Pratik proteomik. Proteomik kavramları, ilkeleri ve yönleri. İzotopik Dağılımın Laneti
GİRİİŞ
proteomik enzim araştırması
Günümüzde moleküler biyoloji ve genetik, moleküler tıp ve farmakoloji alanındaki ilerlemelerle bağlantılı olarak insan hastalıklarının etiyolojisi, patogenezi ve tedavisine ilişkin fikirlerde bir devrim yaşanmaktadır.
Pro- ve ökaryotik hücrelerde DNA, RNA, proteinler, genom replikasyonu ve işleyişi, ters transkripsiyon, modifikasyon, DNA onarımı ve rekombinasyonu, mRNA'nın transkripsiyonu ve translasyonunun yapısı ve fonksiyonunun anlaşılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Yeni biyoanalitik yöntemlere dayanan çok sayıda çalışma, gen ekspresyonu düzenlemesinin ana yollarını açıklığa kavuşturmuştur. Rekombinant DNA teknolojileri detaylı olarak incelenmiştir. Şu anda, kalıtsal ve sosyal açıdan önemli insan hastalıklarının (ateroskleroz, onkopatolojiler, diyabet, hücre içi enfeksiyonlar, nörodejeneratif hastalıklar vb.) gelişiminin fizikokimyasal temellerinin incelenmesi güçlü bir gelişme göstermiştir.
Genomik sonrası dönemde moleküler biyoloji, tıp ve farmakoloji alanındaki temel gelişmelerin pratikte uygulanması sorunu ortaya çıkıyor. Aynı zamanda, genomun işleyişi, çok sayıda proteinin senteziyle ilişkili postgenomik olaylara da yansıyor ve bunun incelenmesi artık ayrı bir bilimsel alan olan proteomik çerçevesinde özel ilgi görüyor. Proteomik araştırmaların geliştirilmesi, algoritmalar ve analiz yöntemleri oluşturulmadan, biyolojik metinlerin işleyiş mekanizmasının aydınlatılmasına ve hedeflenen farmakolojik etkilerin (biyotransformasyon) geliştirilmesine olanak sağlayan bir veri tabanının oluşturulması olmadan mümkün değildir.
Genomik ve proteomik, farmakogenomik ve biyotransformatiğin ilgili sorunları, benzersiz metodolojik çözümler ve teknolojik platformlar temelinde uygulanmaktadır.
Şu anda akademik merkezler düzeyinde, Rusya, BDT ülkeleri, Batı Avrupa, ABD ve Kanada'daki çeşitli araştırma enstitüleri düzeyinde, biyomedikal ve farmasötik araştırmalara yönelik bilimsel teknolojik platformların sonuçları geliştirilmekte ve kliniğe tanıtılmaktadır.
Uygulamanın amacı proteomik ve proteomik haritalamanın temellerini öğrenmektir.
Uygulamanın amacı, öğrenme sürecinde edinilen teorik bilgilerin pekiştirilmesi ve derinleştirilmesi; özel literatürle çalışmanın ana yöntemleri; önerilen sorulara uygun olarak belirli materyalleri toplayın; Staj sırasında elde edilen sonuçları resmileştirir.
PROTEOMİK KAVRAMLARI, İLKELERİ VE YÖNLERİ
21. yüzyılın başlangıcı proteomik çağının başlangıcıdır. Bu terim biyokimyada iyi bilinen diğer iki kavramdan gelmektedir: “PROTEinler” ve “genOMe” ve ilk kez 1995 yılında kullanılmıştır.
Elbette genom bilimi yok olmayacak, aynı hatta belki daha hızlı gelişecek, ancak post-genomik araştırmaların merkezinin insan proteomik haritasının envanteri ve aydınlatılması alanına taşınacağı açıktır. . İlk bakışta sorun tamamen çözülemez görünüyor. İnsan genom haritası esasen tüm insan hücreleri için aynıysa (bunlar aynı gen grubuna sahip 23 kromozomdur - istisna 14 cinsiyet hücresidir), o zaman insan proteomik haritası söz konusu olduğunda onun hakkında konuşmak tamamen anlamsızdır. genellik: her hücrenin, her dokunun, her biyolojik sıvının kendi proteomik haritasına sahip olması gerekir. Her hücrede yaklaşık 100.000 işlevsel gen bulunabilmesine rağmen, çok sayıda modifikasyon reaksiyonu hücredeki protein sayısını 10 ila 20 milyona çıkarabilir.
Bu bağlamda proteomik için şu anda iki tanım bulunmaktadır: yapısal proteomik olarak adlandırılabilecek dar bir tanım ve proteomiklerin hem yapısal hem de fonksiyonel kısımlarını içeren daha geniş bir tanım. Kelimenin dar anlamıyla proteomik, iki boyutlu elektroforez (2D-elektroforez), moleküler ağırlığın kütle spektrometrik (MS) analizi ve protein dizisi gibi yöntemlerin bir arada kullanımını kullanarak protein envanteriyle ilgilenen bilimdir. biyolojik materyalin elektroforez ile ayrıştırılması ve ardından sonuçların biyoinformatik yöntemler kullanılarak analiz edilmesi. Temel olarak yapısal proteomik, 2 boyutlu elektroforez, kütle spektrometrisi ve biyoinformatiğin bir kombinasyonudur. Ve eğer iki boyutlu elektroforezin çözme yetenekleri uzun zamandır biliniyorsa, O"Farrell'in 1975'teki ilk çalışmasından bu yana, o zaman MS analizinin polipeptit zincirlerinin moleküler ağırlığını ve dizisini çok hızlı bir şekilde belirleme yeteneği yalnızca açıklığa kavuştu. çok yakın zamanda O kadar hızlı geliştiler ki, artık bazı şirketler, proteinlerin moleküler kütlesini ve dizisini belirlemek için fenomolar ve atommolar konsantrasyon seviyelerinde çalışan tam otomatik sistemler oluşturdular... Bu yöntemlerin bir kombinasyonunu kullanarak, oluşturmak mümkündür bir hücrenin, dokunun veya hatta tüm bir organın genomunun fenotipik bir tezahürünü temsil eden herhangi bir biyolojik materyalin proteomik haritası. Geniş anlamda, proteomik analiz veya proteomik terimleri yalnızca proteinlerin envanterini çıkarmak için kullanılamaz. biyolojik bir nesnenin amacı, aynı zamanda proteinlerin fosforilasyon, glikosilasyon, asilasyon, frenilasyon, yapı iskelesi vb. gibi spesifik enzimler tarafından tersine çevrilebilir translasyon sonrası modifikasyonunu (PTM) kontrol etmektir. .
Şu anda proteomik kullanılarak 300'den fazla farklı translasyon sonrası modifikasyon türü karakterize edilmiştir.
MS analizinin yoğun gelişimi, son 5 - 7 yıl içinde, çoğu biyomedikal odağa sahip olan bir grup proteomik araştırma alanının (Şekil 1) ortaya çıkmasına katkıda bulunmuştur, ancak temel temeli bugün hala devam etmektedir. yapısal ve fonksiyonel proteomik.
Avrupa Birliği'nin çoğu ülkesinin, Rusya'nın ve BDT ülkelerinin politikaları, bir dereceye kadar, nüfusun uluslararası kalite standartlarına uygun yaşama yönündeki doğal arzusuyla bağlantılıdır. “Ekolojik olarak temiz alan” veya “ekolojik olarak dost ürün” gibi terimlerin yanı sıra günlük yaşamda sağlam bir şekilde yerleşmiş olan “euro-” ön ekine sahip her türlü kelimenin ne yazık ki çoğu durumda gerçek bir karşılığı yoktur. içerik. Aynı zamanda birçok ülkede istenilen yaşam kalitesi standartları, bu devletlerin gelişiminin kültürel, sosyal ve hukuki yönlerini etkileyen karmaşık süreçlerin sonucudur.
Şekil 1 - Proteomik analizin modern yönleri.
BİLİMSEL İLETİŞİM
S.V. Suchkov12, D.A. Gnatenko1, D.S. Kostyushev1, S.A. Krynsky1, M.A. Paltsev3
1 Adını taşıyan ilk Moskova Devlet Tıp Üniversitesi. ONLARA. Sechenov, Rusya Federasyonu 2. Moskova Devlet Tıp ve Diş Üniversitesi'nin adını almıştır. yapay zeka Evdokimova, Rusya Federasyonu
3 RRC “Kurchatov Enstitüsü”, Moskova, Rusya Federasyonu
Klinik öncesi tarama, test doğrulaması ve uygulanan testlerin değerlendirilmesi için temel bir araç olarak proteomik
Proteomik, canlı organizmaların proteinlerini, işlevlerini ve etkileşimlerini inceleyen bir bilimdir ve günümüzde klinik öncesi teşhis protokollerinin oluşturulmasında vazgeçilmez bir bileşendir. Genomik ve biyoinformatiğin başarılarıyla birlikte, proteomik teknolojilerinin kullanımı, hastalıkların erken teşhisinin yanı sıra patolojik süreçlerin seyrinin (özellikle devam eden farmakoterapinin arka planına karşı) dinamik bir değerlendirmesi için güçlü bir araçtır. Makale, kardiyovasküler ve onkolojik hastalık modellerine dayalı olarak proteomiklerin genel ve spesifik yönlerini tartışmaktadır.
Anahtar kelimeler: proteomik, teşhis, tahmin, translasyonel tıp.
giriiş
Hücrelerin, dokuların ve organların işleyişindeki patolojik değişikliklerin büyük çoğunluğuna, normal sağlıklı bir organizmanın fizyolojik protein profilinden bir sapmanın eşlik ettiği bilinmektedir. Modern koşullarda, bu tür değişikliklerin analizi ve tahmini, klinik öncesi tarama protokolleri oluşturulurken (yani hastalığın gizli ve latent protein "öncülerinin" belirlenmesi ve ayrıca uygulanan tedavi yöntemlerinin etkinliğinin değerlendirilmesi) ön plana çıkmaktadır. Duyarlılığın sağlanmasında veya doğrudan hastalığın oluşumunda rol oynayan protein moleküllerinin araştırılması, tanımlanması, ayrılması, niceliksel ve niteliksel olarak belirlenmesi proteomik biliminin temel görevleridir.
Proteomik, biyolojik nesnelerin protein bileşiminin yanı sıra protein moleküllerinin yapısal ve işlevsel özelliklerini inceleyen bir bilimdir. Görevi, biyolojik örneklerde (kan serumu, beyin omurilik sıvısı, idrar, biyopsiler) hastalık gelişiminin farklı aşamalarında ve ayrıca tedavinin arka planında bulunan toplam bireysel proteinleri tanımlamak ve ölçmektir. Vücudun tüm proteinlerinin toplamına, yani protein profiline “pro-teom” denir.
