Kromatin: hücre bölünmesinde tanımı, yapısı ve rolü. Ökaryotik DNA'nın üç fraksiyonu, bunların kromozomlardaki lokalizasyonu ve fonksiyonları Kromatinin yapısal ve fonksiyonel bileşenleri

Hücre çekirdeğinin ana bileşeni olan kromatin, izole edilmiş fazlar arası çekirdeklerden ve izole edilmiş mitotik kromozomlardan elde edilmesi oldukça kolaydır. Bunu yapmak için, düşük iyon gücüne sahip sulu çözeltiler veya basitçe deiyonize su ile ekstraksiyon sırasında çözünmüş bir duruma geçme yeteneğini kullanırlar. Bu durumda kromatin bölümleri şişer ve jele dönüşür. Bu tür ilaçları gerçek çözümlere dönüştürmek için güçlü mekanik etkiler gereklidir: çalkalama, karıştırma, ilave homojenizasyon. Bu, elbette, orijinal kromatin yapısının kısmen tahrip olmasına, onu küçük parçalara ayırmasına yol açar, ancak pratikte kimyasal bileşimini değiştirmez.

Farklı nesnelerden elde edilen kromatin fraksiyonları oldukça düzgün bir bileşen kümesine sahiptir. Fazlar arası çekirdeklerden ve mitotik kromozomlardan gelen kromatinin toplam kimyasal bileşiminin birbirinden çok az farklı olduğu bulundu. Kromatinin ana bileşenleri DNA ve proteinlerdir; bunların büyük bir kısmı histonlar ve histon olmayan proteinlerdir (bkz. Tablo 3).

Tablo 3. Kromatinin kimyasal bileşimi. Protein ve RNA içerikleri DNA'ya göre verilmiştir

Ortalama olarak, kromatinin yaklaşık %40'ı DNA'dır ve yaklaşık %60'ı spesifik nükleer proteinler de dahil olmak üzere proteinlerden oluşur. histonlar izole edilmiş kromatini oluşturan tüm proteinlerin %40 ila %80'ini oluşturur. Ayrıca kromatin fraksiyonu membran bileşenlerini, RNA'yı, karbonhidratları, lipitleri ve glikoproteinleri içerir. Bu küçük bileşenlerin kromatin yapısında ne kadar yer aldığı sorusu henüz çözülmedi. Dolayısıyla, örneğin RNA, DNA şablonuyla bağlantısını henüz kaybetmemiş, kopyalanmış RNA olabilir. Diğer küçük bileşenler nükleer membranın birlikte çökelmiş parçalarından gelen maddeleri temsil edebilir.

Yapısal olarak kromatin, histonlarla ilişkili DNA'dan oluşan deoksiribonükleoprotein (DNP) moleküllerinin filamentli bir kompleksidir (bkz. Şekil 57). Bu nedenle, kromatin için başka bir isim kök salmıştır - nükleohiston. Histonların DNA ile birleşmesinden dolayı çok kararsız, değişken nükleik asit-histon kompleksleri oluşur; burada DNA:histon oranı yaklaşık birdir; eşit ağırlık miktarlarında bulunurlar. Bu filamentli DNP fibrilleri, DNA paketleme derecesine bağlı olarak kalınlığı 10 ila 30 nm arasında değişebilen temel kromozomal veya kromatin filamentleridir. Bu DNP fibrilleri, mitotik kromozoma kadar daha yüksek düzeyde DNP yapılanması oluşturmak üzere daha da sıkıştırılabilir. Bazı histon olmayan proteinlerin rolü tam olarak yüksek düzeyde kromatin sıkışmasının oluşmasındadır.

DNA kromatin

Bir kromatin preparatında DNA genellikle %30-40'ı oluşturur. Bu DNA, sulu çözeltilerdeki saf izole edilmiş DNA'ya benzeyen, çift sarmallı sarmal bir moleküldür. Bu, birçok deneysel veriyle kanıtlanmıştır. Böylece, kromatin çözeltileri ısıtıldığında, saf DNA ısıtıldığında (eritildiğinde) meydana gelene benzer şekilde, DNA zincirleri arasındaki nükleotidler arası hidrojen bağlarının kırılmasıyla ilişkili hiperkromik etki adı verilen çözeltinin optik yoğunluğunda bir artış gözlenir. .

Kromatindeki DNA moleküllerinin boyutu ve uzunluğu sorusu, kromozomun yapısının bir bütün olarak anlaşılması açısından önemlidir. Standart DNA izolasyon yöntemleri kullanıldığında, kromatinin molekül ağırlığı 7-9 x 10 6'dır ve bu, Escherichia coli'den (2,8 x 10 9) DNA'nın molekül ağırlığından önemli ölçüde daha azdır. Kromatin preparatlarından elde edilen DNA'nın bu kadar düşük moleküler ağırlığı, kromatin izolasyon işlemi sırasında DNA'nın mekanik olarak hasar görmesi ile açıklanabilir. DNA, çalkalama, homojenleştirme ve diğer etkilerin olmadığı koşullar altında izole edilirse, hücrelerden çok uzun DNA molekülleri elde etmek mümkündür. Ökaryotik hücrelerin çekirdeklerinden ve kromozomlarından gelen DNA moleküllerinin uzunluğu, tıpkı prokaryotik hücrelerde çalışıldığı gibi, ışık-optik otoradyografi yöntemi kullanılarak incelenebilir.

Kromozomlar içindeki bireysel doğrusal (prokaryotik kromozomların aksine) DNA moleküllerinin uzunluğunun yüzlerce mikrometreye ve hatta birkaç santimetreye ulaşabileceği keşfedildi. Böylece farklı nesnelerden 0,5 mm'den 2 cm'ye kadar değişen DNA molekülleri elde edildi.Bu sonuçlar, kromozom başına hesaplanan DNA uzunluğu ile otoradyografik gözlem arasında yakın bir uyum olduğunu gösterdi.

Ökaryotik hücrelerin hafif parçalanmasından sonra, DNA'nın moleküler ağırlıkları fizikokimyasal yöntemlerle doğrudan belirlenebilir. Bir Drosophila DNA molekülünün maksimum molekül ağırlığının 41 x 10 9 olduğu, bunun da yaklaşık 2 cm uzunluğa karşılık geldiği gösterilmiştir.Bazı mayalarda, kromozom başına 1 x 10 8 molekül ağırlığına sahip bir DNA molekülü bulunmaktadır. -10 9, yaklaşık 0,5 mm boyutundadır.

Bu kadar uzun DNA, bazı araştırmacıların inandığı gibi, protein bağları kullanılarak tek bir sıra halinde birbirine dikilmiş birkaç kısa molekül değil, tek bir moleküldür. Bu sonuca, ilaçların proteolitik enzimlerle işlenmesinden sonra DNA moleküllerinin uzunluğunun değişmediğinin ortaya çıkmasıyla ulaşıldı.

Hücrelerin nükleer yapılarında, organizmaların genomunda yer alan toplam DNA miktarı türden türe değişir, ancak mikroorganizmalarda hücre başına DNA miktarı omurgasızlara, yüksek bitkilere ve hayvanlara göre önemli ölçüde daha düşüktür. Yani bir farenin çekirdek başına E. coli'den neredeyse 600 kat daha fazla DNA'sı vardır. Ökaryotik organizmalarda hücre başına DNA miktarını karşılaştırırken, organizmanın karmaşıklık derecesi ile çekirdek başına DNA miktarı arasında herhangi bir korelasyonu ayırt etmek zordur. Keten, deniz kestanesi, levrek (1,4-1,9 pg) veya kömür balığı ve boğa balığı (6,4 ve 7 pg) gibi farklı organizmalar yaklaşık olarak aynı miktarda DNA'ya sahiptir.

Büyük taksonomik gruplarda DNA miktarında önemli dalgalanmalar vardır. Daha yüksek bitkiler arasında, farklı türlerdeki DNA miktarı yüzlerce kez farklılık gösterebilir; tıpkı balıklar arasında amfibilerdeki DNA miktarının onlarca kez farklılık göstermesi gibi.

Bazı amfibilerin çekirdeklerinde insan çekirdeğinden 10-30 kat daha fazla DNA bulunur, ancak insanların genetik yapısı kurbağalarınkiyle karşılaştırılamayacak kadar karmaşıktır. Bu nedenle, daha düşük organize organizmalardaki "fazla" DNA miktarının ya genetik bir rolün yerine getirilmesiyle ilişkili olmadığı ya da gen sayısının birkaç kez tekrarlandığı varsayılabilir.

Tablo 4. Bazı nesnelerin hücrelerindeki DNA içeriği (pg, 10 -12 g)

Renatürasyon reaksiyonunun veya DNA hibridizasyonunun kinetiğini inceleyerek bu sorunları çözmenin mümkün olduğu ortaya çıktı. Solüsyonlardaki parçalanmış DNA molekülleri termal denatürasyona tabi tutulursa ve daha sonra denatürasyonun meydana geldiği sıcaklıktan biraz daha düşük bir sıcaklıkta inkübe edilirse, tamamlayıcı zincirlerin yeniden birleşmesi - renatürasyon nedeniyle DNA parçalarının orijinal çift sarmallı yapısı geri yüklenir. DNA virüsleri ve prokaryotik hücreler için, bu tür bir yeniden doğallaşma oranının doğrudan genomun boyutuna bağlı olduğu gösterilmiştir; genom ne kadar büyük olursa, parçacık veya hücre başına DNA miktarı o kadar fazla olur, tamamlayıcı zincirlerin rastgele yaklaşımı ve nükleotid sekansı farklı olan daha fazla sayıda DNA fragmanının spesifik olarak yeniden birleştirilmesi için o kadar fazla zamana ihtiyaç duyulur (Şekil 53). Prokaryotik hücrelerin DNA yeniden birleşme eğrisinin doğası, prokaryotik genomda tekrarlanan baz dizilerinin bulunmadığını gösterir; DNA'larının tüm bölümleri benzersiz diziler taşır; bunların sayısı ve çeşitliliği, nesnelerin genetik bileşiminin karmaşıklık derecesini ve dolayısıyla genel biyolojik organizasyonunu yansıtır.

Ökaryotik organizmalarda DNA yeniden birleşmesinin tamamen farklı bir tablosu gözlenir. DNA'larının, genomlarının boyutuna bağlı olarak beklenenden çok daha yüksek oranda yeniden doğallaşan kısımların yanı sıra, prokaryotların benzersiz DNA dizileri gibi yavaş yavaş yenilenen bir DNA kısmı içerdiği ortaya çıktı. Bununla birlikte ökaryotların, genomlarının genel büyüklüğü ve çok sayıda farklı benzersiz gen ile ilişkili olan bu fraksiyonu yeniden doğallaştırmak için önemli ölçüde daha fazla zamana ihtiyacı vardır.

