Chromatín: definícia, štruktúra a úloha pri delení buniek. Tri frakcie eukaryotickej DNA, ich lokalizácia v chromozómoch a funkcie Štrukturálne a funkčné zložky chromatínu

Chromatín, hlavná zložka bunkového jadra, sa dá pomerne ľahko získať z izolovaných interfázových jadier az izolovaných mitotických chromozómov. Na to využívajú jeho schopnosť prejsť do rozpusteného stavu počas extrakcie vodnými roztokmi s nízkou iónovou silou alebo jednoducho deionizovanou vodou. V tomto prípade časti chromatínu napučiavajú a menia sa na gél. Na premenu takýchto liečiv na skutočné roztoky sú potrebné silné mechanické vplyvy: pretrepávanie, miešanie, dodatočná homogenizácia. To samozrejme vedie k čiastočnej deštrukcii pôvodnej chromatínovej štruktúry, jej rozdrveniu na malé fragmenty, ale prakticky sa nemení jej chemické zloženie.

Chromatínové frakcie získané z rôznych predmetov majú pomerne jednotný súbor zložiek. Zistilo sa, že celkové chemické zloženie chromatínu z interfázových jadier a mitotických chromozómov sa od seba len málo líši. Hlavnými zložkami chromatínu sú DNA a proteíny, ktorých väčšinu tvoria históny a nehistónové proteíny (pozri tabuľku 3).

Tabuľka 3. Chemické zloženie chromatínu. Obsah bielkovín a RNA je daný vzhľadom na DNA

V priemere asi 40 % chromatínu tvorí DNA a asi 60 % tvoria proteíny, vrátane špecifických jadrových proteínov – históny, tvoria 40 až 80 % všetkých bielkovín, ktoré tvoria izolovaný chromatín. Okrem toho chromatínová frakcia zahŕňa membránové zložky, RNA, sacharidy, lipidy a glykoproteíny. Otázka, do akej miery sú tieto minoritné zložky zahrnuté v štruktúre chromatínu, ešte nebola vyriešená. Tak napríklad RNA môže byť transkribovaná RNA, ktorá ešte nestratila spojenie s templátom DNA. Ďalšie minoritné zložky môžu predstavovať látky z koprecipitovaných fragmentov jadrovej membrány.

Štruktúrne je chromatín filamentózny komplex molekúl deoxyribonukleoproteínu (DNP), ktoré pozostávajú z DNA spojenej s histónmi (pozri obr. 57). Preto sa zakorenil iný názov chromatínu - nukleohistónu. Práve asociáciou histónov s DNA vznikajú veľmi labilné, variabilné komplexy nukleová kyselina-histón, kde pomer DNA:histón je približne jedna, t.j. sú prítomné v rovnakých hmotnostných množstvách. Tieto filamentózne DNP fibrily sú elementárne chromozomálne alebo chromatínové filamenty, ktorých hrúbka sa môže v závislosti od stupňa balenia DNA pohybovať od 10 do 30 nm. Tieto fibrily DNP sa môžu ďalej zhutňovať, aby vytvorili vyššie úrovne štruktúrovania DNP, až po mitotický chromozóm. Úloha niektorých nehistónových proteínov je práve vo vytváraní vysokých úrovní zhutnenia chromatínu.

DNA chromatín

V chromatínovom prípravku tvorí DNA zvyčajne 30 – 40 %. Táto DNA je dvojvláknová špirálovitá molekula, podobná čistej izolovanej DNA vo vodných roztokoch. Dokazujú to mnohé experimentálne údaje. Keď sa teda roztoky chromatínu zahrejú, pozoruje sa zvýšenie optickej hustoty roztoku, takzvaný hyperchrómny efekt spojený s prerušením internukleotidových vodíkových väzieb medzi reťazcami DNA, podobne ako pri zahrievaní (tavení) čistej DNA. .