Modern teknolojik proteomik cephaneliği
Belirli bir biyolojik numunede bulunan proteinlerin fraksiyonlanması ve ayrılması gerçekleştirilir
S.V. Suchkov1,2, D.S. Kostushev1, S.A. Krynskiy1, D.A. Gnatenko1, M.A. Paltsev3
1 I.M. Sechenov Birinci Moskova Devlet Tıp Üniversitesi, Rusya Federasyonu 2 A.I. Evdokimov Moskova Devlet Tıp Diş Hekimliği Üniversitesi, Rusya Federasyonu 3 Kurchatov Bilim Enstitüsü, Moskova, Rusya Federasyonu
Subklinik tarama, testlerin doğrulanması ve uygulanan tedavinin değerlendirilmesi için temel bir araç olarak proteomik
Proteomik, vücuttaki proteinleri, proteinlerin etkileşimlerini ve biyolojik fonksiyonlarını inceleyen bir bilimdir. Günümüzde klinik öncesi tanı protokollerinin oluşturulmasında önemli bir ortaktır. Genomik ve biyoenformatik gibi diğer bilimlerle birlikte, hastalıkları klinik başlangıcından önce en erken aşamalarda teşhis etmek veya vücuttaki patolojik süreçlerin dinamiklerini ve ilaç tedavisine yanıtı elde etmek mümkün olacaktır. Bu makale, kalp hastalıkları ve kanser modelleri temelinde proteomiklerin genel yönlerinin yanı sıra özel yönlerini de tartışmaktadır.
Anahtar kelimeler: proteomik, teşhis, tahmin, çeviri tıbbı.
RAMS BÜLTENİ /2013/ Sayı 1
poliakrilamid jelde elektroforez ile. İzole edilmiş proteinleri tanımlamak için çok çeşitli yöntemler kullanılır; bunların arasında aşağıdakilerin vurgulanması gerekir:
Protein mikro dizilimi;
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve yüksek çözünürlük;
Bireysel antijenik belirleyicilere yönelik monoklonal antikorların kullanıldığı immünokimyasal test yöntemleri;
Kütle spektrometrisi.
Son yıllarda, protein moleküllerini tespit etme prosedürü, bu amaç için farklı tespit türlerine sahip geniş bir mikrobiyoçip paneli geliştirilerek önemli ölçüde optimize edilmiştir; örneğin SELDI (yüzeyle geliştirilmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon) ve/veya MALDI (matris destekli) lazer desorpsiyonu/iyonizasyon). Bu tür yaklaşımlar, bir örnekte 10.000'e kadar proteinin aynı anda analiz edilmesini ve çeşitli faktörlerin etkisi altında konsantrasyonlarındaki anlık değişimlerin kaydedilmesini mümkün kıldı. Sonuç olarak, eğer proteinler kendilerine özgü parametrelerden en az birinde (molekülün toplam yükü veya moleküler ağırlık) farklılık gösteriyorsa, yukarıdaki yaklaşım bunların daha sonraki tanımlama ve karakterizasyonla ayrılmasını mümkün kılar.
Proteinleri tanımlamak için en umut verici yöntemlerden biri, analitin iyonize parçacıklarının vakum alanında oluşumuna ve ardından iyon kütlesinin yüklerine oranının analizine dayanan kütle spektrometrisidir. Kütle spektrometresinin, kullanılan iyonizasyon ve parçacık tespit yöntemlerine bağlı olarak bölünmüş çeşitli modifikasyonları vardır. Uçuş süresi kütle spektrometresi, iyonun kütle-yük oranını (m/z), iyon sayısını ve iyonların kaynaktan iyon detektörüne uçuş süresini göstererek tek tek iyonları kaydeder.
Kromatografik yöntemler, proteinlerin moleküllerin fiziksel özelliklerine göre ayrılmasına olanak tanıyan daha düşük bir çözünürlüğe sahiptir: yük (iyon değişim kromatografisi), hidrofobiklik parametreleri (hidrofobik kromatografi), boyut (jel filtrasyonu), örneğin antikorlar gibi çeşitli ligandlara bağlanma yeteneği ( afinite kromatografisi). Bu durumlarda sıvı kromatografinin çeşitlerinden bahsediyoruz çünkü Gaz fazında protein molekülleri bulunmaz. Proteomik analizde, kütle spektrometrisi ve sıvı kromatografisinin (kromatografi-kütle spektrometrisi) bir kombinasyonu sıklıkla kullanılır: yani aslında kütle spektrometrisinin oluşturulması ve uygulanması, proteomiklerin geliştirilmesinde bir sıçramaya yol açmıştır.
Son olarak, proteomik yöntemler, bir dizi kriptik epitop dahil olmak üzere doğrusal ve konformasyona bağlı bireysel antijenik belirleyicilere yönelik monoklonal antikorların kullanıldığı immünokimyasal analizi içerir.
Doku kesitleriyle çalışırken önemli bir rol, spesifik antijen-antikor etkileşimlerine dayanan immünohistokimyasal araştırma yöntemleriyle oynanır. İmmünohistokimyasal yöntemler oldukça hassas ve spesifik olup hemen hemen her türlü ilgili antijenin belirlenmesine olanak tanır (yöntemin uygulama kapsamı yalnızca mevcut antikor kütüphanesi ile sınırlıdır).
Bağlı antikorların tespiti, enzim veya floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilir. Klinik pratikte enzim etiketleri immünofloresan yönteminden bu yana daha yaygındır.
daha hassas ve spesifiktir ancak pahalı ekipman gerektirir. Ayrıca floresan boyaların raf ömrü kısadır. Bazı teknikler, reaksiyonun hassasiyetini artıran antikorlar için polimer taşıyıcıların kullanımını içerir.
Böyle emek yoğun ve çok aşamalı bir araştırmanın son aşaması, veri tabanları (biyoinformatik) kullanılarak protein tanımlamadır.
Biyoenformatik, uygulamalı bilim perspektifinden bakıldığında, yalnızca bilimsel ve teşhis prosedürleri için gerekli olan çok büyük miktarda verinin depolanmasına, analiz edilmesine ve işlenmesine olanak sağlamakla kalmaz, aynı zamanda bazı protein moleküllerinin işlevsel özellikleri hakkında, bazı verilere dayanarak bilgi elde etme yeteneğine de sahiptir. genomun yapısı. Böylece, molekül gruplarının birbirleriyle etkileşimi, işlevleri ve özellikleri hakkında pratik olarak herhangi bir bilgiye sahip olmadan, bazı durumlarda incelenen nesnenin özelliklerini yüksek derecede olasılıkla güvenilir bir şekilde belirlemek mümkündür.
Translasyonel tıbbın ilkeleri ve hedefleri çerçevesinde sonuçların klinik uygulamaya uygulanmasıyla birlikte bilimsel araştırmanın temeli olarak proteomik
Araştırma çoğu zaman çok sayıda benzer örneğin analizini gerektirir. Bu arada, her çalışma malzeme ve zaman maliyetlerini gerektirir; bu maliyetler, doku örnekleri kütüphanelerinin oluşturulmasını ve ardından birçok bölümün eşzamanlı (tek cam üzerinde) incelenmesi olasılığını içeren doku matrisi yöntemiyle en aza indirilebilir. Bu tür araştırmalar için tipik işlem sırası aşağıdaki gibidir:
Örnekleme (hücreler, doku, biyolojik sıvı);
Numune hazırlama (hücre lizizi, protein ekstraksiyonu);
İki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi;
Jel üzerinde protein lekelerinin görünümü;
Elektroferogram analizi (noktaların sayısı, konumları);
Bireysel protein lekeleri içeren jel alanlarının izolasyonu;
Bireysel proteinlerin doğrudan jel içinde bölünmesi (tripsinizasyon);
Kütle spektrometrik analizi (bireysel protein fragmanlarının amino asit dizilerinin belirlenmesi);
Her bir proteinin tanımlanması ve konsantrasyonunun ölçülmesi, belgelenmesi, sonuçların işlenmesi;
Elde edilen verilerin biyoinformatik yöntemler kullanılarak yorumlanması - veritabanlarının analizi, proteinlerin diferansiyel profilinin elde edilmesi.
Bu prosedür kullanılarak yeni protein belirteçleri keşfedilmiş ve kardiyovasküler proteomik ve onkoproteomik alanında etkileyici sonuçlar elde edilmiştir.
Proteomiklerin özel yönleri
Proteomiklerin iki ana türü yapısal ve işlevseldir. İlki çalışıyor
BİLİMSEL İLETİŞİM
bireysel proteinlerin yapısı, ikincisi ise onları diğer proteinlerle etkileşim içinde ele alarak meydana gelen konformasyonel, biyokimyasal ve fonksiyonel değişiklikleri araştırır. Belirli bir hedef protein molekülüyle etkileşime giren tüm hücre proteinleri kümesine "interaktom" adı verilir.
Birincil tanısal amaçlar öncelikle yapısal proteomik tarafından yerine getirilirken, fonksiyonel proteomik daha çok bilimsel bir araştırma yoludur ve hücresel ve moleküler düzeyde spesifik ve bireysel farmakoterapötik hedeflerle çalışan temelde yeni ilaçların geliştirilmesinin temelidir.
Kan plazması proteomik
Tüm vücut dokuları arasında, kan plazması protein bileşimini en yakından yansıtır: plazma proteomu vücutta mevcut tüm proteinlerin yaklaşık 1/10'unu içerir. Plazmada bulunan proteinler arasında şunlar bulunur:
Plazmada görev yapan proteinler;
İmmünoglobulinler;
Hormonlar;
Sitokinler;
Plazmadan geçici olarak geçen proteinler;
sırasında plazmaya giren hücre içi proteinler
hücre geçirgenliğinde yıkım veya artış;
Normalde bulunmayan ve kötü huylu hücreler tarafından salgılanan proteinler;
Yabancı proteinler.
Plazma proteinlerinin en az 1/2'si çoklu protein kompleksleri formunda bulunur. Protein molekülüne eklenen özel moleküler etiketlerin yardımıyla, bu tür kompleksleri, belirli bir interaktomun özelliklerine yönelik daha ileri çalışmalar amacıyla izole etmek ve izole etmek mümkündür.
Bugüne kadar, her bir proteinin bir veya iki peptidinin kütle spektrometrik analizine dayalı olarak 10.000'den fazla plazma proteini ve iki veya daha fazla peptidin tanımlanmasına dayalı olarak 3.000'den fazla protein tanımlanmıştır. Yaklaşık 900 plazma proteini %95 güvenle tanımlanmıştır.
Kan plazmasının proteomik analizinin sunduğu olanaklar oldukça ilgi çekicidir. Bununla birlikte, standart bir test numunesi olarak plazmanın da bir takım önemli dezavantajları vardır. Bunlar, protein konsantrasyonlarında çok büyük (10 kata kadar) dağılım ve aralarında çok az tanısal önemi olan baskınlığı içerir. Örneğin kardiyovasküler hastalıklarda plazma proteomundaki değişiklikleri incelerken, öncelikle bu önemsiz proteinleri ayırmanın bir yolunu bulmak gerekir ki bu da önemli bir zorluk teşkil eder. Bu nedenle optimal duyarlılık ve özgüllük, hedef organın biyopsisinden elde edilen bir örneğin incelenmesi olacaktır ancak bu her zaman uygulanabilir değildir.
Bu alandaki yoğun araştırmalara rağmen yeni biyobelirteçlerin klinik uygulamaya girme oranının düşük kaldığını belirtmek gerekir. Bu hem nesnel hem de öznel nedenlerle açıklanmaktadır. Bunlardan biri, uygun teorik gerekçe olmadan araştırmayı organize etmeye yönelik ağırlıklı olarak ampirik bir yaklaşımın yanı sıra araştırma merkezleri arasındaki altyapı bağlantılarının yetersiz gelişimi, birleşik bir isimlendirme eksikliği ve mevcut verilerin sistemleştirilmesiyle ilgili sorunlar olarak düşünülmelidir. Hiç de küçük olmayan gerçek veriler
En azından dağınık kalıyorlar, çünkü birikimlerinin hızı bilimin onları entegre etme kapasitesini aşıyor.