Ökaryotik DNA'nın yüksek oranda renatürasyon ile karakterize edilen kısmında iki alt fraksiyon ayırt edilir: 1) benzer DNA bölümlerinin 10 6 kez tekrarlanabildiği yüksek oranda veya sıklıkla tekrarlanan dizilere sahip bir fraksiyon; 2) genomda 10 2 -10 3 kez meydana gelen, orta derecede tekrarlayan dizilerin bir kısmı. Dolayısıyla farelerde, sık sık tekrarlanan dizilere sahip DNA fraksiyonu, genom başına toplam DNA miktarının %10'unu içerir ve %15'i, orta derecede tekrarlanan dizilere sahip fraksiyondan sorumludur. Tüm fare DNA'sının geri kalan %75'i, çok sayıda farklı, tekrarlanmayan gene karşılık gelen benzersiz bölgelerle temsil edilir.

Yüksek oranda tekrarlanan dizilere sahip fraksiyonlar, DNA kütlesinden farklı bir kaldırma yoğunluğuna sahip olabilir ve bu nedenle fraksiyonlar olarak adlandırılan saf formda izole edilebilir. uydu DNA'sı. Farede bu fraksiyonun yoğunluğu 1,691 g/ml'dir ve DNA'nın ana kısmı 1,700 g/ml'dir. Bu yoğunluk farklılıkları, nükleotid bileşimindeki farklılıklarla belirlenir. Örneğin bir farede bu fraksiyonda %35 G ve C çifti, ana DNA zirvesinde ise %42 bulunur.

Anlaşıldığı üzere, uydu DNA veya sık sık tekrarlanan dizilere sahip DNA fraksiyonu, hücredeki ana RNA türlerinin sentezinde yer almaz ve protein sentezi süreciyle ilişkili değildir. Bu sonuca hiçbir hücre RNA tipinin (tRNA, mRNA, rRNA) uydu DNA ile hibridize olmadığı gerçeğine dayanılarak varılmıştır. Sonuç olarak, bu DNA'lar hücresel RNA'nın sentezinden sorumlu dizileri içermez; uydu DNA'ları RNA sentezi için şablon değildir ve transkripsiyona dahil değildir.

Doğrudan protein sentezinde yer almayan, oldukça tekrarlayan dizilerin, kromozomların bakımı ve işleyişinde önemli bir yapısal rol oynayan bilgileri taşıyabileceği yönünde bir hipotez vardır. Bunlar, fazlar arası çekirdeğin çekirdek proteinleriyle ilişkili çok sayıda DNA bölümünü (aşağıya bakın), replikasyon veya transkripsiyonun kökenindeki bölgeleri ve ayrıca bu süreçleri düzenleyen DNA bölümlerini içerebilir.

Nükleik asitlerin doğrudan kromozomlar üzerinde hibridizasyon yönteminin kullanılması ( yerinde) bu fraksiyonun lokalizasyonu araştırıldı. Bunu yapmak için, bakteriyel enzimler kullanılarak izole edilmiş uydu DNA üzerinde 3H-üridin ile etiketlenmiş RNA sentezlendi. Daha sonra kromozomlu sitolojik preparat, DNA denatürasyonunun (yüksek sıcaklık, alkali ortam vb.) meydana gelmesini sağlayacak bir işleme tabi tutuldu. Daha sonra preparatın üzerine 3H etiketli RNA yerleştirildi ve DNA ile RNA arasında hibridizasyon sağlandı. Otoradyografi, etiketin çoğunun kromozomların birincil daralma bölgesinde, bunların sentromerik bölgeleri bölgesinde lokalize olduğunu ortaya çıkardı. İşaret, kromozomların diğer bölgelerinde de tespit edildi, ancak çok zayıftı (Şekil 54).

Son 10 yılda eğitimde büyük ilerlemeler kaydedildi sentromerik DNAözellikle maya hücrelerinde. Öyleyse yap S. cerevisiae Centromerik DNA, 110 bp'lik tekrar eden bölgelerden oluşur. AT baz çiftleri bakımından zenginleştirilmiş iki korunmuş bölgeden (I ve III) ve merkezi bir elemandan (II) oluşur. Drosophila kromozomları benzer bir sentromer DNA yapısına sahiptir. İnsan sentromerik DNA'sı (alfoid uydu DNA), dimer veya pentamer grupları halinde düzenlenmiş 170 bp'lik monomerlerden oluşan bir tandemden oluşur ve bunlar da 1-6 x 103 bp'lik büyük diziler oluşturur. Bu en büyük birim 100-1000 kez tekrarlanır. Özel sentromerik proteinler bu spesifik sentromerik DNA ile kompleks oluşturur ve oluşumunda rol oynar. kinetokor kromozomların iğ mikrotübülleri ile bağlantısını ve kromozomların anafazdaki hareketini sağlayan bir yapıdır (aşağıya bakınız).

Oldukça tekrarlayan dizilere sahip DNA da bulunmuştur. telomerik bölgeler Birçok ökaryotik organizmanın (mayadan insana kadar) kromozomları. Tekrarlar en sık burada bulunur ve bunlar 3-4 guanin nükleotid içerir. İnsanlarda telomerler 500-3000 TTAGGG tekrarı içerir. DNA'nın bu bölümleri, kromozomun uçlarını sınırlamak ve tekrarlanan replikasyon işlemi sırasında kısalmasını önlemek için özel bir rol oynar.

Son zamanlarda, fazlar arası kromozomların yüksek oranda tekrarlayan DNA dizilerinin, nükleer zarfın altında yatan lamin proteinlerine spesifik olarak bağlandığı ve uzatılmış yoğunlaştırılmış fazlar arası kromozomların sabitlenmesine katıldığı, böylece fazlar arası çekirdeğin hacmindeki kromozomların lokalizasyonundaki sırayı belirlediği bulunmuştur.

Mayoz sırasında kromozomların homolog bölgelerinin tanınmasında uydu DNA'nın rol oynayabileceği öne sürülmüştür. Diğer varsayımlara göre, sıklıkla tekrarlanan dizilere sahip bölgeler, kromozomal DNA'nın çeşitli fonksiyonel birimleri arasında, örneğin replikonlar arasında ayırıcı (aralayıcı) rolü oynar (aşağıya bakınız).

Orta derecede tekrarlanan (10 2 ila 10 5 kez) dizilerin fraksiyonu, protein sentezi aparatının oluşturulması süreçlerinde önemli bir rol oynayan alacalı bir DNA bölgeleri sınıfına aittir. Bu fraksiyon, farklı türlerde 100 ila 1000 kez tekrarlanabilen ribozomal DNA genlerini içerir. Bu fraksiyon, tüm tRNA'ların sentezi için birçok kez tekrarlanan bölgeleri içerir. Üstelik belirli proteinlerin sentezinden sorumlu bazı yapısal genler de birçok kez tekrarlanabilir ve çok sayıda kopyayla temsil edilebilir. Bunlar, 400 defaya kadar tekrarlanan kromatin proteinleri (histonlar) genleridir.

Ek olarak, bu fraksiyon, yine birçok kez tekrarlanan, ancak genom boyunca dağılmış, farklı dizilere (her biri 100-400 nükleotid çifti) sahip DNA bölümlerini içerir. Rolleri henüz tam olarak belli değil. Bu tür DNA bölümlerinin farklı genlerin alıcı veya düzenleyici bölgelerini temsil edebileceği öne sürülmüştür.

Dolayısıyla, ökaryotik hücrelerin DNA'sı bileşim açısından heterojendir ve birkaç sınıf nükleotit dizisi içerir: sık sık tekrarlanan diziler (> 10 6 kez), uydu DNA fraksiyonuna dahil edilir ve kopyalanmaz; genom boyunca dağılmış kısa dizilerin yanı sıra gerçek gen bloklarını temsil eden, orta derecede tekrarlayan dizilerin bir kısmı (10 2 -10 5); hücre proteinlerinin çoğunluğu için bilgi taşıyan benzersiz dizilerin bir kısmı.

Bu fikirlere dayanarak, farklı organizmalarda gözlenen DNA miktarındaki farklılıklar netleşiyor: Bunlar, organizmaların genomundaki belirli DNA sınıflarının eşit olmayan oranıyla ilişkili olabilir. Yani örneğin bir amfibide Amphiuma(insanlardan 20 kat daha fazla DNA'ya sahip olan) tekrarlayan diziler, toplam DNA'nın %80'ini, soğanlarda - 70'e kadar, somonda - %60'a kadarını vb. oluşturur. Genetik bilginin gerçek zenginliği, benzersiz dizilerin oranıyla yansıtılmalıdır. Kromozomun doğal, parçalanmamış bir DNA molekülünde, kendine özgü, orta ve sık tekrarlanan diziler içeren tüm bölgelerin tek bir dev kovalent DNA zincirine bağlı olduğunu unutmamalıyız.

DNA molekülleri yalnızca farklı nükleotid dizilimi alanlarında heterojen değildir, aynı zamanda sentetik aktiviteleri açısından da farklılık gösterir.

Ökaryotik DNA replikasyonu

Bakteri kromozomu, bir replikasyon başlangıç noktası ve bir bitiş noktasına sahip olan tek bir yapısal birim olarak replike olur. Dolayısıyla bakteriyel dairesel DNA birdir kopya. Başlangıç noktasından itibaren replikasyon iki zıt yönde ilerler, böylece DNA sentezlenirken, viral ve bakteriyel replikasyon yapan kromozomların elektron mikroskobik incelemesi sırasında açıkça görülebilen, her iki tarafı replikasyon çatallarıyla sınırlanan, replikasyon gözü olarak adlandırılan bir göz oluşur. .

Ökaryotik hücrelerde replikasyon organizasyonu farklı bir yapıya sahiptir - polireplikon.Daha önce de belirtildiği gibi, 3 HT'nin darbeli dahil edilmesiyle, hemen hemen tüm mitotik kromozomlarda çoklu bir etiket belirir. Bu, fazlar arası kromozomda aynı anda birçok replikasyon bölgesinin ve birçok otonom replikasyon kaynağının bulunduğu anlamına gelir. Bu fenomen, DNA'dan izole edilen etiketli moleküllerin otoradyografisi kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenmiştir (Şekil 55).Eğer hücreler 3HT ile darbe etiketliyse, o zaman bir ışık mikroskobunda izole edilmiş DNA'nın imzaları üzerinde indirgenmiş gümüş alanları görülebilir. noktalı çizgiler şeklinde. Bunlar, çoğalmayı başaran küçük DNA parçalarıdır ve bunların arasında, otoradyografi bırakmayan ve dolayısıyla görünmez kalan, kopyalanmamış DNA bölümleri vardır. 3 NT'nin hücreye temas süresi arttıkça bu bölümlerin boyutu artar ve aralarındaki mesafe azalır. Bu deneylerden ökaryotik organizmalardaki DNA replikasyon hızı doğru bir şekilde hesaplanabilir. Çoğaltma çatalının hareket hızının 1-3 kb olduğu ortaya çıktı. memelilerde dakikada yaklaşık 1 kb. Bazı bitkilerde dakika başına bu oran, bakterilerdeki DNA replikasyon hızından (dakikada 50 kb) çok daha düşüktür. Aynı deneylerde, ökaryotik kromozomların DNA'sının polireplikon yapısı doğrudan kanıtlanmıştır: kromozomal DNA'nın uzunluğu boyunca, birçok bağımsız replikasyon bölgesi - replikonlar vardır. Bitişik etiketleme replikonlarının orta noktaları arasındaki mesafeye göre, yani. İki bitişik replikon başlangıç noktası arasındaki mesafeye bağlı olarak bireysel replikonların boyutu belirlenebilir. Ortalama olarak yüksek hayvanların replikon boyutu yaklaşık 30 µm veya 100 kb'dir. Bu nedenle haploid memeliler kümesinde 20.000-30.000 replikon bulunmalıdır. Alt ökaryotlarda replikonlar daha küçüktür, yaklaşık 40 kb. Böylece, Drosophila'da genom başına 3500 replikon vardır ve mayada - 400. Bahsedildiği gibi, bir replikonda DNA sentezi iki zıt yönde gerçekleşir. Bu, otoradyografi ile kolayca kanıtlanabilir: eğer hücrelerin, bir puls etiketinden sonra, 3 HT'siz bir ortamda bir süre DNA sentezlemeye devam etmesine izin verilirse, o zaman DNA'ya dahil edilmesi azalacak, etikette bir seyreltme meydana gelecek ve daha sonra Otoradyografide, kopyalanan bölgenin her iki yanında simetrik bir desen görmek mümkün olacak ve bu da indirgenmiş gümüş taneciklerinin sayısını azaltacaktır.

