение в първата посока хистоните, прикрепени към ДНК, се разрушават от протеиназа и вече свободната ДНК се ускорява във втората посока. Тъй като по време на първия цикъл на електрофореза различни хистони забавят движението на ДНК фрагменти по различни начини, след втория цикъл се разкриват няколко диагонала (фиг. 27). Обикновено три са ясно видими: едното съответства на първоначално свободната ДНК, другото на оригиналните ДНК комплекси с ядрени хистони и третото (долното) на оригиналния ДНК комплекс с хистон H1. Получената ДНК се прехвърля във филтър и се хибридизира с определена проба. Ако неактивен участък от генома беше взет за хибридизация, например спейсерът на рибозомния ген на Drosophila, тогава етикетът беше свързан с всички диагонали. Ако обаче като проба се използва генът на топлинния шок, който е транскрибиран в клетките, от които е изолиран хроматин, тогава хибридизацията с диагонала, съответстваща на ДНК комплекси с хистон H1, е рязко отслабена или напълно липсва. С други думи, в ядрата, преди прикрепването, ДНК на транскрибирания ген не е имала контакт с хистон H1.

Ориз. 27. Загуба на хистон H1 и сърцевини на хистони при активиране на транскрипция. Експериментите бяха проведени върху клетки от култура на D. melanogaster (a, b) при условия на култивиране при 25° (a) и топлинен шок (b). В случай a няма експресия на гени на топлинен шок; в случай b той е много активен. Освен това бяха проведени експерименти върху дехорионизирани ембриони ( c ), където експресията на гени на топлинен шок е на средно ниво. След образуване на ДНК-протеинови комплекси, изолиране на ДНК фрагменти, тяхното двумерно разделяне (във вертикална посока след отстраняване на протеина) и прехвърляне във филтър, същите филтри бяха хибридизирани с различни проби: с регулаторната област на p70 генът на топлинен шок (HS-5") ; с кодиращата област на същия ген (TS-код); с проба от транскрипционно неактивно вмъкване в rDNA гена (неактивен). Три диагонала се виждат в неактивния ген 1 - свободна ДНК, 2 - ДНК комплекси с октамерни хистони 3 - ДНК комплекси с хистон H1 Вижда се отслабването или изчезването на ДНК-хистонови комплекси при активиране на хроматин (според резултатите, получени от A. D. Mirzabekov et al.)

Въпреки че всички налични в момента данни, взети поотделно, позволяват други интерпретации, взети заедно, те предоставят убедителни доказателства в полза на отстраняването на хистон H1 от активния хроматин. Механизмът на този процес обаче все още е напълно неясен.

Съдбата на нуклеозомите по време на активиране на хроматина 2* [154-157]. По-малко ясен е въпросът за съдбата на хистоните H2a, H2b, H3 и H4, които образуват ядрото на нуклеозомата. В горните експерименти Ю. В. Козловатяхното присъствие на практика няма ефект върху транскрипцията на ДНК от РНК полимераза от E. coli.При изследване на продуктите от хидролизата на еукариотния хроматин много автори установиха, че нуклеозомите съдържат ДНК на активни гени, т.е. последните също са организирани в нуклеозоми. Данни, получени от голям експериментален материал А. Д. Мирзабековаи др. показват, че нуклеозомите, съдържащи активно транскрибирана ДНК, са фундаментално конструирани по същия начин като нуклеозомите, съдържащи неактивна ДНК, въпреки че някои контакти ДНК-хистон в тях са променени.

Бяха проведени и експерименти върху хибридизация с хистонови сенки, които бяха обсъдени в предишния раздел (виж Фиг. 27). Препарати с диагонали бяха приготвени от клетки на Drosophila, в които гените на топлинен шок или изобщо не работеха, тоест бяха изключени, или работеха на ниско ниво, или накрая бяха стимулирани от топлинен шок към активна транскрипция. Във всички случаи контролната проба беше ДНК на рибозомния ген спейсер, който хибридизира във всичките три диагонала, включително диагонала, получен от ДНК комплекси с ядрени хистони.