Kardiyovasküler proteomik
Proteomik biliminin bu bölümü en yoğun gelişen alanlardan biridir. Seviyeleri kronik ve akut kardiyovasküler patolojilerde değişen yüzlerce miyokardiyal proteom proteini hakkında veritabanları zaten oluşturulmuştur. En büyük ilerleme dilate kardiyomiyopati çalışmasında kaydedildi. Bu hastalıkla birlikte 3 ana gruba ayrılabilecek 100'den fazla proteinin içeriği değişir:
Enerji ve metabolizmayla ilişkili proteinler;
Stresle indüklenen proteinler;
Kasılma fonksiyonlarını sağlayan proteinler
ve hücre iskeletinin oluşumu.
Bu sonuçlar dilate kardiyomiyopatinin patogenezi hakkındaki modern fikirlerle tamamen tutarlıdır.
Koroner kalp hastalığı ve kronik kalp yetmezliğinin patogenezini incelemede ilerleme o kadar önemli değildir. Bu tür patolojileri yeterli şekilde modellemek her zaman mümkün değildir: Hayvan modellerinde elde edilen bazı sonuçlar, insanlarda elde edilen sonuçlarla tutarlı değildir. Güvenilir sonuçların çoğu, koroner kalp hastalığının ve kronik kalp yetmezliğinin gelişmesinde ve önlenmesinde sözde rolüyle ilgilidir. ısı şoku proteinleri (Hsp 27). Reperfüzyon sendromunda proteomun incelenmesine özellikle dikkat edilir. Reperfüzyon hasarından sonra, kasılma proteinlerinin yapısındaki değişiklikler tespit edilir: MLC-2 (miyozin hafif zincir 2), troponin kompleksinin üç proteininin tümü. Reperfüzyon sendromunun patogenezinde yer alan sinyal mekanizmaları araştırılmaktadır, ancak protein etkileşimlerinin tam resmi henüz tam olarak belirlenmemiştir. Önce başka bir organda, sonra kalpte hipoksik bir durum yaratıldığında, iskemik hasardan önce miyokardın uzaktan önkoşullanması olgusunu incelemek için çalışmalar yapılmıştır. Bu reperfüzyon hasarını azaltır. Ancak bugüne kadar önkoşullamanın humoral aracılarının rolü için aday molekülleri tanımlamak mümkün olmamıştır.
Endotel doku fenotipinin önemli fonksiyonel heterojenliği nedeniyle aterosklerozun proteomiğini incelemek zordur. Bununla birlikte, Hsp27, kristalinler, tümör nekroz faktörü a, katepsinler, peroksiredoksinler vb. gibi proteinlerin içeriğindeki değişikliklerin tespit edildiği, toplamda yaklaşık 80 protein olan aterosklerotik plakların protein profili modelleri elde edilmiştir. Aterosklerozun biyobelirteçlerini oluşturmak için inflamasyonla ilişkili plazma proteinlerinin profillerinin incelenmesi önerilmektedir. Aterosklerotik plakların in vitro protein salgılaması da araştırılmaktadır.
Kronik kalp yetmezliğinde klinik olarak yararlı tek biyobelirteç B-natriüretik peptiddir. Koroner kalp hastalığına gelince, biyobelirteçlerin sayısı çok daha fazladır: kardiyak troponinler, kreatin kinaz vb. Bununla birlikte, içerikleri yalnızca iskeminin sonraki aşamalarında artar, bu nedenle erken aşamalarının teşhis edilmesine olanak tanıyan yeni biyobelirteçler için bir araştırma devam etmektedir. Bir diğer ilgi alanı ise (miyokardiyal nekrozdan ziyade) iskemiye özgü biyobelirteçlerdir. Şu anda böyle bir belirteç var: iskemi ile modifiye edilmiş albümin (iskemik-
RAMS BÜLTENİ /2013/ Sayı 1
değiştirilmiş albümin, IMA). Ancak özgüllüğünün düşük olması, geleneksel biyobelirteçlerle birlikte bir kompleksin dışında kullanılmasını zorlaştırmaktadır.
Kardiyak proteomun incelenmesi önemli zorluklar doğurmaktadır. En doğru analiz yöntemi biyopsi olacaktır ancak gerçekleştirilmesi zordur. Kan plazmasının incelenmesi durumunda, devasa protein kütleleri arasında klinik öneme sahip olabilecekleri belirlemek son derece zor bir iştir. Bu bağlamda, hayvan çalışmalarında izole kalplerin kan ikame edici solüsyonlarla perfüzyonu sıklıkla kullanılır ve ardından dokular tarafından solüsyona salınan proteinlerin incelenmesi yapılır. Başka bir yön perikardiyal sıvının incelenmesidir. Böylece kalp ameliyatı geçiren hastaların perikard sıvısındaki H-FABP proteininin (kalp tipi yağ asidi bağlayıcı protein) düzeyi incelendi. Kan plazmasında bulunmayan bu perikardiyal sıvı proteininin seviyesinin iskemi sırasında arttığı tespit edilmiştir.
Akciğer hastalıklarının proteomikleri
Akciğer hastalıklarını proteomik açıdan incelerken örnek olarak akciğer dokusu, epiteli kaplayan sıvı, alveolositler ve kan plazması kullanılır.
Epitelyumu kaplayan sıvının proteomunu incelemek için örnek olarak bronkoalveoler sıvı kullanılır. Glutatyon transferaz ve yüzey aktif madde protein B gibi bazı akciğer dokusuna özgü proteinler, bu sıvıda plazmaya göre önemli ölçüde daha fazla miktarda bulunur. Bronkoalveolar sıvıdaki değişiklikler çeşitli hastalıklarda incelenir: sarkoidoz, kistik fibroz, mezotelyoma, idiyopatik fibrozan alveolit, vb. Bronkoalveolar sıvının incelenmesi ayrıca proteomik profillerinin daha sonra değerlendirilmesi için alveoler makrofajların izole edilmesini mümkün kılar.
Akciğer dokusu örnekleri elde etmek için invaziv teknolojilerin kullanılması gereklidir. Bu çalışmalar temel olarak akciğer kanserindeki proteom değişikliklerini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. D.P. Carbone, SUMO-2 (küçük ubikuitin benzeri protein-2), timosin-p4 ve ubikuitinin protein içeriğinin küçük hücreli dışı akciğer kanserinde prognoz ile ilişkili olduğunu buldu. İnvaziv tümörleri normal bronş epitelinden ayıran protein modellerini tanımlamak için çalışmalar yapılmıştır. Sonuçların güvenilirliğini arttırmak için numune alınırken sağlıklı doku yakalanmasını önlemek amacıyla lazer mikrodisseksiyon kullanıldı. Ancak yeni biyobelirteçlerin klinik uygulamaya girebilmesi için uzun vadeli klinik çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır.
Adenokarsinomların proteomik profillerini oluşturmak için kan plazması çalışmaları da kullanılır. Böylece radyoaktif oksijen ile işaretlendiğinde farelerde akciğer adenokarsinomunda seviyeleri artan 211 protein ve seviyeleri azalan 246 protein bulundu.
Onkoproteomik
Onkoproteomiklerin ana amaçları şunlardır:
Çeşitli tümörlerin ortaya çıkışı ve gelişimi sırasında proteomların inşası ve dinamiklerinin analizi;
Tümör oluşumuna yol açan hücre sinyal yollarının tanımlanması;
Kanser tanısına yönelik ve tümörün ve vücudun ameliyata ve farklı tedavi türlerine verdiği tepkinin izlenmesine yönelik belirteçlerin tanımlanması;
Tümör oluşumuna karşı bağışıklık tepkisinin belirlenmesi. Tümör belirteçleri makromoleküllerdir (genellikle proteinler)
bir lipit veya karbonhidrat bileşeni ile), kan plazmasındaki ve/veya diğer biyolojik sıvıdaki varlığı ve konsantrasyonları, bir dereceye kadar kötü huylu bir tümörün varlığı ve büyümesi ile ilişkilidir. Tümörlerin tanısında kullanılan çok çeşitli göstergeler arasında hem spesifik tümör belirteçleri hem de çeşitli patolojik süreçler sırasında konsantrasyonu değişebilen bazı maddeler vardır. ve tümör. Sağlıklı bir vücutta pratik olarak bulunmayan en spesifik tümör belirteçleri arasında embriyonik antijenler (sentezi embriyonik gelişimin erken aşamalarında durur ve malign dönüşüm sırasında baskılanır) bulunur: kanser embriyonik antijeni, a-fetoprotein. Tümöre özgü antijenler, tümör hücreleri tarafından normal hücrelere göre daha yoğun olarak eksprese edilen moleküllerdir (salgı ürünleri veya membran glikoproteinleri). Bunlar arasında CA 19-9, CA 15-3 (membran glikoproteinleri) ve ayrıca prostat glandülositlerinin salgı ürünü olan prostat spesifik antijen (PSA) yer alır. Ek olarak, hormonlar (insan koryonik gonadotropini) ve diğer grupların maddeleri (tiroglobulin, P2-mikroglobulin, vb.) tümör belirteçleri olarak görev yapabilir. Hastalığın seyrini tahmin etmek için proliferatif aktivitenin belirteçleri olan proteinler ve apoptozu düzenleyen proteinler incelenir (Şekil 1).
Tümör belirteçlerinin klinik uygulama alanları şunlardır:
Kanserin erken tanısı;
Tedavi etkinliğinin izlenmesi ve değerlendirilmesi;
Tahminin tanımı.
Yukarıdakilere dayanarak, bir tümör belirteci için temel gereksinimler, yeterince yüksek duyarlılık ve özgüllük, tümör hacmiyle korelasyon ve tümörün konumu hakkında bilgi sağlama yeteneğidir.
Şu anda mevcut olan tümör biyobelirteçlerinin çoğunun duyarlılığı ve özgüllüğü genellikle yetersizdir. %95 özgüllükteki duyarlılığı %50'den fazla olan belirteçler klinik olarak yararlı kabul edilir ve bunlardan yalnızca birkaçı belirli bir özgüllük düzeyinde %70'in üzerinde duyarlılık gösterebilir. Yeni tümör belirteçlerinin araştırılmasında 2 yaklaşım vardır: Birincisi, karsinojenez hakkındaki modern bilgilere dayanan, belirli hipotezlerin test edildiği hedefli araştırmaları içerir; ikincisi, normal ve tümör hücrelerinin proteomlarını karşılaştırarak veya sağlıklı ve hasta hastaların serumlarının protein profilini karşılaştırarak ampirik bir araştırmadır; Risk faktörleri olan ve olmayan.
Yukarıda bahsedilen 3 açıdan modern tümör belirteçlerini kullanma olanaklarını ele alalım.