Bir replikondaki kopyalanan uçlar veya çatallar, komşu replikonların çatallarıyla karşılaştıklarında (komşu replikonlar için ortak bir terminal noktasında) hareket etmeyi durdururlar. Bu noktada, komşu replikonların kopyalanmış bölümleri, yeni sentezlenen iki DNA molekülünün tek kovalent zincirleri halinde birleştirilir. Kromozom DNA'sının replikonlara fonksiyonel bölünmesi, DNA'nın bazları daha önce de belirtildiği gibi protein bağları ile bir arada tutulan alanlara veya ilmeklere yapısal bölünmesiyle örtüşür.

Böylece, tek bir kromozom üzerindeki tüm DNA sentezi, birçok bireysel replikon üzerinde bağımsız sentez ve ardından bitişik DNA bölümlerinin uçlarının birleştirilmesi yoluyla gerçekleşir. Bu özelliğin biyolojik anlamı, bakteriler ve ökaryotlardaki DNA sentezini karşılaştırırken netleşir. Böylece yaklaşık yarım saatlik bir hızla 1600 mikron uzunluğunda bir bakteri monoreplikon kromozomu sentezlenir. Bir memeli kromozomunun santimetre uzunluğundaki DNA molekülü de monoreplikon yapı olarak kopyalansaydı bu işlem yaklaşık bir hafta (6 gün) sürerdi. Ancak böyle bir kromozom birkaç yüz replikon içeriyorsa, tam kopyalanması yalnızca bir saat kadar sürecektir. Aslında memelilerde DNA replikasyon süresi 6-8 saattir. Bunun nedeni, tek bir kromozomun tüm replikonlarının aynı anda açılmamasıdır.

Bazı durumlarda, tüm replikonların eşzamanlı olarak dahil edilmesi veya ek replikasyon kökenlerinin ortaya çıkması gözlenir, bu da tüm kromozomların sentezinin minimum kısa sürede tamamlanmasını mümkün kılar. Bu fenomen bazı hayvanların embriyogenezinin erken dönemlerinde ortaya çıkar. Pençeli kurbağaların yumurtalarını ezerken Ksenopus laeviler DNA sentezi sadece 20 dakika sürerken, somatik hücre kültüründe bu süreç yaklaşık bir gün sürer. Drosophila'da da benzer bir tablo gözlenir: Erken embriyonik aşamalarda, çekirdekteki tüm DNA sentezi 3,5 dakika sürer ve doku kültürü hücrelerinde 600 dakika sürer. Aynı zamanda kültür hücrelerindeki replikonların boyutunun embriyolara göre neredeyse 5 kat daha büyük olduğu ortaya çıktı.

DNA sentezi, tek bir kromozomun uzunluğu boyunca eşit olmayan bir şekilde gerçekleşir. Bireysel bir kromozomda aktif replikonların, 20-80 replikasyon kaynağı içeren replikatif birimler halinde gruplar halinde toplandığı bulunmuştur. Bunu, kopyalanan segmentlerin tam olarak bu şekilde bloke edildiği DNA imzalarının analizi takip etti. Replikon veya replikon birimlerinin blokları veya kümelerinin varlığı fikrinin bir başka temeli, bir timidin analoğu olan 5'-bromodeoksiüridin'in (BrdU) DNA'ya dahil edilmesiyle yapılan deneylerdi. BrdU'nun fazlar arası kromatine dahil edilmesi, mitoz sırasında BrdU'lu alanların, timidin dahil edilen alanlara göre daha az yoğunlaşmasına (yetersiz yoğunlaşma) yol açar. Bu nedenle, mitotik kromozomların BrdU'nun dahil olduğu bölgeleri, diferansiyel boyama sırasında zayıf bir şekilde boyanacaktır. Bu, senkronize hücre kültürleri kullanılarak BrdU'nun dahil edilme sırasının belirlenmesini mümkün kılar; Bir kromozomun uzunluğu boyunca DNA sentezi dizisi. Öncünün kromozomun geniş bölümlerine dahil edilmesinin meydana geldiği ortaya çıktı. Farklı bölümlerin dahil edilmesi, S dönemi boyunca kesinlikle sırayla gerçekleşir. Her kromozom, uzunluğu boyunca replikasyon sırasının yüksek stabilitesi ile karakterize edilir ve kendine özgü replikasyon modeline sahiptir.

Çoğaltma birimleri halinde birleştirilen replikon kümeleri, replikasyon enzimleriyle birlikte sözde adı verilen proteinleri oluşturan nükleer matris proteinleri (aşağıya bakınız) ile ilişkilidir. Clusterozomlar, interfaz çekirdeğinde DNA sentezinin meydana geldiği bölgelerdir.

Çoğaltma birimlerinin etkinleştirilme sırası muhtemelen bu bölgelerdeki kromatin yapısı tarafından belirlenebilir. Örneğin, yapısal heterokromatin bölgeleri (sentromere yakın) genellikle S döneminin sonunda kopyalanır; ayrıca S döneminin sonunda fakültatif heterokromatinin bir kısmı iki katına çıkar (örneğin, dişilerin X kromozomu). memeliler). Kromozom bölümlerinin replikasyon sırası, zaman içinde kromozomların diferansiyel renklenme modeliyle özellikle açık bir şekilde ilişkilidir: R-segmentleri erken kopyalanan bölümlere aittir, G-segmentleri geç replikasyona sahip kromozom bölümlerine karşılık gelir. C segmentleri (sentromerler) en son replikasyon bölgeleridir.

Farklı kromozomlarda, diferansiyel renkli segmentlerin farklı gruplarının boyutu ve sayısı farklı olduğundan, bu, bir bütün olarak farklı kromozomların eş zamanlı olmayan replikasyonunun başlangıcı ve bitişinin bir resmini oluşturur. Her durumda, setteki bireysel kromozomların replikasyonunun başlangıç ve bitiş sırası rastgele değildir. Setteki diğer kromozomlara göre kesin bir kromozom üreme dizisi vardır.

Bireysel kromozomların replikasyon sürecinin süresi doğrudan boyutlarına bağlı değildir. Böylece, A grubunun (1-3) büyük insan kromozomları, B grubunun (4-5) daha kısa kromozomlarının yanı sıra tüm S periyodu boyunca etiketlenir.

Böylece ökaryotik genomdaki DNA sentezi, S döneminin başlangıcında çekirdeğin tüm kromozomlarında neredeyse aynı anda başlar. Ancak aynı zamanda hem kromozomların farklı kısımlarında hem de farklı kromozomlarda farklı replikonların sıralı ve eşzamansız olarak dahil edilmesi meydana gelir. Belirli bir genom bölgesinin replikasyon dizisi kesinlikle genetik olarak belirlenir. Bu son ifade, yalnızca etiketin S döneminin farklı bölümlerine dahil edilme modeliyle değil, aynı zamanda S dönemi sırasında belirli genlerin mutajenlere duyarlılığındaki zirvelerin kesin bir diziliş görünümüyle de kanıtlanmıştır. -dönem.

1. Kromatin türleri

2. Genler, ayırıcılar

3. DNA'daki nükleotid dizisi

4. DNA'nın mekansal organizasyonu

1. Bölünme eylemleri arasındaki dinlenme sırasında, kromozomların belirli bölümleri ve kromozomların tamamı kompakt kalır. Bu kromatin bölgelerine denir. heterokromatin. İyi resim yapıyor.

Nükleer bölünmeden sonra kromatin gevşer ve bu forma denir. ökromatin. Heterokromatin, transkripsiyonla ilgili olarak aktif değildir ve DNA replikasyonuyla ilgili olarak ökromatinden farklı davranır.

Fakültatif heterokromatin yalnızca zaman zaman heterokromatiktir. Bilgilendiricidir, yani genleri içerir. Ökromatik duruma girdiğinde bu genler transkripsiyon için uygun hale gelebilir. İki homolog kromozomdan biri heterokromatik olabilir. Bu fakültatif heterokromatizasyon dokuya özgüdür ve belirli dokularda oluşmaz.

Yapısal heterokromatin her zaman heterokromatiktir. Tekrar tekrar tekrarlanan baz dizilerinden oluşur, bilgi vermez (gen içermez) ve bu nedenle transkripsiyonla ilgili olarak her zaman aktif değildir. Onu görebilirsin Ve nükleer fisyon sırasında. O çıkıyor:

Çoğu zaman sentromerde;

Kromozomların uçlarında (uydular dahil);

Nükleolusun düzenleyicisinin yakınında;

5S-RNA genine yakın.

Heterokromatin, esasen fakültatif, interfaz sırasında, çoğu durumda hücre çekirdeğinin veya nükleolusun kenarında yer alan, yoğun şekilde lekelenmiş bir kromo merkezde birleşebilir.

2. Her kromozom DNA'nın sürekli çift sarmalı, yüksek organizmalarda 108'den fazla baz çiftinden oluşur. Daha yüksek bitki ve hayvanların kromozomlarında, her bir DNA çift sarmalının (çapı 2 nm) bir ila birkaç santimetre uzunluğu vardır. Tekrarlanan bükümler sonucunda birkaç mikrometre uzunluğunda bir kromatid halinde paketlenir.

Genler bu çift sarmal boyunca doğrusal olarak dağılır ve hepsi birlikte DNA'nın %25'ini oluşturur.

GenDNA'nın işlevsel birimidir, Bir polipeptit veya RNA'nın sentezi için bilgi içerir. Ortalama gen uzunluğu yaklaşık 1000 baz çiftidir. Her gendeki bazların dizisi benzersizdir.