Генът на топлинния шок също хибридизира нормално с този диагонал от клетки, където не е транскрибиран. Въпреки това, с материал, получен от клетки с умерена транскрипция на гена на топлинния шок, хибридизацията на втория диагонал беше значително намалена. И накрая, ако диагоналите са получени от клетки с много активен синтез на иРНК на топлинен шок, тогава вторият диагонал изобщо не се вижда по време на хибридизацията (както и третият) и се разкрива само диагоналът, който съответства на неомрежена ДНК с хистони.Общото заключение, направено от проучвания, използващи метода на кръстосано свързване на ДНК-протеин, е, че по време на транскрипцията, РНК полимеразата, движеща се по ДНК веригата, обратимо сблъсква нуклеозомите с ДНК и транскрибира практически чиста ДНК. Ако нивото на транскрипция е ниско и има малко РНК полимерази, пълзящи по ДНК, тогава нуклеозомите имат време да се образуват отново в областта, през която РНК полимеразата вече е преминала. Ако транскрипцията е активна, тогава нуклеозомната структура на ДНК няма време да се възстанови и ДНК обикновено е лишена от хистони. В същото време се предполага, че организацията на нуклеозомите в активния хроматин практически не се различава от тази в неактивния хроматин. Наскоро A.D. Mirzabekov et al. възпроизвежда експерименти върху прикрепването на хистони към ДНК, използвайки различен метод, чрез третиране на изолирани ядра с платинови препарати. Този метод е по-мек от диметилсулфата. Бяха получени принципно същите резултати.

Наред с този набор от данни има проучвания, в които авторите стигат до малко по-различни заключения. У. Гарард и А. Уорсел(САЩ), изучавайки състоянието на активните гени в хроматина с помощта на нуклеазна хидролиза и електронна микроскопия, стигна до заключението, че нуклеозомите остават в активния хроматин, но претърпяват структурни промени като обръщане, превръщане в полунуклеозоми. В резултат на това периодичността в електроферограмите на хидролизати с микрококова нуклеаза е ~200 bp. заменен с периодичност от ~100 bp. При електронна микроскопия броят на перлите се удвоява и размерите им намаляват. Предполага се, че РНК полимеразата може да премине през такива разгънати нуклеозоми.

Тази възможност се подкрепя и от получените данни Т. Колер(Швейцария). Той разработва оригинален метод за изследване на нуклеозомите. Клетките се третират с псорален, вещество, което се свързва с ДНК и след това кръстосано свързва две вериги на ДНК заедно с ултравиолетова светлина. Въпреки това, ако ДНК е част от нуклеозомите, нейната реакция с псорален не настъпва. Следователно, ако ДНК, изолирана от третираните клетки, е денатурирана в присъствието на формалдехид (той предотвратява ренатурирането на ДНК), тогава при електронна микроскопия се появяват редуващи се мехурчета (две вериги денатурирана ДНК), съответстващи на нуклеозоми, свързани една с друга чрез единични вериги (кръстосани -свързани, неспособни на денатурация) са видими на ДНК. ДНК), съответстващи на междунуклеозомни линкери. Първо, бяха изследвани активно транскрибирани рибозомни РНК гени, които са част от екстрахромозомни структури и следователно лесно се анализират с помощта на електронна микроскопия. В тях везикулите, съответстващи на нуклеозомите, не се виждат, т.е. по всяка вероятност хистоните са напълно отстранени от транскрибираните области. Интересното е, че в нетранскрибираните области спейсерите, ДНК мехурчетата (нуклеозомите) са ясно видими.

Въпреки това, различни резултати са получени върху SV40 минихромозоми, които се транскрибират от РНК полимераза II, а не от РНК полимераза I като рибозомните РНК гени (фиг. 28). Транскрипционно активните мини-хромозоми се идентифицират поради наличието на нарастващи РНК вериги (обикновено една или две) върху тях. Такива мини-хромозоми съставляват 1-2% от всички мини-хромозоми, изолирани от клетката. Те обаче съдържат същия брой везикули като неактивните минихромозоми и техните размери са еднакви и в двата случая. Най-интересното е, че РНК веригите се простират както от линкерите, така и директно от везикулите, т.е. РНК полимеразата очевидно транскрибира нуклеозомите. Тези данни подкрепят разгръщането на нуклеозомите и тяхната транскрипция от РНК полимераза.

Всички горепосочени резултати не са директни и следователно бъдещите експерименти трябва да дадат окончателно решение на въпроса за съдбата на нуклеозомите по време на транскрипция.

Хистонова модификация и хистонови варианти: асоциация с активен хроматин. Още в началото на 60-те години Алфри (САЩ) показа, че хистоните могат да претърпят различни модификации. По този начин хистон HI се фосфорилира при ε-амино групите на лизините. Хистоните Н3 и Н4 са ацетилирани върху същите групи. Има редица други модификации (метилиране, ADP - рибозилиране, убиквитиниране и др.).