1. Teşhis. Duyarlılık eksikliği nedeniyle çoğu tümör belirteci genel popülasyonda tarama çalışmaları için uygun değildir. Ancak bunların bir kısmı başlangıçta hastalık olasılığının yüksek olduğu risk gruplarında erken teşhis için etkin bir şekilde kullanılabilir. Yani PSA taraması
BİLİMSEL İLETİŞİM
Gen İfade Analizi
Protein
mikroçipler
Kütle spektrometrisi
Otomatik
IHC profilleri
A____________
Prognozun değerlendirilmesi Tedavi yönteminin seçilmesi Yeni antikorların elde edilmesi
İmmünohistokimyasal (IHC) teknikler
Serum
Dolaylı yöntemler
Tedavi izleme
L_________
Bir tedavi yönteminin seçilmesi Tedavinin etkinliğinin izlenmesi, yan etkilerin belirlenmesi
Veri tabanı
Doğrudan yöntemler
Teşhis
İLE___________
Risk gruplarında erken tanı Relapsların tanısı
Pirinç. Kanser tanısında proteomik teknolojileri.
50 yaş üstü erkeklerden oluşan bir grup üzerinde gerçekleştirilen; karaciğer sirozu olan hastalarda a-fetoprotein (hepatoselüler karsinomun bir belirteci) taraması; aile öyküsü olan kişilerde kalsitonin (medüller tiroid kanserinin bir belirteci) için.
2. Hastalığın seyrinin izlenmesi. Şu anda tümör belirteçleri bu amaçlar için en yaygın şekilde kullanılmaktadır. Başarılı radikal cerrahinin bir işareti, belirteç konsantrasyonunda kalıcı bir azalmadır. Daha sonraki artışı, büyümenin zamanına ve hızına bağlı olarak, artık bir tümörün varlığını, bir nüksetmenin veya izole metastazın ortaya çıktığını gösterir.
3. Hastalığın seyrini tahmin etmek ve tedavi taktiklerini belirlemek. Birçok tümör belirtecinin seviyesi primer tümörün hacmiyle ilişkilidir ve lokal ve uzak metastazla keskin bir şekilde artar. Yani örneğin kronik lenfositik lösemide serum deoksitimidin sentetaz işaretleyicisinin içeriği hastalığın seyri (stabil veya ilerleyici) ile ilişkilidir.
Hastalığın seyrini tahmin etmek için proliferatif aktivite belirteçlerinin ekspresyonu da belirlenir: Ki-67 proteini, PCNA, siklinler (örneğin siklin D1), sikline bağımlı kinaz inhibitörleri. Apoptozu düzenleyen proteinlerin seviyeleri (Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bak, vb.) prognostik öneme sahiptir. Son zamanlarda apoptoz inhibitörleri (servivin ve telomeraz) yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bu moleküllerin artan konsantrasyonları, hepsinde olmasa da birçok lokasyondaki tümörlerde gösterilmiştir. Üstelik ekspresyon seviyeleri tümör gelişiminin aşamasıyla da ilişkilidir. Bazı karsinom türleri için, p53 protein ekspresyonunun seviyesi ve bu proteinin mutant formlarının sayısı ile seyrin bir korelasyonu kanıtlanmıştır.
Çalışılan belirtecin türü ve sonucun önemi, tümörün histolojik yapısına ve konumuna bağlı olarak değişir. Nihai sonuca, diğer faktörlerle birlikte kapsamlı bir değerlendirme yapıldıktan sonra varılır. Onkolojide önemli bir görev, karsinogenez sürecine dahil olan sinyal yollarının tanımlanmasıdır. Apoptoz düzenleyici proteinlerin bu süreçteki rolü şüphesizdir: p53, bcr ailesi proteinleri vb. Fonksiyonel proteomiklerin odak noktası, bu proteinlerin interaktomlarının incelenmesi, başka bir deyişle bu proteinlerin dahil olduğu moleküler etkileşimlerin yeniden yapılandırılmasıdır.
Onkoproteomiklerin uygulamaya geçirilmesindeki temel sorun, onkologların onkotranskriptom ve onkoproteom haritalarını okuma konusunda eğitilmesinin zorluğudur.
Protein moleküllerinin çeşitleri ve interaktomların özellikleri
Pek çok protein, işlevlerini bağımsız olarak yerine getirse de, büyük çoğunluğu biyolojik aktivite gösterebilmek için vücuttaki diğer proteinlerle oldukça spesifik etkileşimlere ihtiyaç duyar. Karmaşık biyolojik sistemlerde bulunan çeşitli protein-protein etkileşimlerine örnekler:
Kesin olarak tanımlanmış hücresel bölmelerdeki protein-protein interaktomları;
Sinyal kaskadlarının tetiklenmesi için gerekli bir koşul olan hücre zarının dış yüzeyindeki reseptörlerle etkileşime giren haberci proteinler;
Ağ ve yapısal etkileşimleri oluşturan proteinler, hücreler arası düzeydeki yapısal ilişkiler;
Enzim inhibitörleri;
RAMS BÜLTENİ /2013/ Sayı 1
Enzimlerin etkisine bağlı modifikasyon (genellikle denatürasyon takip eder);
Multimerik biyokomplekslerin bileşiminde allosterik etkilere yol açan protein alt birimlerinin etkileşimleri;
Bireysel organellerin, organların veya bir bütün olarak vücudun motor fonksiyonlarının altında yatan protein-protein etkileşimleri (kas kasılması). Protein etkileşimleri genellikle ikiye ayrılır:
Kararlı ve geçici olarak ikiye ayrılır ve her iki tip de hem güçlü hem de zayıf moleküller arası bağlarla sağlanabilir.
Birkaç alt birim-kompleks ve polipeptit zincirinden oluşan proteinlerde stabil etkileşim gözlenir. Birkaç stabil bağlı polipeptit zincirinden oluşan karmaşık protein moleküllerinin tipik örnekleri hemoglobin ve polimerazlardır.
Geçici protein-protein etkileşimleri, çoğu hücre içi ve hücre dışı sinyalleşme sürecinin kontrolünde rol oynar. Geçici etkileşimler genellikle fosforilasyon, konformasyonel değişiklikler veya hücrenin ayrı bir bölgesine lokalizasyon gibi çeşitli fizyolojik etkilerin gelişimini destekleyen belirli bir dizi koşulu gerektirir. Geçici etkileşime giren proteinler, aşağıdakiler de dahil olmak üzere çok çeşitli hücresel işlemlerde yer alır: katalitik protein modifikasyonu, taşıma, rezerv, sinyalleme, düzenleyici, reseptör ve motor fonksiyonlarında.
Proteinlerin membran gözeneklerinden taşınması sırasında, doğal proteinlerin deformasyonu sırasında, translasyon döngüsünün belirli aşamalarında ve hücre döngüsü sırasında hücresel yapıların (sitoplazmik mikrofilamentler, nükleer gözenek kompleksi, nükleer gözenek kompleksi, vesaire.).
Proteinler, her bir protein üzerindeki bağlanma alanları arasındaki hidrofobik/hidrofilik bağlar, van der Waals kuvvetleri ve iyonik köprüler yoluyla birbirine bağlanabilir. Bu alanlar, protein yüzeyinin küçük bir alanıyla temsil edilebilir ve yalnızca birkaç peptidden oluşabilir. Öte yandan, yüzlerce amino asidi kapsayan uzun polipeptit bölgelerine sahip proteinler yaygındır; bağlanmalarının gücü bağlanma alanının boyutuna ve özelliklerine bağlıdır. Tüm moleküle stabilite sağlayan en yaygın protein içi bağlardan biri lösin fermuarıdır.
Lösin fermuarında, lösin amino asidi a-sarmalının yaklaşık olarak her 8. pozisyonunda bulunur, bu da bir tarafta lösin kalıntılarının oluşmasına ve bir tarafının hidrofobik olduğu bir amfipatik sarmal oluşturmasına neden olur. Böylece lösin fermuarı, iki paralel a-helisini bir fermuar gibi birbirine bağlayarak dimerik bir protein oluşturur.
İki Src homolog (SH) alanı, SH2 ve SH3, kısa peptit dizileri ile bağlanan ve sinyal proteinlerinde yaygın olarak bulunan geçici bağlanma alanlarının bir örneğidir. Sffi alanı yalnızca aktifleştirilmiş bir proteinin işareti olan fosforile edilmiş tirozin kalıntılarına sahip peptit dizilerini "tanır". Başka bir deyişle SH2 bölgesi, büyüme faktörü sinyal yolunda yer alan reseptör üzerindeki en önemli bölgedir; burada bu kalıntılar, tirozin kalıntılarının Sffi alanları tarafından ligand reseptör aracılı fosforilasyonu yoluyla tanınır. SH3 alanları tipik olarak prolin açısından zengin peptit dizilerini tanır ve tipik olarak kinazlar, fosfolipazlar ve GTPazlar gibi enzimlerde bulunur. Hedef proteinleri tanımlamak için tasarlanmıştır.
Çözüm
Temel bir bilim olan proteomik, yine de bir dizi pratik tıbbi ve uygulamalı bilimsel problemin çözümünde vazgeçilmezdir. Vücudun çeşitli biyolojik sıvılarının modern teknolojik proteomik tekniklerini kullanarak incelenmesi, teşhis uzmanına, belirli bir hastada belirli bir hastalığın risklerinin kesin bir teşhisi veya değerlendirilmesi için gerekli miktarda bilgi sağlayabilir. Veri işleme ve analiz için biyoenformasyonel tekniklerin yanı sıra genomik, transkriptomik ve proteomik analiz yöntemleri de dahil olmak üzere laboratuvar tanı prosedürlerinden oluşan bir grup kullanılarak hastaların klinik öncesi ve klinik izlenmesine yönelik algoritmaların oluşturulması, patolojik bir patolojinin başarılı bir şekilde tanımlanmasının anahtarıdır. gizli aşamadaki durum, tanının doğrulanması, hastalığın tipinin ve doğasının tanımlanması ve olası tahmin edilmesinin yanı sıra, kullanılan terapi türüne yanıt olarak hastanın vücudunun reaksiyonlarının izlenmesi.
EDEBİYAT
1. Alaoui-Jamali M.A., Xu Y.J. Kanserde biyobelirteç profili oluşturma için proteomik teknoloji: bir güncelleme. J. Zhejiang. Üniv. Bilim. B.2006; 6: 411-420.
2. Moleküler tanıya giriş. Ed. HANIM. Paltseva. M.: Tıp. 2010. 368 s.
3. Anderson N.L., Anderson N.G. İnsan plazma proteomu: tarih, karakter ve teşhis umutları. Mol. HücreProteomikleri. 2002; 11: 845-867.
4. Sturgeon C. Klinik proteomik konferansına bakış açıları: klinik proteomiklerin klinik uygulamaya dönüştürülmesi. Tecrübe. Rev. Proteomik. 2010; 4: 469-471.
5. McGregor E., Dunn M.J. Kalp hastalığının proteomikleri. Hımm. Mol. Genet. 2003; 2: 135-144.
6. Edwards A.V., White M.Y., Cordwell S.J. Klinik kardiyovasküler biyobelirteç keşfinde pro-teomiklerin rolü. Mol. Hücre Proteomikleri. 2008; 10: 1824-1837.
7. Bowler R.P., Ellison M.C., Reisdorfh N. Akciğer tıbbında proteomik. Göğüs. 2006; 2: 567-574.
A.A. ZAMYATNİN, Biyoloji Bilimleri Doktoru, Biyokimya Enstitüsü adını almıştır. A.N.Bach RAS
Hikayemiz, henüz ilkokul çağındakilerle birlikte sadece birkaç yıl önce doğan en genç temel bilimlerden birine (en genç olmasa da) ithaf edilecektir. Proteomikle ilgili diğer birçok bilimden farklı olarak, tam olarak hangi koşullar altında ortaya çıktığını söyleyebilir, adının ortaya çıktığı yılı ve onu kimin bulduğunu belirtebilirsiniz.