Genler arasında ara parçalar- komşu bir genin transkripsiyonunu düzenlemek için önemli olan, değişen uzunluklarda (bazen 20.000 baz çiftinden fazla) bilgi vermeyen DNA uzantıları.

Kopyalanmış aralayıcılar transkripsiyon sırasında genle birlikte sonlandırılır ve tamamlayıcı kopyaları, gen kopyasının her iki tarafında ön-i-RNA'da görünür. Genin kendisinde bile (yalnızca ökaryotlarda ve onların virüslerinde), aynı zamanda kopyalanan, intronlar adı verilen, bilgilendirici olmayan diziler vardır. İşleme sırasında intronların tüm kopyaları ve aralayıcıların çoğu kopyası enzimler tarafından çıkarılır.

Kopyalanamayan aralayıcılar histon genleri arasında ve rRNA genleri arasında meydana gelir.

Gereksiz genlerçok sayıda (en fazla 104 veya daha fazla) aynı kopyayla temsil edilir. Bu genler:

tRNA için;

5S-RNA ve histonlar;

Büyük miktarlarda sentezlenen ürünler için.

Kopyalar doğrudan yan yana bulunur ve aynı ara parçalarla çözülür. Deniz kestanesinde H4, H2b, H2a ve Hi histonlarına ait genler arka arkaya bulunur ve bu gen dizisi DNA'da 100'den fazla kez tekrarlanır.

3. Tekrarlanan diziler - Bunlar DNA'da birçok kez bulunan nükleotid dizileridir. Orta derecede tekrarlayan diziler - ortalama 300 baz çifti uzunluğunda, 10 2 -10 4 tekrarlı diziler. Bunlar, gereksiz genlerin yanı sıra çoğu aralayıcıyı da içerir.

Oldukça tekrarlayan 10 5 -10 6 tekrarlı diziler kurucu heterokromatini oluşturur. Onlar her zaman bilgilendirici değildir. Bunlar çoğunlukla kısa dizilerdir, çoğu zaman 7-10 tane bulunur ve yalnızca nadiren - yalnızca 2 (örneğin AT) veya tersine 300'den fazla nükleotit çifti. Tekrar eden bir dizi hemen diğerini takip edecek şekilde bir araya toplanırlar. Yüksek oranda tekrarlayan kromatin DNA'lara, analitik parçalama prosedürleri sırasındaki davranışlarından dolayı "uydu DNA'lar" adı verilir. Tüm kromatinin yaklaşık %75'i transkripsiyona dahil değildir: bunlar oldukça tekrarlayan dizilerdir ve kopyalanamayan aralayıcılardır.

4. İzole edilmiş kromatinde DNA çift sarmalının bölümleri histon moleküllerinin etrafına sarılır, böylece burada birinci dereceden bir süper sarmal ortaya çıkar. DNA'nın histonla oluşturduğu komplekslere ne ad verilir? nükleozomlar. Disk veya mercek şeklindedirler ve boyutları yaklaşık 10 x 10 x 5 nm'dir. Bir nükleozom dahil:

8 molekül histonlar:

İki H3 ve iki H4 molekülünün merkezi tetrameri; ve ayrı ayrı iki H 2a ve H2b;

Bir sarmalın yaklaşık 1,25 dönüşünü oluşturan ve merkezi tetramere sıkı bir şekilde bağlanan bir DNA bölümü (yaklaşık 140 baz çifti).

Nükleozomlar arasında süperhelikal bir yapıya sahip olmayan 30-100 baz çiftinden oluşan bir sarmalın bölümleri vardır; Histon buraya bağlanır Merhaba

Dikişli kromatinde DNA, görünüşe göre histon Hi (ve bazı histon olmayan proteinler) tarafından sabitlenen, az anlaşılan daha fazla sarmal (yüksek dereceli süper sarmal) ile daha da kısaltılır. Ara faza geçiş sırasında, bazı yüksek dereceli süper bobinlerin gevşemesi nedeniyle ökromatin gevşer. Bu muhtemelen histonlardaki konformasyonel değişikliklerin ve Hi molekülleri arasındaki etkileşimlerin zayıflamasının bir sonucu olarak ortaya çıkar. 10-25 nm kalınlığındaki kromatin yapıları (ana kromatin iplikleri veya sarmalları) da interfaz sırasında görülebilir.

1. Kromatin türleri

2. Genler, ayırıcılar

3. DNA'daki nükleotid dizisi

4. DNA'nın mekansal organizasyonu

Çoğu zaman sentromerde;

Kromozomların uçlarında (uydular dahil);

Nükleolusun düzenleyicisinin yakınında;

5S-RNA genine yakın.

Heterokromatin, esasen fakültatif, interfaz sırasında, çoğu durumda hücre çekirdeğinin veya nükleolusun kenarında yer alan, yoğun şekilde lekelenmiş bir kromo merkezde birleşebilir.

Genler bu çift sarmal boyunca doğrusal olarak dağılır ve hepsi birlikte DNA'nın %25'ini oluşturur.

GenDNA'nın işlevsel birimidir, Bir polipeptit veya RNA'nın sentezi için bilgi içerir. Ortalama gen uzunluğu yaklaşık 1000 baz çiftidir. Her gendeki bazların dizisi benzersizdir.

Genler arasında ara parçalar- komşu bir genin transkripsiyonunu düzenlemek için önemli olan, değişen uzunluklarda (bazen 20.000 baz çiftinden fazla) bilgi vermeyen DNA uzantıları.

Kopyalanamayan aralayıcılar histon genleri arasında ve rRNA genleri arasında meydana gelir.

Gereksiz genlerçok sayıda (en fazla 104 veya daha fazla) aynı kopyayla temsil edilir. Bu genler:

tRNA için;

5S-RNA ve histonlar;

Büyük miktarlarda sentezlenen ürünler için.

8 molekül histonlar:

İki H3 ve iki H4 molekülünün merkezi tetrameri; ve ayrı ayrı iki H 2a ve H2b;

Bir sarmalın yaklaşık 1,25 dönüşünü oluşturan ve merkezi tetramere sıkı bir şekilde bağlanan bir DNA bölümü (yaklaşık 140 baz çifti).

Nükleozomlar arasında süperhelikal bir yapıya sahip olmayan 30-100 baz çiftinden oluşan bir sarmalın bölümleri vardır; Histon buraya bağlanır Merhaba

Transkripsiyonel olarak aktif kromatin - bilgilerini sentez yoluyla ileten genler RNA, daha fazla despiralizasyon sonucunda daha da gevşer. Bazı verilere göre, DNA sarmalının ilgili bölümlerinde histon Hi ya yoktur ya da kimyasal olarak değiştirilmiş, örneğin fosforile edilmiştir.

Nükleozom yapısı aynı zamanda değişir veya tamamen yok edilir (nükleolustaki r-RNA genlerinde). Çift sarmal belirli yerlerde gevşer. Görünüşe göre bu süreçler, DNA'nın kopyalanan bölgelerinde biriken histon olmayan bazı proteinleri içeriyor.

Soru 38. Kromozom seti

/. Genetik şifre. Hücre ploidisi

2. Polietilen kromozomlar

1. Her hücre çekirdeğinin tüm genetik bilgi birikimi - genetik şifre- belirli bir sabit sayıda kromozom (n) arasında dağıtılır. Bu sayı her türe veya alt türe özeldir. At yuvarlak kurdunda 1, mısırda - 10, insanlarda - 23, alglerde Netrium rakamı - yaklaşık 600. Aynı setin kromozomları farklıdır aşağıdaki kriterlere göre:

boyut;

Bir kromometrenin resmi;

Kısıtlamaların konumu;

Bağlı olarak kromozom setinin çokluğu - ploidi- hücreler bölünür:

Haploide;

Diploit;

Poliploid.

Haploit tek bir kromozom seti içeren hücrelere (“), örneğin cinsiyet hücrelerine denir.

Hücreler çift kromozom seti (2P) içeriyorsa, diploit,çünkü genetik bilgi onlarda iki kez sunulur. Yüksek bitki ve hayvanların hemen hemen tüm somatik hücreleri diploiddir. Bir baba ve bir anne kromozom seti içerirler.

İÇİNDE poliploid hücrelerde birkaç kromozom seti bulunur (4 P, 8 P, 16 P, vb.). Bu hücreler çoğunlukla, memelilerdeki birçok karaciğer hücresi gibi özellikle metabolik olarak aktiftir.

Mayoz bölünme sonucu diploid hücrelerden haploid hücreler, döllenme sonucu haploid hücrelerden ise diploid hücreler oluşur.

Poliploid hücreler diploid olanlardan endomitoz (erken kesintiye uğramış nükleer bölünme) yoluyla ortaya çıkar: tam replikasyon ve kromatidlerin ayrılmasından sonra, yavru kromozomlar iki çekirdek arasında dağıtılmak yerine tek bir hücre çekirdeğinde kalır. Bu işlem birçok kez tekrarlanabilir.

Anormallikler germ hücrelerinin oluşumu sırasında tüm organizmanın poliploidisine yol açabilir. Şu tarihte: eksik çoğaltma Heterokromatin gibi genomun bazı kısımları, poliploid hale gelen diğer kısımların aksine, endomitozdan sonra kopyalanmaz ve diploid kalır.

Gen amplifikasyonu - bu, yalnızca belirli genlerin kopyalandığı ve poliploid (çekirdekçikteki rRNA genleri) haline geldiği çoklu süper kopyalamadır.

Kromozomlar diploit çekirdek iki homolog kromozom çiftler halinde gruplandırılabilir. Çoğu (sözde) otozomlar) ikili olarak aynı. Bir bireyin cinsiyetini belirleyen yalnızca iki cinsiyet kromozomu erkeklerde aynı değildir; bunlar X ve Y kromozomlarıdır. (heterokromozomlar). Y kromozomunun çoğu yapısal heterokromatin tarafından işgal edilmiştir. Dişilerin iki X kromozomu vardır. Ancak kelebeklerde, kuşlarda ve diğer bazı hayvanlarda durum tam tersidir: erkeklerde XX seti, dişilerde ise XY seti bulunur.

2. Polietilen kromozomlar(dev kromozomlar) normal olanlardan kat kat daha fazla DNA içerir. Bölünme döngüsü boyunca şekillerini değiştirmezler ve 0,5 mm uzunluğa ve 25 mikron kalınlığa ulaşırlar. Örneğin dipteranların (sinekler ve sivrisinekler) tükürük bezlerinde, siliatların makronükleusunda ve fasulyelerin yumurtalık dokularında bulunurlar. Homolog kromozomlar yakından eşleştiğinden çoğu zaman haploid sayısında görünürler. Politenya Endoreplikasyonun bir sonucu olarak ortaya çıkar. Endomitoz ile karşılaştırıldığında, bu daha da azaltılmış bir bölünme sürecidir; replikasyondan sonra kromatitler ayrılmaz (işlem birçok kez tekrarlanır). burada DNA'nın farklı uzantıları çarpılır değişen derecelerde:

Sentromer alanları - önemsiz;

En bilgilendirici alanlar yaklaşık 1000 kattır;

Bazıları - 30.000'den fazla kez.