Веднага се предполага, че ензимните модификации на хистоните могат да повлияят на структурата на хроматина и неговата активност. В действителност, когато лизинът е фосфорилиран, един положителен заряд в хистона се заменя с отрицателен; при обжалване се губи положителен заряд и т.н. гел електрофореза в ацетатен буфер с урея. Така при електрофореза с висока разделителна способност хистон Н4 дава не една, а четири ленти, съответстващи на молекули, които не са ацетилирани и ацетилирани при един, два и три лизинови остатъка. В различните тъкани съотношението между фракциите се променя. Хистоните H3, H2a, H2b и H1 са разделени на няколко фракции (различни степени на ацетилиране и фосфорилиране).

За съжаление, все още няма добри методи за разделяне на транскрипционно активен и неактивен хроматин и следователно е трудно да се припишат променени хистонови форми на едно или друго състояние на хроматин. Най-интересните данни в тази посока са получени от същия У. Алфри(САЩ). По време на хидролизата на активния хроматин той изолира необичайни частици, които се утаяват в градиента на захарозата по-бавно от обикновените нуклеозоми и, според автора, съответстват на разгънати нуклеозоми. Тези частици, наречени А частици, съдържат всички основни хистони. За разлика от нормалните нуклеозоми, SH групите на хистон Н3 в А частиците са достъпни за редица химични реагенти и поради това А частиците могат да бъдат отделени от нуклеозомите чрез фракциониране върху хлормеркурибензоатни колони (SH група-свързващ реагент). А-частиците съдържат повишено съдържание на ацетилирани форми на хистони. Авторът предполага, че ацетилирането на хистон при активиране на хроматин води до разгъване на нуклеозомни частици и това от своя страна увеличава наличието на SH групи на хистон Н3.

Някои хистони са кодирани от повече от един тип ген. В резултат на това има няколко варианта на тези хистони, които се различават леко в тяхната аминокиселинна последователност. Понякога в процеса на онтогенезата има естествена замяна на един подклас хистон с друг. Остава неясно обаче дали това има някакво регулаторно значение. Проблемът очевидно може да бъде разрешен и след разработването на адекватни методи за изолиране на транскрипционно активен хроматин.

Особено място заема хистон Н1. Има варианти за него, които се различават рязко по своята структурна организация. Този вариант е например хистон Н5, който замества значителна част от хистон Н1 в ядрата на птичи еритроцити. По всяка вероятност това заместване е важен фактор за пълното спиране на транскрипцията в ядрата на еритроцитите. В нормалните клетки има вариант на хистон H1 - хистон H1 0. Съдържанието му представлява малка част от общия хистон H1. Има редица противоречиви данни, че H1 0 е свързан с активни гени или, обратно, със стабилно изключени гени. Въпросът остава отворен.

HMG протеините могат да участват в организирането на активния хроматин 1* . В допълнение към хистоните, хроматинът съдържа много нехистонови протеини, чиято функция е неизвестна. Сред тях, очевидно, трябва да има структурни протеини, ензими, които осигуряват процесите на репликация, транскрипция и др., И регулаторни протеини. Е. Джоунс(Великобритания) се опита да изолира протеинови компоненти, присъстващи в достатъчно големи количества, за да позволи техния анализ и идентифициране. Той всъщност успя да изолира нов клас ядрени протеини, които нарече „високо подвижна група протеини“ ( група с висока мобилност), или HMG протеини. Името зависи от високата подвижност на тези протеини по време на гел електрофореза. Протеиновата фракция на HMG се разпада на редица отделни компоненти. Сред тях най-представителни и добре характеризирани са HMG-1, HMG-2, HMG-14 и HMG-17.

HMG протеините имат ниско молекулно тегло. Те са обогатени както с основни, така и с дикарбоксилни аминокиселини. Съдържанието на HMG протеини е приблизително 7% от съдържанието на хистони. Може да варира в ядра от различни видове клетки. В този контекст ние се интересуваме най-много от протеините HMG-14 и HMG-17, за които са получени доказателства за възможна роля в активирането на транскрипцията. Х. Вайнтрауб(САЩ) показват, че ядрената екстракция с 0,35 М NaCl, която извлича HMG протеини, променя някои свойства на активния хроматин, които се възстановяват, когато HMG-14 и HMG-17 се добавят към хроматина. Г. Диксън(Канада) откри тези протеини в състава на нуклеозомите, освободени от хроматина в ранните етапи на хидролиза от нуклеаза, които според неговите данни са обогатени с ДНК на тракционно активни гени.