Koşullardan başlayalım. 20. yüzyılın ikinci yarısında. Biyokimyanın analitik yöntemleri, moleküler biyoloji ve bilgisayar teknolojisi hızla gelişti. Bu alanlarda kaydedilen dikkate değer ilerlemeler, muazzam nükleik asit baz dizilerinin şifrelerinin çözülmesine ve canlı bir organizmanın tüm genomunun kaydedilmesine yol açmıştır. Genomun tamamı ilk olarak 1980 yılında phi X-174 bakteriyofajında (yaklaşık 5 103 baz), ardından ilk bakteri Haemophilus influenzae'de (1.8 106 baz) çözüldü. Ve 20. yüzyılın sonuyla birlikte. Yaklaşık 3 milyar nükleik asit bazının dizilimini belirleyerek insan genomunun tamamının şifresini çözmeye yönelik muazzam çalışma tamamlandı. Bu işe birkaç milyar dolar harcandı (taban başına yaklaşık bir dolar). Toplamda, birkaç düzine canlı organizma türünün genomları zaten deşifre edildi. Bu dönemde iki yeni biyolojik bilim ortaya çıktı: 1987'de bilimsel basında ilk kez “genomik” kelimesi ve 1993'te “biyoinformatik” kelimesi kullanıldı.
Her biyolojik türde genomun bir kısmı, proteinlerin amino asit dizilerini kodlayan bölgelerle temsil edilir. Örneğin, insanlarda bu tür yaklaşık 100.000 alan vardır (bazı tahminlere göre bu sayı 300.000'e ulaşabilir ve kimyasal olarak değiştirilmiş yapılar dikkate alındığında - birkaç milyon). Görünüşe göre genomun ve genetik kodun tamamı bilindiğinde, proteinlerin yapısı hakkındaki tüm bilgiler çeviri yoluyla elde edilebilir. Ancak her şey o kadar basit değil. Söz konusu vücudun hücresel sisteminde mRNA ve protein grupları arasında hiçbir korelasyon olmadığı yavaş yavaş ortaya çıktı. Ayrıca ribozomlar üzerinde nükleotit dizilişine uygun olarak sentezlenen birçok protein, sentez sonrasında kimyasal modifikasyonlara uğrar ve vücutta değiştirilmiş ve değiştirilmemiş formlarda bulunabilmektedir. Ayrıca proteinlerin, bugün nükleotidlerin ve hatta amino asitlerin doğrusal dizileriyle belirlenemeyen çeşitli uzamsal yapılara sahip olması da önemlidir. Bu nedenle, çalışan tüm proteinlerin yapılarının doğrudan izolasyonu ve belirlenmesi acil bir görev olmaya devam etmektedir (yapının doğrudan belirlenmesi bugüne kadar insan proteinlerinin yaklaşık yalnızca %10'u için gerçekleştirilmiştir). Böylece, genomiğe ek olarak, çalışma amacı proteom olan (İngiliz PROTEinlerinden - proteinler ve genOMe - genomundan) "proteomik" terimi ortaya çıktı. Bilimsel basında proteomdan ilk kez 1995 yılında bahsedildi.
Oligopeptitler veya basitçe peptitler olarak adlandırılan protein öncüllerinin çok sayıda kısa fragmanının organizmaların yaşamında önemli bir rol oynadığı da eklenmelidir. Aynı biyolojik türün temsilcilerindeki protein-peptit bileşenlerinin miktarının değerlendirilmesinde bu kadar tutarsızlık olması onlardan kaynaklanmaktadır. Bu nedenle günümüzde “proteom” ve “proteomik” terimlerinin yanı sıra proteom ve proteomiklerin bir parçası olan “peptidom” ve “peptidomik” gibi terimler de kullanılmaktadır. Protein ve peptidlerin yapı ve fonksiyon çeşitliliğinden daha önce Biyoloji gazetesinin sayfalarında bahsetmiştik.
Öyleyse, mevcut genç neslin yaşamı boyunca ortaya çıkan ve birbiriyle yakından bağlantılı olan yeni bilimlerin tanımlarını formüle edelim (Şekil 1).
Pirinç. 1. Üç yeni biyolojik bilimin tam bağlantısını gösteren diyagram
Genomik, genlerin yapısını ve işlevlerini inceleyen bir bilimdir (genom, bir organizmanın tüm genlerinin toplamıdır).
Biyoinformatik, biyolojik bilgilerin matematiksel, istatistiksel ve bilgisayar yöntemlerini kullanarak incelenmesiyle ilgilenen bir bilimdir.
Proteomik, proteinlerin toplamını ve bunların canlı organizmalardaki etkileşimlerini inceleyen bir bilimdir (proteom, bir organizmadaki tüm proteinlerin toplamıdır).
Ayrıca proteomiklerin genel olarak yapısal proteomik, fonksiyonel proteomik ve uygulamalı proteomik içerdiğini de unutmayın; bunları ayrı ayrı tartışacağız.
Yapısal proteomik
Biyolojinin en çarpıcı özelliği çeşitliliktir. Biyolojik organizasyonun her seviyesinde (biyolojik türler, morfoloji, moleküllerin kimyasal yapısı, düzenleyici süreçler ağı vb.) görülebilir. Bu tamamen proteinler için geçerlidir. Yapısal çeşitliliklerinin ölçeği henüz tam olarak ortaya çıkmamıştır. Bir proteindeki amino asit kalıntısı sayısının ikiden (peptit bağına sahip minimum yapı) onbinlere kadar değişebileceğini ve insan titin proteininin 34.350 amino asit kalıntısı içerdiğini ve şu anda rekor sahibi olduğunu söylemek yeterli olacaktır. bilinen tüm protein moleküllerinin en büyüğü.
Proteom hakkında bilgi edinmek için öncelikle onu izole etmek ve diğer moleküllerden arındırmak gerekir. Proteomun tamamındaki (yani organizmanın tamamındaki) protein sayısı çok fazla olduğundan, genellikle organizmanın yalnızca bir kısmını (organ veya dokusunu) alırlar ve protein bileşenini çeşitli yöntemler kullanarak izole ederler. Protein çalışmalarının yaklaşık 200 yıllık tarihi boyunca, proteinleri izole etmek için basit tuz çökeltmesinden, bu maddelerin çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklerini dikkate alan modern karmaşık yöntemlere kadar birçok yöntem geliştirilmiştir. Bireysel bir proteinin saf bir fraksiyonu elde edildikten sonra kimyasal yapısı belirlenir.
Yapısal proteomikte, bir değil birçok proteinin yapısı aynı anda belirlenir ve bugüne kadar bunun için özel bir dizi prosedür geliştirilmiş ve buna karşılık gelen yüksek hassasiyetli cihazlardan oluşan bir cephanelik oluşturulmuştur. (Proteomik araştırmalara yönelik eksiksiz bir ekipman setinin maliyeti bir milyon dolardan fazladır.)
Pirinç. 2. Proteomik araçları
İncirde. Şekil 2, numunenin hazırlanmasından yapısının belirlenmesine kadar laboratuvar döngüsünün bir diyagramını göstermektedir. İzolasyon ve saflaştırmanın ardından (şekil zaten izole edilmiş ve saflaştırılmış bir preparasyonu göstermektedir), proteinler iki boyutlu elektroforez kullanılarak ayrılır. Bu ayırma iki yönde gerçekleşir: Birinde farklı kütlelere sahip protein molekülleri ayrılır, diğerinde ise farklı toplam elektrik yükleri ayrılır. Bu hassas işlem sonucunda özdeş moleküller özel bir taşıyıcı üzerinde gruplandırılarak makroskobik noktalar oluşturulur ve her noktada yalnızca aynı moleküller bulunur. Nokta sayısı, yani farklı protein veya peptidlerin sayısı binlerce olabilir (Şekil 3, 4) ve bunları incelemek için otomatik işleme ve analiz cihazları kullanılır. Daha sonra noktalar seçilir ve içerdikleri maddeler, her bir proteinin kimyasal (birincil) yapısının belirlendiği bir kütle spektrometresi olan karmaşık bir fiziksel cihaza dahil edilir.
Pirinç. 3. Fare karaciğer ekstraktından elde edilen proteinlerin iki boyutlu elektroferogram örneği
Pirinç. 4. İnsan beyin omurilik sıvısındaki peptitlerin iki boyutlu elektroferogram örneği
Pirinç. 5. İnsan serum albümini kodlayan genin nükleotid dizisi
Bir proteinin birincil yapısı, genomik ve biyoenformatik sonuçları kullanılarak da belirlenebilir. İncirde. Şekil 5, insan serum albümin geninin tam yapısını göstermektedir. 610 amino asit kalıntısını kodlayan 1830 azotlu baz içerir. Bu gen, diğerlerinin büyük çoğunluğu gibi, bir metiyonin kalıntısını kodlayan bir atg kodonuyla başlar ve durdurma kodonlarından biri olan bu durumda taa ile biter. Bu, 609 amino asit kalıntısından oluşan bir yapıyı kodlar (Şekil 6). Ancak bu yapı henüz serum albümininin bir molekülü değil, sadece öncüsüdür. İlk 24 amino asit kalıntısı, molekülün çekirdekten sitoplazmaya geçişi sırasında parçalanan ve ancak bundan sonra bu proteinin izole edilmesiyle elde edilen serum albümininin yapısı oluşan sinyal peptidi olarak adlandırılır. . Sonuç olarak bu molekül 385 amino asit kalıntısı içerir.
Pirinç. 6. Genetik kod kullanılarak nükleotid dizisinden çevrilen insan serum albümin öncüsünün amino asit dizisi
Pirinç. 7. İnsan serum albümini molekülünün uzaysal (üçüncül) yapısı
Ancak amino asit dizilimi proteinin uzaysal yapısını ortaya çıkarmaz. Termodinamik açısından bakıldığında, uzatılmış bir doğrusal yapı enerji açısından elverişsizdir ve bu nedenle diziye özgü bir şekilde benzersiz bir uzaysal yapıya katlanır ve bu iki güçlü fiziksel yöntem kullanılarak belirlenebilir - X-ışını kırınım analizi ve nükleer manyetik rezonans (NMR spektroskopisi). Bunlardan ilki kullanılarak, görüntüsü Şekil 2'de sunulan insan serum albümini de dahil olmak üzere birkaç bin proteinin uzaysal yapıları belirlendi. 7. Bu yapıya, birincil (amino asit dizisi) aksine, üçüncül denir ve içinde ikincil yapının elemanları olan spiralleştirilmiş bölümler açıkça görülebilir.
Bu nedenle yapısal proteomik görevi, canlı bir organizmanın tüm proteinlerinin birincil, ikincil ve üçüncül yapılarının izolasyonu, saflaştırılması ve belirlenmesine indirgenir ve ana araçları iki boyutlu elektroforez, kütle spektrometresi ve biyoinformatiktir.