Bu yüzden polietilen kromozomlar Bunlar tamamen ayrılmamış sayısız kromatit demetleridir. Kromatidler gerilir, homolog kromomerler kromozom boyunca yakın konumlanmış koyu renkli diskler oluşturur. Bu diskler daha açık renkli şeritlerle ayrılır. Muhtemelen, kromatid üzerinde, aralayıcıya ek olarak bir disk ve bir ara şerit oluşur, görünüşe göre diskte bulunan bir gen (daha az sıklıkla birkaç gen). Politen kromozomları heterokromatin bakımından son derece zayıftır.

Polietilen kromozomlar üzerinde ayrı diskler bazen şişer Puflar(Balbiani çalar). Burada homolog kromatitler birbirinden ayrılır, homolog kromomerler birbirinden ayrılır ve transkripsiyonel olarak aktif kromatinin gevşek bir yapısı ortaya çıkar. Puflar, disklerden daha az histon Hi içerir ve bunun yerine RNA polimeraz enzimini (RNA sentezini gösterir) içerir. Ara bantlarda da çok az histon Hi bulunur, ancak RNA polimeraz vardır ve muhtemelen en azından küçük sentez meydana gelir. RNA.

Bir kromatin preparatında DNA genellikle %30-40'ı oluşturur. Bu DNA çift sarmallı bir moleküldür. Kromatin DNA'nın molekül ağırlığı 7-9*106'dır. Preparatlardan elde edilen bu kadar nispeten küçük bir DNA kütlesi, kromatin izolasyonu işlemi sırasında DNA'nın mekanik olarak hasar görmesi ile açıklanabilir.

Hücrelerin nükleer yapılarında, yani organizmaların genomunda yer alan toplam DNA miktarı türden türe değişmektedir. Ökaryotik organizmalarda hücre başına DNA miktarını karşılaştırırken, organizmanın karmaşıklık derecesi ile çekirdek başına DNA miktarı arasında herhangi bir korelasyonu ayırt etmek zordur. Keten, deniz kestanesi, levrek (1,4-1,9 pg) veya kömür balığı ve boğa balığı (6,4 ve 7 pg) gibi farklı organizmalar yaklaşık olarak aynı miktarda DNA'ya sahiptir.

Bazı amfibilerin çekirdeklerinde insan çekirdeğinden 10-30 kat daha fazla DNA bulunur, ancak insanların genetik yapısı kurbağalarınkiyle karşılaştırılamayacak kadar karmaşıktır. Sonuç olarak, daha düşük organize organizmalardaki "fazla" DNA miktarının ya genetik bir rolün yerine getirilmesiyle ilişkili olmadığı ya da gen sayısının birkaç kez tekrarlandığı varsayılabilir.

Uydu DNA veya sık sık tekrarlanan dizilere sahip DNA fraksiyonu, mayoz sırasında kromozomların homolog bölgelerinin tanınmasında rol oynayabilir. Diğer varsayımlara göre bu bölgeler, kromozomal DNA'nın çeşitli fonksiyonel birimleri arasında ayırıcı (aralayıcı) görevi görür.

Orta derecede tekrarlanan (10 2 ila 10 5 kez) dizilerin fraksiyonu, metabolik süreçlerde önemli bir rol oynayan alacalı bir DNA bölgeleri sınıfına aittir. Bu fraksiyon, tüm tRNA'ların sentezi için tekrar tekrar tekrarlanan bölümler olan ribozomal DNA genlerini içerir. Ayrıca, belirli proteinlerin sentezinden sorumlu olan bazı yapısal genler, birçok kopyayla (kromatin proteinleri için genler - histonlar) temsil edilerek birçok kez tekrarlanabilir.

Dolayısıyla ökaryotik hücrelerin DNA'sı bileşim açısından heterojendir ve birkaç sınıf nükleotid dizisi içerir:

uydu DNA fraksiyonuna dahil edilen ve kopyalanmayan sık sık tekrarlanan diziler (>10 6 kez);

genom boyunca dağılmış kısa dizilerin yanı sıra gerçek gen bloklarını temsil eden, orta derecede tekrarlayan dizilerin bir kısmı (10 2 -10 5);

hücre proteinlerinin çoğunluğu için bilgi taşıyan benzersiz dizilerin bir kısmı.

Prokaryotik bir organizmanın DNA'sı dev bir döngüsel moleküldür. Ökaryotik kromozomların DNA'sı, birbiri ardına sıralanmış farklı boyutlardaki replikonlardan oluşan doğrusal moleküllerdir. Ortalama replikon boyutu yaklaşık 30 mikrondur. Bu nedenle insan genomunun, bağımsız birimler olarak sentezlenen 50.000'den fazla replikon, DNA bölümü içermesi gerekir. Bu replikonların DNA sentezi için bir başlangıç noktası ve bir bitiş noktası vardır.

Ökaryotik hücrelerde, bakterilerdeki gibi kromozomal DNA'ların her birinin bir replikon olduğunu düşünelim. Bu durumda, dakikada 0,5 mikron sentez hızıyla (insanlar için), DNA uzunluğu yaklaşık 7 cm olan ilk kromozomun çoğaltılmasının 140.000 dakika, yani yaklaşık üç ay sürmesi gerekir. Aslında DNA moleküllerinin polireplikon yapısından dolayı tüm süreç 7-12 saat kadar sürmektedir.

Histon H1'in transkripsiyonel olarak aktif kromatinden çıkarılması 1*2* . J. Bonner (ABD) tarafından yapılan ilk deneyler, kromatin içindeki DNA'nın serbest DNA'dan çok daha kötü bir matris olduğunu gösterdi. Bu gözlemlere dayanarak histonların transkripsiyonel baskılayıcılar olduğu öne sürülmüştür.

L. N. Ananyeva ve Yu. V. Kozlov Laboratuvarımız histonların tamamının mı, yoksa sadece bazılarının mı engelleyici etkiye sahip olduğunu bulmak için yola çıktı. Bunu yapmak için, yavaş yavaş artan konsantrasyonlara sahip NaCl çözeltileri ile ekstraksiyon yoluyla fare Ehrlich asit kanseri hücrelerinin kromatininden histonlar çıkarıldı. Ortaya çıkan preparatlar, RNA sentezi için bir şablon görevi gördü. Transkripsiyon, Escherichia coli'den elde edilen RNA polimeraz, fazla alınan E. coli ve bir nükleosid trifosfat karışımı varlığında gerçekleştirildi. 0,4-0,6 M NaCl aralığında, nükleer jelin şişmesi ve hatta DNP'nin çözünmesi (eğer daha fazla mekanik işlem gerçekleştirilmişse) ile kendini gösteren, materyalde keskin bir yoğunlaşma meydana geldi. Bunun histon HI'yı seçici olarak çıkardığı gösterilmiştir. Kromatinin yoğunlaşmasının giderilmesiyle eşzamanlı olarak matris aktivitesinde keskin bir artış oldu (Şekil 26). Ekstraksiyon çözeltisindeki tuz konsantrasyonunun daha da artması, diğer histonların uzaklaştırılmasına ve matris aktivitesinde hafif fakat çok belirgin olmayan ilave bir artışa yol açtı.

0 ton. Böylece hibridlenebilirlik, sentezlenen RNA'daki tekrar eden dizilerin yüzdesini ortaya çıkarır (L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov ve yazar tarafından elde edilen sonuçlara göre); b - farklı matrislerde RNA sentezinin ana parametreleri: serbest DNA, orijinal kromatin (DNP 0) ve histon H1'in 0,6 M NaCl (DNP 0,6) ile ekstraksiyon yoluyla çıkarıldığı kromatin. RNA sentezi, etiketli nükleosid trifosfatların varlığında Escherichia coli RNA polimerazı kullanılarak gerçekleştirildi: [14C]-ATP ve [y-32P]-ATP veya [y-32P]-GTP. [ 14C]-UMP, tüm RNA'ya dahil edildi ve [y-32 P] - yalnızca zincirin başlangıcında (pp x A- veya pp x G). Başka bir deyişle, [ 32 P]'nin dahil edilmesi sentezin başlatılması hakkında ve [ 14 C] - RNA sentezinin kendisi hakkında bilgi sağladı. Bazı deneylerde inkübasyonun başlamasından 3-4 dakika sonra ortama bir antibiyotik olan rifampisin eklendi, bu da yeni RNA zincirlerinin başlatılmasını engelledi, ancak halihazırda başlamış olan sentezi yani uzamayı etkilemedi. 1 - [14C] - UMP'nin dahil edilmesi, 2 - rifampisin eklendikten sonra aynı; 3 - [γ-32P]-ATP + GTP'nin dahil edilmesi; 4 - rifampisin eklendikten sonra da aynısı. Bu dahil etme eğrilerine dayanarak, RNA polimeraz reaksiyonunun ana parametrelerini hesaplamak mümkündür (Yu. V. Kozlov ve yazar tarafından elde edilen sonuçlara dayanarak)">
Pirinç. 26. Histon H1'in kromatindeki DNA'nın şablon aktivitesi üzerindeki etkisi. a - proteinlerin kromatinden (1) çıkarılmasının, Escherichia coli'nin eksojen RNA polimerazının varlığında ikincisinin matris aktivitesi (2) ve ayrıca sentezlenen RNA'nın (3) hibridleşebilirliği üzerindeki etkisi. Histonlar ve histon olmayan proteinler, artan konsantrasyonlarda NaCl çözeltileri ile ekstre edildi. 0,4 M NaCl - 0,6 M NaCl aralığında histon H1 seçici olarak uzaklaştırıldı. Sentezlenen RNA, ara C0 t değerlerinde fazla DNA ile hibridize edildi. Böylece hibridlenebilirlik, sentezlenen RNA'daki tekrar eden dizilerin yüzdesini ortaya çıkarır (L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov ve yazar tarafından elde edilen sonuçlara göre); b - farklı matrislerde RNA sentezinin ana parametreleri: serbest DNA, orijinal kromatin (DNP 0) ve histon H1'in 0,6 M NaCl (DNP 0,6) ile ekstraksiyon yoluyla çıkarıldığı kromatin. RNA sentezi, etiketli nükleosid trifosfatların varlığında Escherichia coli RNA polimerazı kullanılarak gerçekleştirildi: [14C]-UTP ve [y-32P]-ATP veya [y-32P]-GTP. [ 14C]-UMP, tüm RNA'ya dahil edildi ve [y-32 P] - yalnızca zincirin başlangıcında (pp x A- veya pp x G). Başka bir deyişle, [ 32 P]'nin dahil edilmesi sentezin başlatılması hakkında ve [ 14 C] - RNA sentezinin kendisi hakkında bilgi sağladı. Bazı deneylerde inkübasyonun başlamasından 3-4 dakika sonra ortama bir antibiyotik olan rifampisin eklendi, bu da yeni RNA zincirlerinin başlatılmasını engelledi, ancak halihazırda başlamış olan sentezi yani uzamayı etkilemedi. 1 - [14C] - UMP'nin dahil edilmesi, 2 - rifampisin eklendikten sonra aynı; 3 - [γ-32P]-ATP + GTP'nin dahil edilmesi; 4 - rifampisin eklendikten sonra da aynısı. Bu dahil etme eğrilerine dayanarak, RNA polimeraz reaksiyonunun ana parametreleri hesaplanabilir (Yu. V. Kozlov ve yazar tarafından elde edilen sonuçlara dayanarak)