завършва [32P] и след това се хибридизира с hnRNA от L клетки. Хибридите се откриват чрез гел филтрация. 1 - СН-2 ДНК; 2 - СН-3 ДНК; 3 - обща ДНК на клетката (според резултатите, получени от V.V. Bakaev et al.)">
Ориз. 29. Възможна връзка на HMG протеини (14 и 17) с активен хроматин. а - откриване на субнуклеозоми в хроматинови хидролизати с помощта на микрококова нуклеаза. На различни етапи на хидролиза се появяват определени фракции от субнуклеозоми. Електрофорезата се провежда в полиакриламиден гел при неденатуриращи условия. Оцветяване с етидиев бромид, флуорография в дясната колона; b - използване на двумерна електрофореза за определяне на протеиновия състав на субнуклеозомите CH2 и CH3. Хроматинът, белязан с [ 14 C] протеин, се хидролизира с микрококова нуклеаза и се разделя чрез двуизмерна електрофореза (1-во направление - недисоциираща среда, 2-ро направление - разтвор на натриев додецил сулфат), след което се извършва авторадиография за идентифициране на протеини. Буквите означават HMG протеини, които по време на експеримента все още не са идентифицирани с известните. Сега знаем, че A е HMG-1, B е HMG-2, E е HMG-14, G е HMG-17, HMG протеините F и H не са ясно идентифицирани, вероятно H също съответства на HMG-17. Може да се види, че HMG протеините са част от мононуклеозоми (MH-2 и MH-3) и субнуклеозоми CH-2 (HMG-17) и CH-3 (HMG-14); c - демонстрация на ДНК обогатяване на СН-2 и СН-3 транскрибирани последователности. ДНК, изолирана от СН-2 и СН-3 лентите на L клетки, се маркира в 5" краищата [32 P] и след това се хибридизира с hnRNA от L клетки. Хибридите се откриват чрез гел филтрация. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - обща ДНК на клетката (според резултатите, получени от V.V. Bakaev et al.)

В. В. Бакаевв нашата лаборатория стигнахме до заключението за ролята на HMG протеините в транскрипцията, използвайки различен експериментален подход. По време на електрофоретичен анализ на хроматинови хидролизати той разкри, в допълнение към нуклеозомите и олигонуклеозомите, второстепенни компоненти с по-голяма подвижност. Те бяха наречени субнуклеозоми и, очевидно, бяха продукти на по-нататъшно разграждане на нуклеозомата (фиг. 29, таблица 5). Субнуклеозома CH-7 съответства на нуклеозома, която е загубила по една молекула от H2a и H2b и съдържа ДНК, скъсена с 40 bp; CH-6 съответства на ДНК комплекс с дължина 30-40 bp. с хистон H1, който се отцепва от MH-2 по време на трансформацията му в MH-1. CH-4 съдържа ДНК сегмент и двойка хистони H2a и H2b (продукт на реакцията MH-1→CH-7→CH-4). Две субнуклеозоми, CH-3 и CH-2, се състоят от къси ДНК и HMG протеини (HMG-14 и HMG-17). Може да се предположи, че те са линкерни области, свързани с протеините HMG-14 и HMG-17, които преминават в разтвор при смилане на съответните нуклеозоми. СН-2 и СН-3 бяха събрани, ДНК беше изолирана от тях, крайно маркирана и нейната хибридизация с ядрена РНК беше изследвана. Оказа се, че ДНК от CH-2 и CH-3 хибридизира много по-ефективно с ядрена РНК, отколкото общата клетъчна ДНК, фрагментирана до същия размер.

Следователно беше заключено, че ДНК, свързана с протеините HMG-14 и HMG-17, вероятно произлиза от транскрипционно активен хроматин.

Всички тези данни, получени независимо, предполагат, че HMG-14 и HMG-17 по някакъв начин са свързани с генно активиране. Механизмът на активиране обаче беше напълно неясен. HMG-14 и HMG-17 не могат да бъдат основните фактори, които включват гена, тъй като им липсва специфичност. Може да се мисли, че те участват в поддържането на „отворената конформация“ на активния хроматин.

През следващите години се появи скептицизъм по отношение на ролята на HMG-14 и HMG-17 в активирането на хроматина. По-специално, наскоро А. Д. Мирзабекови др. използвайки метода на хибридизация с протеинови тъкани, получихме данни за изчерпването на активния хроматин на HMG-14 и HMG-17. Тъй като обаче всички горепосочени данни са косвени, като цяло въпросът за ролята на HMG протеините остава отворен и изисква допълнително проучване.