Proteinlerin biyoinformatiği
Çok sayıda farklı proteinin varlığı, bilgi dizileri - onlar hakkında bilinen tüm bilgilerin girileceği veri veri tabanları (veya bankaları) - oluşturma ihtiyacını doğurmuştur. Şu anda internette herkesin erişebileceği birçok genel ve özel veri tabanı bulunmaktadır. Genel veritabanları, canlı organizmaların bilinen tüm proteinleri hakkında bilgi içerir; tüm canlıların küresel proteomu hakkında. Böyle bir veritabanına örnek olarak, halihazırda analitik yöntemlerle belirlenen 200.000'e yakın proteinin yapısını ve nükleotit dizilerinden translasyon sonucu belirlenen yaklaşık 2 milyon daha fazla yapıyı içeren SwissProt-TrEMBL (İsviçre-Almanya) verilebilir. İncirde. Şekil 8 ve 9, verilen her amino asit kalıntısı sayısı için bilinen mevcut proteinlerin sayısını göstermektedir. Bu grafiklerdeki x eksenleri 2000 kalıntıyla sınırlıdır, ancak yukarıda bahsedildiği gibi sık olmasa da önemli ölçüde daha büyük moleküller meydana gelir. Şekillerde sunulan verilere göre, en fazla sayıda proteinin birkaç yüz amino asit kalıntısı içerdiği anlaşılmaktadır. Bunlara enzimler ve diğer oldukça hareketli moleküller dahildir. Daha büyük proteinler arasında, biyolojik yapıları bir arada tutan ve onlara güç veren, destekleyici veya koruyucu işlevleri yerine getiren birçok protein vardır.
Pirinç. 8. Bilinen (izole edilmiş) proteinlerin amino asit kalıntılarının sayısına göre dağılımı
Pirinç. 9. Çevrilmiş amino asit dizilerinin amino asit kalıntılarının sayısına göre dağılımı
Pirinç. 10. Bilinen doğal oligopeptitlerin amino asit kalıntılarının sayısına göre dağılımı
Global proteomda, 50'den fazla amino asit kalıntısı içermeyen ve spesifik bir fonksiyonel aktivite spektrumuna sahip olan küçük, çok hareketli moleküller tarafından özel bir yer işgal edilir. Bunlara oligopeptitler veya basitçe peptitler denir. Onlar için, yani. küresel peptidom için EROP-Moskova adı verilen özel bir veri bankası oluşturuldu. Bu isim, Endojen Düzenleyici OligoPeptitler teriminin kısaltmasıdır ve bankanın ülkemizin başkentinde kurulduğunu ve merkezinin bulunduğunu belirtir. Bugüne kadar tüm yaşayan krallıkların temsilcilerinden izole edilen yaklaşık 6000 oligopeptidin yapısı deşifre edildi. Tıpkı büyük proteinler gibi, belirli sayıda amino asit kalıntısına sahip oligopeptitlerin sayısı da grafiksel olarak gösterilebilir (Şekil 10). Grafiğe bakılırsa en yaygın oligopeptitler yaklaşık 8-10 amino asit kalıntısı içerenlerdir. Bunlar arasında esas olarak sinir sisteminin düzenlenmesinde rol oynayan moleküller bulunur ve bu nedenle nöropeptitler olarak adlandırılırlar. Açıkçası, canlı bir organizmadaki en hızlı süreçler sinir sisteminin katılımıyla gerçekleştirilir, bu nedenle peptid düzenleyicilerin hareketli ve dolayısıyla küçük olması gerekir. Ancak şunu da belirtmek gerekir ki, hem proteinlerin hem de peptidlerin muazzam yapısal ve işlevsel çeşitliliği nedeniyle bunlar için henüz kesin bir sınıflandırma oluşturulmamıştır.
Dolayısıyla bu durumda biyoenformatiğin görevleri, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özellikleri hakkında bilgi birikimi, bu bilginin analizi, kataloglanması ve bir bilgi tabanının hazırlanması ve bunların işleyiş mekanizmalarını tanımlamak için hesaplama araçlarıdır.
Fonksiyonel proteomik
Vücutta belirli bir proteinin varlığı, onun belirli bir işleve sahip olduğunu (veya sahip olduğunu) varsaymak için sebep verir ve proteomun tamamı, tüm organizmanın tam işleyişini sağlamaya hizmet eder. Fonksiyonel proteomik, proteomun fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesiyle ilgilenir ve çözdüğü problemler, örneğin protein-peptit yapılarının belirlenmesinden çok daha karmaşıktır.
Proteomun işleyişinin, diğer kimyasal sınıflardan birçok molekülün (şekerler, lipitler, prostaglandinler, çeşitli iyonlar ve su molekülleri dahil diğerleri) mevcut olduğu çok bileşenli bir ortamda gerçekleştirildiği açıktır. Bir süre sonra “şeker”, “lipit” ve benzeri terimlerin ortaya çıkması mümkündür. Protein molekülleri kendilerini çevreleyen diğer veya benzer yapılarla etkileşime girer ve sonuçta önce moleküler düzeyde, daha sonra makroskobik düzeyde fonksiyonel reaksiyonların ortaya çıkmasına neden olur. Proteinleri içerenler de dahil olmak üzere bu tür süreçlerin çoğu zaten bilinmektedir. Bunlar arasında bir enzimin bir substratla, bir antijenin bir antikorla, peptidlerin reseptörlerle, toksinlerin iyon kanallarıyla etkileşimi vb. yer alır. (reseptörler ve iyon kanalları da protein yapılarıdır). Bu süreçlerin mekanizmalarını belirlemek için hem etkileşimdeki bireysel katılımcıların deneysel çalışmaları hem de biyoenformatik kullanan sistemik çalışmalar yürütülmektedir. Bu tür sistemik yaklaşımların birkaç örneğine bakalım.
İncirde. Şekil 11, insan proteomunun (bu durumda peptidom) temsilcilerini göstermektedir - gastrointestinal sistemde lokalize olan çeşitli gastrinler ve kolesistokininler (amino asit dizilerini yazarken, kodu çözülmüş olan standart bir tek harfli kod kullanılmıştır) tarafımızdan daha önce verilmiştir). Bu peptid moleküllerinin fonksiyonel kısımları sağ taraftaki bölgelere çok benzer. Bununla birlikte, peptitler tamamen zıt davranışsal özelliklere sahiptir: Gastrinler kişinin aç hissetmesini sağlarken, kolesistokininler kişinin tok hissetmesini sağlar. Görünüşe göre bu fark, kolesistokininlerin birincil dizisinde tirozin Y kalıntısının konumunun, gastrinlere kıyasla bir adım kaymasından kaynaklanmaktadır. Aynı şekil, tek hücreli kordat Ciona bağırsakis'in temsilcisinden elde edilen siyonin peptidinin birincil yapısını göstermektedir (Şekil 12). Yapısı hem gastrinlere hem de kolesistokininlere homologdur ve bu peptitlerin her ikisi ile aynı pozisyonlarda bulunan iki tirozin kalıntısı ile karakterize edilir. Ne yazık ki fonksiyonel özellikleri araştırılmamıştır. Ve uygun deneysel araştırmalarla, genel olarak kimyasal yapının ve özel olarak tirozin kalıntılarının zıt fizyolojik etkilerin ortaya çıkmasındaki rolünün ne olduğu sorusuna cevap vermek mümkün olacaktır.
Pirinç. 11. Tunikat peptidlerden birinin yapısına kıyasla insan peptidomunun temsilcilerinin birincil yapıları
Pirinç. 12. Kuzey Denizi'nde yaşayan Tunicate Ciona bağırsakis
Başka bir örnek: Şekil 2'de. Şekil 13, yine yapısal olarak homolog bir aile halinde birleştirilen çok benzer moleküllerin amino asit dizilerini göstermektedir. Bu moleküller böceklerden memelilere kadar evrimsel açıdan çok uzak canlı organizmalarda bulunur. İlk satır, 9 amino asit kalıntısı içeren ve insanlar dahil birçok yüksek organizmada bulunan bradikinin'in birincil yapısını verir. Yıllar geçtikçe kimyagerler, hangi kısmının reseptörle etkileşimden sorumlu olduğu sorusunu yanıtlamak için bu molekülün çeşitli doğal olmayan analoglarını sentezlediler. Yaklaşık 30 yıl önce, bradikinin'in tüm olası fragmanları bile sentezlendi - 8 dipeptit, 7 tripeptit, vb. (toplamda 36 parça mümkündür), bunun aktivitesinin büyüklüğü daha sonra aynı biyolojik testte test edilmiştir. Sonucun önemsiz olduğu ortaya çıktı: yalnızca molekülün tamamının maksimum aktivite sergilediği ve her bir parçanın ayrı ayrı eser miktarda veya sıfır aktiviteye sahip olduğu ortaya çıktı. Şekil 1'de gösterilen diğer bradikininler o dönemde biliniyor olsaydı, bu zahmetli çalışmanın yapılmasına gerek kalmazdı. 13 ve biyoenformatik kullanılarak küresel proteomdan izole edilecekler. Sunulan yapısal olarak homolog aile, tüm moleküllerin biyolojik evrimin bir sonucu olarak neredeyse hiç değişmeden kalan bir bölgeye (yarı koruyucu bölge) sahip olduğunu açıkça göstermektedir ve sonuç olarak en mükemmel olarak seçilen yüksek canlı organizmaların bradikinin molekülünü temsil etmektedir. evrimsel sürecin. Bu örnek, biyoinformatik ile birlikte proteomiklerin temel bilimsel sorunları hızla (ve ucuza) çözebileceğini göstermektedir.
Pirinç. 13. Çeşitli canlı organizmalardan elde edilen doğal bradikinin peptidlerinin birincil yapıları. Yarı korunan bölgeler kalın harflerle gösterilmiştir.
Pirinç. 14. Yapısal olarak homolog endotelin/toksin ailesinin birincil yapıları
Ve son olarak üçüncü örnek, memeli endotelinleri ve yılan toksinlerinin yapısal olarak homolog ailesidir (Şekil 14). Yapıları çarpıcı benzerliğe rağmen işlevsel özellikleri birbirinden çarpıcı biçimde farklıdır: Bazıları damar kasılmasının çok yararlı düzenleyicileriyken, diğerleri ölümcüldür. Bu durumda birincil yapının, işlevlerdeki farklılığın nedenini açıklayabilecek yeterli bilgiyi içermediği, mekansal (üçüncül) yapının daha detaylı ele alınmasının gerekli olduğu bir durumla karşı karşıyayız. İncirde. Şekil 15 ve 16, bu ailenin iki üyesinin, endotelin-1 ve sarafotoksin 6b'nin, NMR spektroskopisi kullanılarak elde edilen uzaysal yapılarını göstermektedir. Şekillerde maksimum uzaysal homolojiyi elde edecek şekilde döndürülmüştür. Ancak herhangi bir rotasyonla tam bir homoloji elde edilemez. Sonuç olarak, birincil yapılar arasındaki büyük benzerliğe rağmen, bunların farklı reseptör yapılarıyla etkileşimi meydana gelir ve dolayısıyla farklı fizyolojik etkilere yol açar.
Pirinç. 15. İnsan vazokonstriktör endotelin-1 peptidinin uzaysal yapısı
Pirinç. 16. İsrail yılanı Atractaspis engadsis'in sarafotoksin 6b'sinin uzaysal yapısı
Elbette fonksiyonel proteomiklerin çeşitliliğini bu kadar spesifik örneklerle tam olarak karakterize etmek mümkün değildir. Vücuttaki protein ve diğer moleküllerin devasa etkileşim ağı hakkında fikir yaratmak, çok büyük bir çalışma ve modern biyoinformatiğin tüm araçlarının kullanılmasını gerektirir. Aslında bu tür temsillerin yaratılması daha yeni başlıyor. Ancak bu alandaki bilgimizin her yıl hızla artacağına inanmak için nedenlerimiz var.