Sentezlenenlerin özellikleri laboratuvar ortamında Toplam fare DNA'sı ile hibridizasyon yoluyla RNA. Bu durumda tekrarlayan DNA dizilerinde sentezlenen RNA'nın bir kısmı tespit edildi. Kromatinde tekrarlanan DNA dizilerinin transkripsiyonunun sınırlı olduğu ortaya çıktı. Ancak kromatinin 0,6 M NaCl ile ekstraksiyonundan sonra, histon H1 çıkarıldığında, bu kromatinin matrisi üzerinde ve serbest DNA matrisi üzerinde sentezlenen RNA'nın hibridizasyon özellikleri birbirinden ayırt edilemez hale geldi. H2a, H2b, H3 ve H4 histonlarının (daha sonra farklı şekilde adlandırıldılar - orta derecede lizin açısından zengin ve arginin açısından zengin histonlar) transkripsiyon baskılamasında yer almadığını, ancak kromatin organizasyonunda tamamen yapısal bir rol oynadığını, histon H1'in (eski histonlarda) olduğunu varsaydık. terminoloji histon, lisin açısından zengin) RNA sentezinin bir inhibitörüdür. Aynı zamanda kromatin yoğunlaşmasına neden olan bir faktördür (yukarıya bakınız).

Daha sonra Yu.V. Kozlov, yine E, coli'den izole edilen RNA polimeraz ile hücre içermeyen bir sistem üzerinde histon H1 tarafından transkripsiyon inhibisyonunun mekanizmasını inceledi. Histon H1'in başlatma ve uzama süreçleri üzerindeki etkisi incelenmiştir (bkz. Şekil 26, Tablo 4). Doğal kromatin matrisinde başlatılan RNA zincirlerinin sayısını birkaç kez azalttığı ortaya çıktı. Uzama özellikle keskin bir şekilde engellenir: RNA polimeraz 100-150 bp'den fazlasını okumaz. DNA ve sonra durur. Bu arada, histon H1'in çıkarıldığı kromatin üzerinde, RNA polimeraz bir seferde birkaç bin nükleotid çiftini okur ve zincirlerin uzunluğu, serbest DNA şablonu üzerinde sentezlenen zincirlerin uzunluğundan farklı değildir. Doğru, serbest DNA'da, H1 histonunun çıkarıldığı kromatinle karşılaştırıldığında, RNA sentezinin başlatılması süreçleri daha verimli bir şekilde gerçekleşir. Histon H1'in kromatini yoğunlaştırarak RNA polimeraz yolunda engeller oluşturduğu ve dolayısıyla RNA sentezini durdurduğu sonucuna varıldı.

* (DNPM, tamamen çözünebilen ancak histon H1'i koruyan üre işlemiyle izole edilen DNP'dir.)

Histon H1'in varlığına bağlı olan 300 A-DNP fibrilinin solenoid yapısına ilişkin modern verilerin ışığında bu sonuç kolaylıkla açıklanabilir. Gerçekte, RNA polimerazın solenoidde 100 bp'den fazlasını okuyamadığı açıktır. Tamamen topolojik kısıtlamalardan dolayı.

Hipotezimize göre gen aktive edildiğinde histon H1'in çıkarılması gerekir. Ancak o dönemde bunu doğrulamak mümkün değildi. Gen aktivasyonu sırasında histon H1'in kromatinden kaybına ilişkin kanıtlar ancak nispeten yakın zamanda ortaya çıktı. Bu nedenle, aktif olarak kopyalanan kromatin bölgeleri, örneğin mini-nükleoller, bir dizi organizmadan izole edildiğinde, bunlarda histon H1 tespit edilmedi. Tüm genlerin potansiyel olarak aktif olduğu mayalarda da bulunmaz.

Laboratuvarda ikna edici sonuçlar elde edildi A. D. Mirzabekova V. L. Karpov ve O. V. Preobrazhenskaya. “Histone gölge hibridizasyonu” adı verilen bir yöntem geliştirdiler. Bunu yapmak için DNA, ortalama olarak yaklaşık 200-300 bp uzunluğundaki DNA segmenti başına bir histon molekülünün çapraz bağlandığı koşullar altında dimetil sülfat kullanılarak histonlarla çapraz bağlandı. Daha sonra DNA parçalandı ve iki boyutlu sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi gerçekleştirildi. Birinci yönde ilerledikten sonra DNA'ya bağlı histonlar proteinaz tarafından yok edildi ve zaten serbest olan DNA, ikinci yönde hızlandırıldı. Elektroforezin ilk turu sırasında farklı histonlar DNA parçalarının hareketini farklı şekillerde yavaşlattığından, ikinci çalıştırmadan sonra birkaç köşegen ortaya çıktı (Şekil 27). Genellikle üçü açıkça görülebilir: biri başlangıçta serbest olan DNA'ya, diğeri çekirdek histonlara sahip orijinal DNA komplekslerine ve üçüncüsü (altta) histon H1'e sahip orijinal DNA kompleksine karşılık gelir. Ortaya çıkan DNA bir filtreye aktarılır ve belirli bir örnekle hibritlenir. Hibridizasyon için genomun aktif olmayan bir bölgesi, örneğin Drosophila ribozomal geninin aralayıcısı alınmışsa, etiket tüm köşegenlerle ilişkilendirildi. Bununla birlikte, kromatinin izole edildiği hücrelerde kopyalanan ısı şoku geni örnek olarak kullanılmışsa, histon H1 ile DNA komplekslerine karşılık gelen diyagonal ile hibridizasyon keskin bir şekilde zayıflamış veya tamamen yok olmuştur. Başka bir deyişle, çekirdeklerde, bağlanmadan önce, kopyalanan genin DNA'sının histon H1 ile hiçbir teması yoktu.

Pirinç. 27. Transkripsiyon aktivasyonu üzerine histon H1 ve çekirdek histonların kaybı. Deneyler D. melanogaster kültür hücreleri (a, b) üzerinde 25° (a) yetiştirme koşulları ve ısı şoku (b) altında gerçekleştirildi. A durumunda ısı şoku genlerinin ifadesi yoktur; b durumunda ise çok aktiftir. Ayrıca ısı şoku genlerinin ekspresyonunun ortalama düzeyde olduğu dekoriyonize embriyolar (c) üzerinde deneyler yapıldı. DNA-protein komplekslerinin oluşumu, DNA fragmanlarının izolasyonu, iki boyutlu olarak ayrılması (protein çıkarıldıktan sonra dikey yönde) ve bir filtreye aktarıldıktan sonra, aynı filtreler farklı örneklerle hibritlendi: p70 ısı şoku geni (HS-5"); aynı genin kodlama bölgesiyle (TS kodu); rDNA genine transkripsiyonel olarak aktif olmayan bir ekleme örneğiyle (aktif değil). Aktif olmayan gende üç köşegen görülebilir ; 1 - serbest DNA, 2 - oktamer histonlu DNA kompleksleri; 3 - Histon H1'li DNA kompleksleri Kromatin aktivasyonu üzerine DNA-histon komplekslerinin zayıflaması veya kaybolması görülebilir (A. D. Mirzabekov ve diğerleri tarafından elde edilen sonuçlara göre).

Şu anda mevcut olan tüm veriler ayrı ayrı ele alındığında başka yorumlara izin vermesine rağmen, birlikte ele alındığında histon H1'in aktif kromatinden çıkarılması lehine güçlü kanıtlar sağlarlar. Ancak bu sürecin mekanizması hala tamamen belirsizdir.

Kromatin aktivasyonu sırasında nükleozomların kaderi 2* [ 154-157]. Nükleozomun çekirdeğini oluşturan H2a, H2b, H3 ve H4 histonlarının kaderi sorusu daha az açıktır. Yukarıdaki deneylerde Yu.V. Kozlova bunların varlığı, DNA'nın RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu üzerinde neredeyse hiçbir etkiye sahip değildi. E. coli.Ökaryotik kromatin hidrolizinin ürünlerini incelerken birçok yazar, nükleozomların aktif genlerin DNA'sını içerdiğini, yani ikincisinin de nükleozomlar halinde organize edildiğini buldu. Büyük deney materyalinden elde edilen veriler AD Mirzabekova ve ark. aktif olarak kopyalanmış DNA içeren nükleozomların, bazı DNA-histon temasları değiştirilmiş olsa da, temelde aktif olmayan DNA içeren nükleozomlarla aynı şekilde yapılandırıldığını göstermektedir.

Önceki bölümde tartışılan histon gölgeleriyle hibridizasyon üzerine de deneyler yapıldı (bkz. Şekil 27). Isı şoku genlerinin ya hiç çalışmadığı, yani kapatıldığı ya da düşük düzeyde çalıştığı ya da son olarak ısı şoku ile aktif transkripsiyona uyarıldığı Drosophila hücrelerinden diyagonal preparatlar hazırlandı. Her durumda kontrol numunesi, çekirdek histonlara sahip DNA komplekslerinden türetilen diyagonal de dahil olmak üzere üç diyagonalin hepsinde hibritlenen ribozomal gen ayırıcının DNA'sıydı.

Isı şoku geni de kopyalanmadığı hücrelerden bu diyagonal ile normal şekilde hibritlendi. Bununla birlikte, ısı şoku geninin orta derecede transkripsiyonuna sahip hücrelerden elde edilen materyalle ikinci diyagonalin hibridizasyonu önemli ölçüde azaldı. Son olarak, eğer köşegenler çok aktif ısı şoku mRNA sentezine sahip hücrelerden elde edildiyse, o zaman ikinci köşegen hibridizasyon sırasında hiç görünmüyordu (üçüncü olduğu gibi) ve yalnızca çapraz bağlı olmayan DNA'ya karşılık gelen köşegen ortaya çıktı DNA-protein çapraz bağlama yönteminin kullanıldığı çalışmalardan elde edilen genel sonuç, transkripsiyon sırasında, DNA zinciri boyunca hareket eden RNA polimerazın, nükleozomları DNA ile tersine çevrilebilir bir şekilde çarpıştığı ve neredeyse çıplak DNA'yı kopyaladığıydı. Transkripsiyon seviyesi düşükse ve DNA boyunca sürünen az sayıda RNA polimeraz varsa, o zaman RNA polimerazın zaten geçtiği alanda nükleozomların yeniden oluşması için zamanları olur. Transkripsiyon aktifse, DNA'nın nükleozomal yapısının onarılması için zaman yoktur ve DNA genellikle histonlardan yoksundur. Aynı zamanda, aktif kromatindeki nükleozomların organizasyonunun pratik olarak aktif olmayan kromatinden farklı olmadığı varsayılmaktadır. Son zamanlarda A.D. Mirzabekov ve ark. izole edilmiş çekirdeklerin platin preparatlarıyla işlenmesi yoluyla farklı bir yöntem kullanarak histonların DNA'ya bağlanmasına ilişkin deneyleri yeniden üretti. Bu yöntem dimetil sülfattan daha hafiftir. Temelde aynı sonuçlar elde edildi.