Топоизомераза I и протеини, тясно свързани с ДНК, са част от транскрипционно активния хроматин 1* . S. Elgin (САЩ), последван от редица други автори, показа, че транскрипционно активният хроматин съдържа топоизомераза I, ензим, който отпуска суперспиралната ДНК. Това е демонстрирано за първи път върху цитологични препарати на политенови хромозоми на Drosophila, като се използват флуоресцентни антитела срещу топоизомераза I. Този ензим въвежда едноверижно прекъсване в ДНК и ковалентно се свързва с получения 5" край на ДНК. Това позволява на ДНК да се върти свободно на мястото на прекъсване. След това фрагментът се отцепва и фосфодиестерната връзка в ДНК се възстановява. По отношение на молекулното тегло, топоизомераза I или накратко топо I е хетерогенна. Най-тежкият компонент има молекулно тегло 135 kDa, а най-богато представените - 80 kDa.Когато се разцепи от протеинази, се образуват по-къси полипептиди, които въпреки това запазват ензимната активност.

Антибиотикът каптотецин е топо I инхибитор и когато клетките се третират с него, ензимът образува ковалентни омрежвания с ДНК на мястото, където е бил в момента на контакт с антибиотика. Местоположението на такива кръстосани връзки може лесно да се определи чрез картографиране с помощта на хибридизационен етикет. По този начин беше открито, че topo I присъства изключително в транскрибираните региони на генома, т.е. най-вероятно той работи в сътрудничество с РНК полимераза II, премахвайки локалните ДНК усуквания, които възникват по време на транскрипцията.

Друг протеинов компонент, открит в транскрибираните региони на генома, е набор от протеини, плътно свързани с ДНК (DBP), който съответства на транскрибираната ДНК на клетката (вижте раздел 3.4).

С. В. Разин и В. В. ЧернохвостовНаправен е опит да се характеризират комплексите на ДНК с PBP в детайли. ДНК фрагменти с дължина 1–2 kb, свързани с PBP, бяха пречистени и подложени на равновесно ултрацентрофугиране в CsCl градиент на плътност. Тяхната плаваща плътност се оказа еднаква 1,7 g/cm3, т.е. съответстваше на плаващата плътност на свободна ДНК, несъдържаща протеин. В експерименти, предназначени да обяснят този парадокс, беше установено, че лечението с DRNase води до намаляване на плаващата плътност на комплексите до 1,62-1,65 g/cm3. Приблизителни изчисления въз основа на плътността на протеина ( ~ 1,3 g/cm3) и РНК ( ~ 1,9 g/cm3), (покажете, че за всяка ДНК молекула има около 150 kDaпротеин и около 200 нуклеотида РНК. Природата на тази РНК е неясна, но са получени доказателства за нейната хомогенност и уникална нуклеотидна последователност.

По този начин много за ДНК-PBP комплексите остават мистериозни, но по всяка вероятност те играят значителна роля в организацията на машината за транскрипция. Проучването им продължава в момента.

Деметилиране на ДНК в транскрибирани гени 2*. Друга важна характеристика на активния хроматин е деметилирането на определени участъци от ДНК. В неактивните гени повечето от цитидиловите остатъци в CG последователностите са метилирани. Първо Б. В. Ванюшинв лабораторията А. Н. Белозерскибеше демонстрирано, че ДНК в различни тъкани на едно и също животно се различава в нивото на метилиране на C. Въз основа на това се предполага, че метилирането може да има регулаторна роля в диференциацията. По-късно много автори показват, че някои области в транскрибираната ДНК са недостатъчно метилирани. Най-широко използваният метод за анализ е сравнението на рестрикционни карти, получени с рестрикционни ензими, които разпознават същата последователност, като CGCG или CCGG, но имат различна чувствителност към метилиране. Единият от рестрикционните ензими разцепва както метилираните, така и неметилираните последователности, а другият разцепва само неметилираните. Обикновено неметилираните последователности са локализирани в регулаторната област на гена. Регионът на самия ген, неговата кодираща част и интроните е еднакво метилиран както в работещите, така и в тихите гени.

Когато метилираната ДНК се въведе в клетките, нейната експресия в клетката е значително намалена в сравнение с неметилираната ДНК. Получени са данни, според които по време на репликацията на ДНК се възпроизвежда състоянието на метилиране на ДНК: ако една от веригите е метилирана, то новообразуваната верига също се метилира на същото място.

По едно време изглеждаше, че метилирането-деметилирането на цитидин в CG последователностите на регулаторната област е основният механизъм на генно инактивиране-активиране. Наскоро обаче се появиха редица данни, които противоречат на тази хипотеза. По този начин, напълно CG метилирана SV40 ДНК се експресира активно. В същото време метилцитозинът изобщо не се открива в ДНК на Drosophila. Възможно е деметилирането на С да е следствие от генно активиране и само да поддържа състоянието на транскрипционна активност. Тук, както и в други области на изучаване на генното активиране, са необходими нови експерименти.