Pirinç. 17. Karboksilik asit metabolizması haritasının genel hatları
Bu yoldaki ilk başarılardan biri Biyokimya Enstitüsü'nde karboksilik asitlerin metabolizmasının bir haritasının oluşturulmasıdır. BİR. Rusya Bilimler Akademisi Bach'ı (Şekil 17). Bu harita düzenli periyodik yapıya sahip bir reaksiyon ağını temsil eder. Bu yaklaşımın, işlevsel olarak benzer metabolitlerin benzer biyokimyasal dönüşümlere uğraması ve işlevsel olarak benzer türevler oluşturması nedeniyle başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Haritadaki dikey sıralar, aynı sayıda karbon atomuna (1'den 10'a kadar) sahip bileşikler içeren alanlardır ve yatay sıralar, işlevsel olarak benzer metabolitlerin sıralarını temsil eder. Haritadaki kimyasal yapılar, ilgili kimyasal dönüşümlere hangi enzimlerin (proteinlerin) dahil olduğunu gösteren çok sayıda okla birbirine bağlanmıştır. Bu yaklaşımın D.I.'nin periyodik kimyasal element tablosunu anımsattığı doğru değil mi? Mendeleyev mi? Ve tıpkı Mendeleev sistemi gibi bu haritanın da tahmin gücü var. Onun yardımıyla, daha sonra deneysel olarak keşfedilen bir dizi yeni enzim tahmin edildi.
Benzer şemalar diğer metabolik süreçlere (örneğin karbonhidratlar, amino asitler vb.) genişletilebilir ve ayrıca biyokimyasal reaksiyonların yeni metabolitlerini araştırmak için de kullanılabilir.
Bu nedenle fonksiyonel proteomik, proteomun yapısı ve işlevi arasındaki karmaşık ilişkileri inceler.
Pratik proteomik
Dolayısıyla proteomiklerin asıl görevi, bir organizmada çok sayıda protein ve peptidin etkileşim mekanizmasını tanımlamaktır. Bu görkemli ve pahalı çalışmanın pratik önemi nedir? Farmakologların ve doktorların öncelikle bu tür çalışmaların sonuçlarıyla ilgilendikleri açıktır, çünkü çoğu zaman protein bileşimindeki değişiklikler ile bir kişinin hastalık durumu arasında yakın bir bağlantı vardır. Dolayısıyla proteomikteki yeni veriler, tıbbın yüzyıllardır mücadele ettiği hastalıklara yönelik yeni ilaçların ve yeni tedavilerin hızla geliştirilmesine yardımcı olacak (ve halihazırda kullanılıyor). Günümüzde tüm farmakolojik ajanların %95'i proteinleri etkilemektedir. Sistem yaklaşımıyla proteomik, ortaya çıkan proteinlerin öneminin çok daha verimli bir şekilde belirlenmesine ve değerlendirilmesine yardımcı olabilir ve bu da yeni teşhis testlerinin ve tedavi yöntemlerinin gelişimini hızlandıracaktır.
Proteomik araştırmanın ilk pratik uygulaması, “proteomik” teriminin ortaya çıkmasından çok önce, 20. yüzyılın başlarında, insülinin diyabet gibi ciddi bir hastalığın gelişimindeki rolünün keşfedildiği zaman gerçekleşti. İnsülin ilaçlarının yaratılması milyonlarca insanın hayatını kurtardı.
Şu anda proteomik, genomik ve biyoenformatik ile birlikte belirli proteinlerin moleküler hedef olarak görev yapacağı yeni ilaçların (Şekil 18) yaratılmasına odaklanmıştır. Yeni ilaç hedeflerini bulma süreci biyoinformatik kullanılarak çözülmektedir ve analizin amacı gendir. Ancak genom analiz edildikten sonra bu proteinin hücrede yoğun bir şekilde eksprese edildiğine ve çalışır durumda olduğuna dair kanıt elde etmek gerekir. Proteomik bu sorunu çözer. Bu şekilde ilaca yönelik moleküler genetik hedef belirlenir.
Pirinç. 18. Yeni ilaç tasarlama probleminin çözümünde genomik, proteomik ve biyoinformatik arasındaki ilişki
Proteomiklerin kendisinin hedef bulma sorununu çözebileceği unutulmamalıdır. Normal ve patolojik dokuların proteomik haritalarını (Şekil 3 veya 4'te sunulanlara benzer) elde edersek, bunlar arasındaki farklardan hangi proteinlerin belirli bir patolojik durumun gelişimi için önemli olduğunu belirleyebilir ve bunları hedef olarak seçebiliriz. veya bu bilgiyi teşhis için kullanın. Gelecekte rutin kan testlerine proteomik kan haritalarının oluşturulmasının da ekleneceği varsayılabilir. Bunu yapmak için kliniklerin hastalardan periyodik olarak kan alınacak özel ekipman kullanması gerekecektir. Bir hastalık durumu ortaya çıkarsa, hasta bir kişinin proteomik haritasının yalnızca kendi proteomik haritasıyla karşılaştırılması, ancak sağlıklı olduğu bir zamanda derlenmesi gerekecek ve proteinde meydana gelen değişiklikleri tanımlamak mümkün olacaktır. Kanın bileşimi ve hastalığın nedenini belirleyin. Tümör ve normal hücrelerin proteomlarının, belirli faktörlere (örneğin fiziksel veya kimyasal) maruz kalmadan önce ve sonra hücrelerin, teşhis amaçlı biyolojik sıvıların kullanılmasının böyle bir karşılaştırılması - tüm bunlar büyük ilgi çekicidir ve tamamen yeni umutlar açar tıp, veterinerlik, farmakoloji, gıda endüstrisi ve diğer uygulama alanları için. Önümüzde çok büyük ve ilginç işler var.
Liste edebiyat
1. Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. ve ark. Bakteriyofaj phi X-174 DNA'nın nükleotid dizisi.//Nature. 1977. V. 265, No. 5596. S. 687–695.
2. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. ve diğerleri. Haemophilus influenzae Rd.//Science'ın tüm genomunun rastgele dizilimi ve montajı. 1995. V. 269, No. 5223. S. 496–512.
3. Doğa. 2001. 409, No. 6822 (dergi sayısının çoğu insan genomunun şifresinin çözülmesine ayrılmıştır).
4. Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. İnsan homeobox içeren lokusların genomiği.//Pathol. İmmünopatol. Res. 1988. V. 7, sayı 1–2. S.119–126.
5. Franklin J. Biyoenformatik bilginin çehresini değiştiriyor.//Ann. NY Acad. Bilim. 1993. V. 700. S. 145–152.
6. Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. ve diğerleri. Mollicutes'ların gen-ürün haritalamasında ilerleme: Mycoplasma genitalium.//Elektroforez. 1995. V. 16, No. 7. S. 1090–1094.
7. Zamyatnin A.A. Proteinlerin ve peptidlerin parlak dünyası.//Biyoloji. 2002. Sayı 25–26. S.8–13.
8. Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Proteomik için mevcut iki boyutlu elektroforez teknolojisi.//Proteomik. 2004. V. 4, No. 12. S. 3665–3685.
9. Ramstrom M., Bergquist J. Kılcal sıvı ayırma ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi kullanılarak minyatürleştirilmiş proteomik ve peptidomik.//FEBS Lett. 2004. V. 567, No. 1. S. 92–95.
10. http://au.expasy.org/sprot/
11. http://erop.inbi.ras.ru/
12.Malygin A.G. Karboksilik asitlerin metabolizması (periyodik şema). – M.: “Uluslararası Eğitim Programı”, 1999.
Proteomik, ana çalışma konusu proteom olan işlevsel bir bilimdir. Proteom, bir organizma veya sistem tarafından üretilen veya değiştirilen proteinlerin tamamıdır. Proteomik, protein türlerini inceleyen bilimdir ve bu nedenle bu bileşiğin birçok yeni türünün keşfedilmesine yardımcı olmuştur; bir bilim olarak ortaya çıkmasından önce bilinenlerden çok daha fazlası. Protein miktarının zamana ve hücrelerin veya organizmaların maruz kaldığı çeşitli taleplere veya streslere bağlı olduğu görülmektedir. Proteomik, büyük ölçüde en son genom araştırma projeleri tarafından yönlendirilen disiplinlerarası bir alandır. Protein kompozisyonu, yapısı ve aktivitesinin genel seviyesinden proteomların incelenmesini kapsar. Fonksiyonel proteomikler sıklıkla fonksiyonel genomiğin en önemli bileşeni olarak gösterilmektedir.
Çalışma konusu
Proteomik tanımlamak ilk bakışta göründüğü kadar basit değildir. Bu bilim tipik olarak proteinlerin ve proteomların büyük ölçekli deneysel analizini içerir, ancak sıklıkla protein saflaştırma olanaklarını araştırmak için kullanılır.
Genomik ve transkriptomiklerden sonra proteomik, biyolojik sistemlerin incelenmesinde bir sonraki adımdır. Genomikten çok daha karmaşıktır çünkü bir organizmanın genomu az çok sabittir, oysa proteom hücreden hücreye ve zaman zaman farklılık gösterir. Bireysel genler farklı hücre tiplerinde ifade edilir; bu, bir hücrede üretilen çekirdek protein setinin bile tanımlanması gerektiği anlamına gelir.
Çalışmanın tarihi
Protein yapısının incelenmesi olan proteomik, biyokimyada nispeten yakın zamanda ortaya çıkan bir yöndür. Geçmişte protein araştırmaları RNA analizi kullanılarak yapılıyordu ancak RNA yapısının protein içeriğiyle korele olmadığı ortaya çıktı. MRNA'nın her zaman proteine çevrilmediği ve belirli bir mRNA miktarı için üretilen protein miktarının, hangi genin kopyalandığına ve ayrıca hücrenin mevcut fizyolojik durumuna bağlı olduğu bilinmektedir. Proteomik, bir proteinin varlığını doğrulayan ve mevcut miktarın doğrudan tahminini sağlayan bilimdir.
Sonraki değişiklikler
Bir proteinin mRNA'dan çıkarılması ona zarar vermekle kalmaz, aynı zamanda birçok protein de bu işlemden sonra çok çeşitli kimyasal modifikasyonlara uğrar. Bu translasyon sonrası modifikasyonların çoğu protein fonksiyonu için kritik öneme sahiptir.
Fosforilasyon
Bu tür modifikasyonlardan biri, hücresel sinyalleşme sırasında birçok enzim ve yapısal proteinle ortaya çıkan fosforilasyondur. Belirli amino asitlere fosfatın eklenmesi, en yaygın olarak serin/treonin aminozların aracılık ettiği serinler ve treoninler veya daha az yaygın olarak tirozin kinazların aracılık ettiği tirozin, protein molekülünün, protein molekülünü tanıyan çeşitli diğer moleküller dizisi ile bağlanma veya etkileşim için hedeflenmesine neden olur. fosforile edilmiş alan.
Protein fosforilasyonu en çok çalışılan protein modifikasyonlarından biri olduğundan, birçok "proteomik" çalışma, belirli koşullar altında belirli bir hücre veya doku tipindeki fosforile edilmiş protein kümesini tanımlamayı amaçlamaktadır.