Bu veri kümesinin yanı sıra yazarların biraz farklı sonuçlara ulaştığı çalışmalar da var. W. Garrard ve A. Worsel(ABD), nükleaz hidrolizi ve elektron mikroskobu kullanarak kromatindeki aktif genlerin durumunu inceleyen, nükleozomların aktif kromatin içinde kaldığı, ancak dönme, yarım nükleozomlara dönüşme gibi yapısal değişikliklere uğradığı sonucuna vardı. Sonuç olarak, mikrokokal nükleaz içeren hidrolizatların elektroferogramlarındaki periyodiklik ~200 bp'dir. ~ 100 bp'lik bir periyodiklikle değiştirildi. Elektron mikroskobu ile boncuk sayısı iki katına çıkar ve boyutları küçülür. RNA polimerazın bu tür katlanmamış nükleozomlardan geçebileceği varsayılmaktadır.

Bu olasılık elde edilen verilerle de desteklenmektedir. T. Koller(İsviçre). Nükleozomları incelemek için orijinal bir yöntem geliştirdi. Hücreler, DNA'ya bağlanan ve daha sonra iki DNA ipliğini UV ışığıyla çapraz bağlayan bir madde olan psoralen ile işlenir. Ancak DNA nükleozomların bir parçasıysa psoralen ile reaksiyonu gerçekleşmez. Bu nedenle, tedavi edilen hücrelerden izole edilen DNA, formaldehit varlığında denatüre edilirse (DNA'nın renatürasyonunu önler), o zaman elektron mikroskobunda, birbirine tek şeritlerle (çapraz) bağlanan nükleozomlara karşılık gelen alternatif kabarcıklar (denatüre DNA'nın iki şeridi) ortaya çıkar. -bağlı, denatürasyon yeteneğine sahip olmayan) internükleozomal bağlayıcılara karşılık gelen DNA.DNA) üzerinde görülebilir. İlk olarak, kromozom dışı yapıların bir parçası olan ve bu nedenle elektron mikroskobu kullanılarak kolayca analiz edilebilen, aktif olarak kopyalanan ribozomal RNA genleri incelendi. İçlerinde nükleozomlara karşılık gelen kesecikler görünmez, yani büyük olasılıkla histonlar kopyalanan bölgelerden tamamen çıkarılır. İlginç bir şekilde, kopyalanmayan bölgelerde aralayıcılar, DNA kabarcıkları (nükleozomlar) açıkça görülebilmektedir.

Ancak ribozomal RNA genleri gibi RNA polimeraz I yerine RNA polimeraz II tarafından kopyalanan SV40 minikromozomları üzerinde farklı sonuçlar elde edildi (Şekil 28). Transkripsiyonel olarak aktif mini kromozomlar, üzerlerinde büyüyen RNA zincirlerinin (genellikle bir veya iki) varlığı nedeniyle tanımlanır. Bu tür mini kromozomlar, hücreden izole edilen tüm mini kromozomların %1-2'sini oluşturur. Ancak bunlar, aktif olmayan minikromozomlarla aynı sayıda kesecik içerir ve boyutları her iki durumda da aynıdır. En ilginç şey, RNA zincirlerinin hem bağlayıcılardan hem de doğrudan keseciklerden uzanmasıdır; yani RNA polimeraz, görünüşe göre nükleozomları kopyalamaktadır. Bu veriler nükleozomların açılmasını ve bunların RNA polimeraz tarafından transkripsiyonunu desteklemektedir.

Yukarıdaki sonuçların tümü doğrudan değildir ve bu nedenle gelecekteki deneyler, transkripsiyon sırasında nükleozomların kaderi sorusuna nihai bir çözüm sunmalıdır.

Histon modifikasyonu ve histon varyantları: aktif kromatin ile ilişki. 60'lı yılların başında Allfrey (ABD), histonların çeşitli modifikasyonlara uğrayabileceğini gösterdi. Böylece histon HI, lizinlerin ε-amino gruplarında fosforile edilir. Histonlar H3 ve H4 aynı gruplarda asetillenmiştir. Bir takım başka modifikasyonlar da vardır (metilasyon, ADP - ribosilasyon, her yerde bulunma, vb.).

Histonların enzimatik modifikasyonlarının kromatinin yapısını ve aktivitesini etkileyebileceği hemen varsayıldı. Gerçekten de, lizin fosforile edildiğinde, histondaki bir pozitif yük negatif bir yük ile değiştirilir, çekici olduğunda pozitif yük kaybolur vb. üreli bir asetat tamponunda jel elektroforezi. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü elektroforezde histon H4, bir, iki ve üç lisin kalıntısında asetillenmemiş ve asetillenmemiş moleküllere karşılık gelen bir değil dört bant verir. Farklı dokularda fraksiyonlar arasındaki oran değişir. Histonlar H3, H2a, H2b ve H1 birkaç fraksiyona bölünmüştür (farklı asetilasyon ve fosforilasyon dereceleri).

Ne yazık ki, transkripsiyonel olarak aktif ve inaktif kromatini ayırmak için hala iyi bir yöntem yoktur ve bu nedenle değiştirilmiş histon formlarını bir veya diğer kromatin durumuna atfetmek zordur. Bu yöndeki en ilginç veriler aynı kişi tarafından elde edildi. W.Alfrey(AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ). Aktif kromatinin hidrolizi sırasında, sükroz gradyanında sıradan nükleozomlardan daha yavaş çöken ve yazarın görüşüne göre katlanmamış nükleozomlara karşılık gelen olağandışı parçacıkları izole etti. A parçacıkları olarak adlandırılan bu parçacıklar, tüm çekirdek histonları içeriyordu. Normal nükleozomlardan farklı olarak, A parçacıklarındaki histon H3'ün SH grupları, bir dizi kimyasal reaktif tarafından erişilebilirdi ve bu nedenle, A parçacıkları, kloromerküribenzoat kolonları (bir SH grubu bağlama reaktifi) üzerinde fraksiyonlama yoluyla nükleozomlardan ayrılabilir. A parçacıkları, histonların asetillenmiş formlarının artan içeriğini içerir. Yazar, kromatin aktivasyonu üzerine histon asetilasyonunun nükleozomal parçacıkların açılmasına yol açtığını ve bunun da histon H3'ün SH gruplarının varlığını arttırdığını ileri sürmektedir.

Bazı histonlar birden fazla gen türü tarafından kodlanır. Sonuç olarak, bu histonların, amino asit dizileri bakımından biraz farklılık gösteren çeşitli varyantları vardır. Bazen, intogenez sürecinde bir histon alt sınıfının diğeriyle doğal olarak değiştirilmesi söz konusudur. Ancak bunun herhangi bir düzenleyici öneme sahip olup olmadığı belirsizliğini koruyor. Sorunun, transkripsiyonel olarak aktif kromatini izole etmek için yeterli yöntemlerin geliştirilmesinden sonra da çözülebileceği açıktır.

Histon H1 tarafından özel bir pozisyon işgal edilmiştir. Bunun için yapısal organizasyonlarında keskin bir şekilde farklılık gösteren seçenekler var. Bu seçenek, örneğin kuş eritrositlerinin çekirdeğindeki histon H1'in önemli bir kısmının yerini alan histon H5'tir. Büyük olasılıkla, bu ikame, eritrosit çekirdeğindeki transkripsiyonun tamamen kapatılmasında önemli bir faktördür. Normal hücrelerde histon H1 - histon H1 0'un bir çeşidi vardır. İçeriği toplam histon H1'in küçük bir kısmını oluşturur. H10'un aktif genlerle veya tersine stabil olarak kapatılmış genlerle ilişkili olduğuna dair bir dizi çelişkili veri vardır. Soru açık kalıyor.

HMG proteinleri aktif kromatinin düzenlenmesinde rol oynayabilir 1* . Kromatin, histonlara ek olarak işlevi bilinmeyen birçok histon olmayan protein içerir. Bunların arasında elbette yapısal proteinler, replikasyon, transkripsiyon vb. işlemlerini sağlayan enzimler ve düzenleyici proteinler bulunmalıdır. E. Jones(Büyük Britanya), analizlerine ve tanımlamalarına olanak sağlamak için yeterince büyük miktarlarda bulunan protein bileşenlerini izole etmeye çalıştı. Aslında "yüksek hareketli protein grubu" adını verdiği yeni bir nükleer protein sınıfını izole etmeyi başardı ( yüksek hareketlilik grubu) veya HMG proteinleri. Ad, jel elektroforezi sırasında bu proteinlerin yüksek hareketliliğine bağlıydı. HMG protein fraksiyonu bir dizi ayrı bileşene ayrılır. Bunlar arasında en temsili ve iyi karakterize edilmiş olanlar HMG-1, HMG-2, HMG-14 ve HMG-17'dir.

HMG proteinleri düşük moleküler ağırlığa sahiptir. Hem bazik hem de dikarboksilik amino asitlerle zenginleştirilmiştir. HMG proteinlerinin içeriği histon içeriğinin yaklaşık %7'sidir. Farklı hücre türlerinin çekirdekleri farklılık gösterebilir. Bu bağlamda en çok, transkripsiyon aktivasyonunda olası bir rol için kanıt elde edilen HMG-14 ve HMG-17 proteinleri ile ilgileniyoruz. H. Weintraub(ABD), HMG proteinlerini ekstrakte eden 0,35 M NaCl ile nükleer ekstraksiyonun, aktif kromatinin bazı özelliklerini değiştirdiğini ve kromatine HMG-14 ve HMG-17 eklendiğinde restore edildiğini gösterdi. G.Dixon(Kanada), bu proteinleri, verilerine göre, traksiyonel olarak aktif genlerin DNA'sında zenginleştirilmiş olan nükleaz ile hidrolizin erken aşamalarında kromatinden salınan nükleozomların bileşiminde keşfetti.