Her yerde bulunma
Ubiquitin, bilimsel olarak E3 ubikuitin ligazları olarak adlandırılan enzimler tarafından belirli substratlara bağlanabilen küçük bir proteindir. Hangi proteinlerin poli-ubikuitinlenmiş olduğunun belirlenmesi, bu moleküllerin hareketinin nasıl düzenlendiğinin anlaşılmasına yardımcı olur. Benzer şekilde, bir araştırmacı her bir ligaz tarafından hangi substratların her yerde bulunduğunu belirledikten sonra, belirli bir hücre tipinde ifade edilen ligazların setini belirlemek faydalıdır.
Ek değişiklikler
Fosforilasyon ve her yerde bulunmanın yanı sıra, proteinler (diğerlerinin yanı sıra) metilasyon, asetilasyon, glikosilasyon, oksidasyon ve nitrosilasyona da uğrayabilir. Bazı proteinler çoğu zaman zamana bağlı kombinasyonlar halinde bu değişikliklerin tümüne maruz kalır. Bu, protein yapısını ve fonksiyonunu çalışmanın potansiyel zorluğunu göstermektedir.
Bireysel proteinler farklı koşullar altında üretilir. Bir hücre, farklı zamanlarda veya farklı koşullar altında, örneğin gelişim, hücre farklılaşması, hücre döngüsü veya karsinogenez sırasında farklı protein setleri oluşturabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, proteom karmaşıklığının daha da artması, çoğu proteinin çok çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlara maruz kalabileceği anlamına gelir.
Bu nedenle proteomik alanındaki araştırmalar, bu bilimin çalışma konusu sınırlı kalsa bile gelecekte zorlu bir iştir. Belirli bir kanser alt tipi için biyobelirteç aramak gibi daha iddialı görevler için, proteomist bir bilim insanı, kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için birden fazla kanser hastasından alınan birden fazla serum örneğini incelemeyi seçebilir. Bu nedenle bazen proteomun dinamik karmaşıklığını açıklamak için karmaşık deneysel tasarımlar gerekli olabilir.
Genomikten farklılıklar
Proteomik, birçok nedenden ötürü genomikten farklı düzeyde anlayış sağlar:
- Bir genin transkripsiyon seviyesi, proteine translasyon seviyesinin yalnızca kaba bir tahminini sağlar. Bol miktarda üretildikten sonra mRNA hızla parçalanabilir veya verimsiz bir şekilde dönüştürülebilir, bu da küçük miktarlarda protein üretilmesine neden olabilir.
- Yukarıda bahsedildiği gibi birçok protein, işlevselliklerini büyük ölçüde etkileyen translasyon sonrası modifikasyonlara uğrar. Örneğin bazı proteinler fosforile oluncaya kadar aktif değildir. Translasyon sonrası modifikasyonları incelemek için fosfoproteomik ve glikoproteomik gibi teknikler kullanılır.
- Birçok transkript, alternatif birleştirme veya alternatif translasyon sonrası modifikasyonlar yoluyla birden fazla proteine yol açar.
- Birçok protein, diğer proteinler veya RNA molekülleri ile kompleksler oluşturur ve yalnızca bu diğer moleküllerin varlığında etki gösterir. Protein bozunma derecesi içeriğinde önemli bir rol oynar.
Yeniden üretilebilirlik
Proteomik deneylerin tekrarlanabilirliğini etkileyen ana faktörlerden biri, kütle spektrometreleri tarafından ölçülebilen diğer birçok peptidin eşzamanlı elüsyonudur. Bu, verilere bağlı triptik peptid tedavileri nedeniyle deneyler arasında stokastik farklılıklara neden olur. Maya proteomunun ilk büyük ölçekli analizleri, muhtemelen kısmen aralarındaki teknik ve deneysel farklılıklar nedeniyle, farklı laboratuvarlar arasındaki sonuçlarda önemli farklılıklar gösterse de, daha yeni kütle spektrometrik analizlerinde, özellikle kütle spektrometreleri kullanıldığında tekrarlanabilirlik geliştirildi.
Araştırma Yöntemleri
Proteomikte proteinleri incelemek için birçok yöntem vardır. Tipik olarak antikorlar (immünolojik testler) veya kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilebilirler. Eğer karmaşık bir biyolojik numune analiz ediliyorsa, kantitatif metop blot (qdb) analizinde ya çok spesifik bir antikorun kullanılması ya da biyokimyasal ayırmanın yapılması gerekir.
Antikorlar kullanılarak protein tespiti (immünolojik testler)
Biyokimya ve hücre biyolojisi araştırmalarında spesifik proteinlere veya değiştirilmiş formlara karşı antikorlar kullanılmıştır. Günümüzde moleküler biyologların en yaygın kullandığı araçlar arasındadırlar. Protein tespiti için antikorların kullanımını içeren çeşitli spesifik yöntemler ve protokoller vardır. Onlarca yıldır, biyolojik numunelerde bunları tespit etmek ve ölçmek için enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) kullanılmıştır. Western blot, başlangıçta karmaşık bir organik karışımın SDS-PAGE kullanılarak ayrıldığı ve daha sonra ilgili proteinin bir antikor kullanılarak tanımlandığı tek tek proteinleri tespit etmek ve ölçmek için kullanılabilir.
Modifiye edilmiş proteinler, bu modifikasyona özgü bir antikor geliştirilerek incelenebilir. Örneğin, fosfospesifik antikorlar olarak bilinen, yalnızca tirozin fosforile edildiklerinde belirli proteinleri tanıyan antikorlar vardır. Ayrıca diğer modifikasyonlara özgü antikorlar da vardır. Modifikasyona uğramış protein setini belirlemek için kullanılabilirler.
Tıpta proteomik
Hastalıkların moleküler düzeyde tespit edilmesi, teşhis ve tedavide yeni bir devrime yol açıyor. Dijital immünolojik test teknolojisi, moleküler tespitin atomolar aralık olarak adlandırılan aralığa olan hassasiyetini geliştirmiştir. Bu yetenek bize teşhis ve tedavide yeni ilerlemeler keşfetme potansiyeli veriyor, ancak bu tür teknolojiler, etkili günlük kullanıma pek uygun olmayan manuel prosedürlere indirgenmiştir.
Antikorlarla protein tespiti moleküler biyolojide hala çok yaygın olmasına rağmen, antikora dayanmayan başka yöntemler de geliştirilmiştir. Bu yöntemler çeşitli avantajlar sunar; örneğin, sıklıkla bir protein veya peptidin dizisini belirleyebilirler, bir antikordan daha yüksek verime sahip olabilirler ve bazen antikor bulunmayan proteinleri tanımlayıp ölçebilirler.
Proteomik yöntemler
Protein analizi için en eski yöntemlerden biri, tek bir peptidin dizisini belirlemek için birkaç kimyasal bozunma adımından geçtiği Edman bozunmasıydı (1967'de tanıtıldı). Bu yöntemlerin yerini büyük ölçüde daha yüksek verim sağlayan teknolojiler almıştır. Proteomiklerin çeşitli alanları da yöntemlere bağlıdır.
Temel ayırma yöntemleri
Karmaşık biyolojik numunelerin analiz edilmesi, bunların karmaşıklığının azaltılmasını gerektirir. Bu, tek boyutlu veya iki boyutlu ayırma kullanılarak yapılabilir. Daha yakın zamanlarda, tek tek peptitlerin ters faz kromatografisi kullanılarak ayrıldığı ve daha sonra ESI yöntemi kullanılarak doğrudan iyonize edildiği çevrimiçi yöntemler geliştirildi.
Hibrit teknolojiler
Bireysel analitlerin antikor bazlı saflaştırılmasını ve ardından bunları tanımlamak ve ölçmek için kütle spektrometrik analizini kullanan çeşitli hibrit teknolojiler vardır. Bu yöntemlere örnek olarak Randal Nelson tarafından 1995 yılında geliştirilen MSIA (kütle spektrometrik immünoassay) yöntemi ve Lee Anderson tarafından 2004 yılında tanıtılan SISCAPA (Antipeptid Antikorla Stabil İzotop Standart Yakalama) yöntemi gösterilebilir.
Karşılaştırmalı proteomik analizler, proteinlerin üreme de dahil olmak üzere karmaşık biyolojik sistemlerdeki rolünü ortaya çıkarabilir. Örneğin, böcek ilacı triazophos ile tedavi, çiftleşme yoluyla dişilere aktarılabilen erkek aksesuar demir proteinleri (Acps) olan kahverengi fidelerde (Nolaparvata lugens (Stål)) bir artışa neden olur ve bu da doğurganlığın (yani doğurganlığın) artmasına neden olur. dişiler. Erkek çekirgelerden elde edilen yardımcı bez proteinleri (Acps) ve üreme proteinlerinin türlerindeki değişiklikleri belirlemek için araştırmacılar, kış uykusuna yatan erkek N. lugens üzerinde karşılaştırmalı bir proteomik analiz gerçekleştirdi. Sonuçlar, bu proteinlerin yetişkin dişi ve erkek çekirge N. lugens'in üreme sürecine dahil olduğunu gösterdi.
Yüksek verimli proteomik teknolojiler
Proteomik, son on yılda istikrarlı bir şekilde ivme kazanan bir bilimdir. Bu bilim tarafından geliştirilen yaklaşımların çoğu kesinlikle devrim niteliğindedir, diğerleri ise eski bilimsel yöntemlere dayanmaktadır. Kütle spektrometrisi ve mikro hücre bazlı yöntemler, büyük ölçekli protein çalışmaları için en yaygın teknolojilerdir.
Kütle spektrometresi ve profil oluşturma
Şu anda protein profili oluşturmak için iki kütle spektrometri yöntemi kullanılmaktadır. Daha iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan yöntem, proteinleri farklı numunelerden paralel olarak ayırmak için yüksek çözünürlüklü iki boyutlu elektroforezi kullanır, ardından kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanacak diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin seçimi ve boyanması gelir. 2DE'deki ilerlemelere ve bu yöntemin genel karmaşıklığına rağmen, aynı zamanda sınırlamaları da vardır. Asıl sorun, değişkenlikleri ve diğer benzersiz özellikleri göz önüne alındığında, bir numunedeki tüm proteinlerin tanımlanamamasıdır.
İkinci niceliksel yaklaşım, iki farklı kompleks karışımdan gelen proteinleri diferansiyel olarak etiketlemek için kararlı izotop etiketlerini kullanır. Burada karmaşık bir karışımdaki proteinler önce izotoplarla etiketlenir ve daha sonra etiketli peptitler üretmek için sindirilir. Etiketlenen karışımlar daha sonra çok boyutlu sıvı kromatografisi ile ayrılan peptitlerle birleştirilir ve tandem kütle spektrometresi ile analiz edilir. İzotop kodlu etiketler (ICAT), yaygın olarak kullanılan izotop etiketlerdir. Bu bilimsel yöntemde, proteinlerin sistein kalıntıları ICAT reaktifine kovalent olarak bağlanarak sistein dışı kalıntıları ortadan kaldırarak karışımların karmaşıklığını azaltır.
Proteomik, genomik, metabolomik, biyolojide karmaşıklık ve yenilikle karakterize edilen yeni yönlerdir. Herkes bunları inceleyemez.