[ 32 P] ile biter ve daha sonra L hücrelerinden hnRNA ile hibritlenir. Melezler jel filtrasyonu ile tespit edildi. 1 - CH-2 DNA'sı; 2 - CH-3 DNA'sı; 3 - hücrenin toplam DNA'sı (V.V. Bakaev ve diğerleri tarafından elde edilen sonuçlara göre)">
Pirinç. 29. HMG proteinlerinin (14 ve 17) aktif kromatin ile olası bağlantısı. a - mikrokokal nükleaz kullanılarak kromatin hidrolizatlarındaki subnükleozomların tespiti. Hidrolizin farklı aşamalarında, belirli subnükleozom fraksiyonları ortaya çıkar. Elektroforez, denatüre olmayan koşullar altında poliakrilamid jel içerisinde gerçekleştirildi. Etidyum bromür ile boyama, sağ sütunda florografi; b - CH2 ve CH3 altnükleozomlarının protein bileşimini belirlemek için iki boyutlu elektroforezin kullanılması. [14C] proteini ile etiketlenen kromatin, mikrokokal nükleaz ile hidrolize edildi ve iki boyutlu elektroforez (1. yön - ayrışmayan ortam, 2. yön - sodyum dodesil sülfat çözeltisi) ile ayrıldı, ardından proteinleri tanımlamak için otoradyografi yapıldı. Harfler, deney sırasında henüz bilinenlerle tanımlanmayan HMG proteinlerini göstermektedir. Artık A'nın HMG-1, B'nin HMG-2, E'nin HMG-14, G'nin HMG-17 olduğunu biliyoruz, HMG proteinleri F ve H açıkça tanımlanmamıştır, muhtemelen H de HMG-17'ye karşılık gelir. HMG proteinlerinin mononükleozomların (MH-2 ve MH-3) ve alt nükleozomlar CH-2 (HMG-17) ve CH-3'ün (HMG-14) bir parçası olduğu görülebilir; c - CH-2 ve CH-3 kopyalanan dizilerin DNA zenginleşmesinin gösterilmesi. L hücrelerinin CH-2 ve CH-3 bantlarından izole edilen DNA, 5" uçlarından [32 P] etiketlendi ve daha sonra L hücrelerinden gelen hnRNA ile hibritlendi. Hibritler, jel filtrasyonuyla tespit edildi. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - hücrenin toplam DNA'sı (V.V. Bakaev ve diğerleri tarafından elde edilen sonuçlara göre)

V. V. Bakaev Laboratuvarımızda farklı bir deneysel yaklaşım kullanarak HMG proteinlerinin transkripsiyondaki rolü hakkında sonuca vardık. Kromatin hidrolizatlarının elektroforetik analizi sırasında, nükleozomlara ve oligonükleozomlara ek olarak daha büyük hareketliliğe sahip küçük bileşenleri ortaya çıkardı. Bunlara subnükleozom adı verildi ve açıkçası nükleozomun daha fazla parçalanmasının ürünleriydi (Şekil 29, Tablo 5). Subnükleozom CH-7, H2a ve H2b'nin her birinden bir molekül kaybetmiş ve 40 bp kısaltılmış DNA içeren bir nükleozoma karşılık geliyordu; CH-6, 30-40 bp uzunluğunda bir DNA kompleksine karşılık geliyordu. MH-1'e dönüşümü sırasında MH-2'den ayrılan histon H1 ile. CH-4, bir DNA segmenti ve bir çift histon H2a ve H2b (MH-1→CH-7→CH-4 reaksiyonunun ürünü) içeriyordu. İki altnükleozom, CH-3 ve CH-2, kısa DNA ve HMG proteinlerinden (HMG-14 ve HMG-17) oluşuyordu. Bunların, karşılık gelen nükleozomların sindirimi üzerine çözeltiye geçen HMG-14 ve HMG-17 proteinleriyle ilişkili bağlayıcı bölgeler olduğu varsayılabilir. CH-2 ve CH-3 toplandı, bunlardan DNA izole edildi, uç etiketlendi ve nükleer RNA ile hibridizasyonu incelendi. CH-2 ve CH-3'ten gelen DNA'nın nükleer RNA ile aynı boyuta parçalanmış toplam hücre DNA'sından çok daha verimli bir şekilde melezleştiği ortaya çıktı.

Bu nedenle HMG-14 ve HMG-17 proteinleriyle bağlantılı DNA'nın muhtemelen transkripsiyonel olarak aktif kromatinden kaynaklandığı sonucuna varıldı.

Bağımsız olarak elde edilen tüm bu veriler, HMG-14 ve HMG-17'nin bir şekilde gen aktivasyonuyla ilişkili olduğunu ortaya koydu. Ancak aktivasyon mekanizması tamamen belirsizdi. HMG-14 ve HMG-17, spesifiklikten yoksun oldukları için geni etkinleştiren birincil faktörler olamaz. Aktif kromatinin "açık konformasyonunu" sürdürmede rol oynadıkları düşünülebilir.

Sonraki yıllarda HMG-14 ve HMG-17'nin kromatin aktivasyonundaki rolüne ilişkin şüpheler ortaya çıktı. Özellikle son zamanlarda AD Mirzabekov ve ark. protein dokularıyla hibridizasyon yöntemini kullanarak HMG-14 ve HMG-17'nin aktif kromatinin tükenmesine ilişkin veriler elde ettik. Bununla birlikte, yukarıdaki verilerin tümü dolaylı olduğundan, genel olarak HMG proteinlerinin rolü sorusu açık kalmaktadır ve daha fazla çalışma gerektirmektedir.

Topoizomeraz I ve DNA'ya sıkı bir şekilde bağlanan proteinler, transkripsiyonel olarak aktif kromatinin bir parçasıdır 1* . S. Elgin (ABD) ve ardından diğer bazı yazarlar, transkripsiyonel olarak aktif kromatinin, aşırı sarmal DNA'yı gevşeten bir enzim olan topoizomeraz I içerdiğini gösterdi. Bu ilk olarak topoizomeraz I'e karşı floresan antikorlar kullanılarak Drosophila politen kromozomlarının sitolojik preparasyonlarında gösterilmiştir. Bu enzim, DNA'da tek iplikli bir kırılma meydana getirir ve DNA'nın ortaya çıkan 5" ucuna kovalent olarak bağlanır. Bu, DNA'nın serbestçe dönmesine izin verir. kırılma bölgesi.Daha sonra parça ayrılır ve DNA'daki fosfodiester bağı yeniden oluşturulur.Moleküler ağırlık açısından, topoizomeraz I veya kısaca topo I heterojendir.En ağır bileşenin moleküler ağırlığı vardır. 135kDa ve en zengin şekilde temsil edilen - 80kDa. Proteinazlar tarafından parçalandığında, enzimatik aktiviteyi koruyan daha kısa polipeptitler oluşur.

Antibiyotik kaptotesin bir topo I inhibitörüdür ve hücreler onunla tedavi edildiğinde enzim, antibiyotikle temas anında bulunduğu yerde DNA ile kovalent çapraz bağlantılar oluşturur. Bu tür çapraz bağlantıların konumu, bir hibridizasyon etiketi kullanılarak haritalama yapılarak kolaylıkla belirlenebilir. Bu şekilde topo I'in yalnızca genomun kopyalanan bölgelerinde mevcut olduğu, yani büyük olasılıkla RNA polimeraz II ile işbirliği içinde çalışarak transkripsiyon sırasında meydana gelen lokal DNA bükülmelerini ortadan kaldırdığı keşfedildi.

Genomun kopyalanan bölgelerinde tespit edilen diğer bir protein bileşeni, hücrenin kopyalanan DNA'sına karşılık gelen DNA'ya (DBP) sıkı bir şekilde bağlanan bir dizi proteindir (bkz. Bölüm 3.4).

S. V. Razin ve V. V. Chernokhvostov PBP ile DNA komplekslerinin ayrıntılı olarak karakterize edilmesi için bir girişimde bulunuldu. PBP ile ilişkili 1-2 kb uzunluğundaki DNA fragmanları saflaştırıldı ve bir CsCl yoğunluk gradyanında denge ultrasantrifüjlenmesine tabi tutuldu. Kaldırma yoğunluklarının eşit olduğu ortaya çıktı 1,7 g/cm3 yani protein içermeyen serbest DNA'nın kaldırma kuvvetine karşılık geliyordu. Bu paradoksu açıklamak için tasarlanan deneylerde, DRNaz ile tedavinin komplekslerin kaldırma kuvveti yoğunluğunda bir azalmaya yol açtığı bulunmuştur. 1,62-1,65 gr/cm3. Protein yoğunluğuna dayalı yaklaşık hesaplamalar ( ~ 1,3 g/cm3) ve RNA ( ~ 1,9 g/cm3), (her DNA molekülü için yaklaşık olduğunu gösterin 150kDa protein ve yaklaşık 200 nükleotid RNA. Bu RNA'nın doğası belirsizdir, ancak homojenliği ve benzersiz nükleotid dizisi hakkında kanıtlar elde edilmiştir.

Bu nedenle, DNA-PBP kompleksleri hakkında pek çok şey gizemli kalıyor, ancak büyük ihtimalle transkripsiyon mekanizmasının organizasyonunda önemli bir rol oynuyorlar. Araştırmaları şu anda devam ediyor.

Kopyalanan genlerde DNA demetilasyonu 2*. Aktif kromatinin bir diğer önemli özelliği de DNA'nın belirli bölümlerinin demetilasyonudur. Aktif olmayan genlerde, CG dizilerindeki sitidil kalıntılarının çoğu metillenmiştir. Birinci BV Vanyushin laboratuvarda A. N. Belozersky Aynı hayvanın farklı dokularındaki DNA'nın C metilasyon düzeyinde farklılık gösterdiği ortaya konuldu ve buna dayanarak metilasyonun farklılaşmada düzenleyici bir role sahip olabileceği öne sürüldü. Daha sonra birçok yazar, kopyalanan DNA'daki bazı bölgelerin yetersiz metillendiğini gösterdi. En yaygın kullanılan analiz yöntemi, CCGG veya CCGG gibi aynı diziyi tanıyan ancak metilasyon hassasiyetleri farklı olan restriksiyon enzimleri ile elde edilen restriksiyon haritalarının karşılaştırılmasıdır. Kısıtlama enzimlerinden biri hem metillenmiş hem de metillenmemiş dizileri böler, diğeri ise yalnızca metillenmemiş olanları böler. Tipik olarak metillenmemiş diziler, genin düzenleyici bölgesinde lokalizedir. Genin kendi bölgesi, kodlayıcı kısmı ve intronları hem çalışan hem de sessiz genlerde eşit derecede metillenmiştir.

Metillenmiş DNA hücrelere verildiğinde hücredeki ekspresyonu, metillenmemiş DNA'ya kıyasla önemli ölçüde azalır. DNA replikasyonu sırasında DNA metilasyon durumunun yeniden üretildiğine göre veriler elde edildi: zincirlerden biri metillenirse, yeni oluşan zincir de aynı yerde metillenir.

Bir zamanlar, düzenleyici bölgenin CG dizilerindeki sitidinin metilasyonu-demetilasyonunun, gen inaktivasyonu-aktivasyonunun ana mekanizması olduğu görülüyordu. Ancak son zamanlarda bu hipotezi çürüten bir takım veriler ortaya çıktı. Böylece tamamen CG ile metillenmiş SV40 DNA aktif olarak eksprese edilir. Aynı zamanda Drosophila DNA'sında metilsitozin hiç tespit edilememektedir. C'nin demetilasyonunun gen aktivasyonunun bir sonucu olması ve yalnızca transkripsiyonel aktivite durumunu sürdürmesi mümkündür. Burada, gen aktivasyonunun araştırılmasının diğer alanlarında olduğu gibi, yeni deneylere ihtiyaç vardır.