Otázka veľkosti a dĺžky molekúl DNA v chromatíne je dôležitá pre pochopenie štruktúry chromozómu ako celku. Pri použití štandardných metód izolácie DNA má chromatín molekulovú hmotnosť 7-9 x 106, čo je výrazne menej ako molekulová hmotnosť DNA z Escherichia coli (2,8 x 109). Takáto relatívne nízka molekulová hmotnosť DNA z chromatínových prípravkov sa dá vysvetliť mechanickým poškodením DNA počas procesu izolácie chromatínu. Ak sa DNA izoluje za podmienok, ktoré vylučujú pretrepávanie, homogenizáciu a iné vplyvy, je možné z buniek získať veľmi dlhé molekuly DNA. Dĺžku molekúl DNA z jadier a chromozómov eukaryotických buniek je možné študovať pomocou svetelno-optickej autorádiografickej metódy, rovnako ako to bolo študované na prokaryotických bunkách.

Zistilo sa, že v rámci chromozómov môže dĺžka jednotlivých lineárnych (na rozdiel od prokaryotických chromozómov) molekúl DNA dosahovať stovky mikrometrov až niekoľko centimetrov. Z rôznych objektov sa tak získali molekuly DNA v rozsahu od 0,5 mm do 2 cm.Tieto výsledky ukázali, že existuje úzka zhoda medzi vypočítanou dĺžkou DNA na chromozóm a autorádiografickým pozorovaním.

Po miernej lýze eukaryotických buniek možno priamo určiť molekulové hmotnosti DNA fyzikálno-chemickými metódami. Ukázalo sa, že maximálna molekulová hmotnosť molekuly DNA drozofily je 41 x 10 9, čo zodpovedá dĺžke asi 2 cm.V niektorých kvasinkách existuje molekula DNA na chromozóm s molekulovou hmotnosťou 1 x 10 8 -109, ktorý meria asi 0,5 mm.

Takáto dlhá DNA je jedna molekula, a nie niekoľko kratších, spojených do jedného súboru pomocou proteínových väzieb, ako sa niektorí výskumníci domnievali. K tomuto záveru sa dospelo po tom, čo sa ukázalo, že dĺžka molekúl DNA sa po ošetrení liekov proteolytickými enzýmami nemení.

Celkové množstvo DNA obsiahnutej v jadrových štruktúrach buniek, v genóme organizmov sa líši od druhu k druhu, hoci u mikroorganizmov je množstvo DNA na bunku podstatne nižšie ako u bezstavovcov, vyšších rastlín a živočíchov. Myš má teda takmer 600-krát viac DNA na jadro ako E. coli. Pri porovnávaní množstva DNA na bunku v eukaryotických organizmoch je ťažké rozlíšiť akúkoľvek koreláciu medzi stupňom zložitosti organizmu a množstvom DNA na jadro. Také rôzne organizmy ako ľan, ježovka, ostriež (1,4-1,9 pg) alebo sivoň a býčie ryby (6,4 a 7 pg) majú približne rovnaké množstvo DNA.

Vo veľkých taxonomických skupinách existujú výrazné výkyvy v množstve DNA. Medzi vyššími rastlinami sa množstvo DNA v rôznych druhoch môže líšiť stokrát, rovnako ako u rýb sa množstvo DNA u obojživelníkov líši desaťkrát.

Niektoré obojživelníky majú vo svojich jadrách 10-30-krát viac DNA ako v ľudských, hoci genetická konštitúcia človeka je neporovnateľne zložitejšia ako u žiab. Preto sa dá predpokladať, že „nadbytočné“ množstvo DNA v nižšie organizovaných organizmoch buď nesúvisí s plnením genetickej úlohy, alebo sa počet génov toľkokrát opakuje.

Tabuľka 4. Obsah DNA v bunkách niektorých predmetov (str, 10 -12 g)

Ukázalo sa, že tieto problémy je možné vyriešiť štúdiom kinetiky reakcie renaturácie alebo hybridizácie DNA. Ak sa fragmentované molekuly DNA v roztokoch podrobia tepelnej denaturácii a následne sa inkubujú pri teplote o niečo nižšej ako je teplota, pri ktorej dochádza k denaturácii, potom sa obnoví pôvodná dvojvláknová štruktúra fragmentov DNA vďaka opätovnému zjednoteniu komplementárnych reťazcov – renaturácii. Pre DNA vírusy a prokaryotické bunky sa ukázalo, že rýchlosť takejto renaturácie priamo závisí od veľkosti genómu; čím väčší genóm, tým väčšie množstvo DNA na časticu alebo bunku, tým viac času je potrebné na náhodné priblíženie komplementárnych reťazcov a špecifickú reasociáciu väčšieho počtu fragmentov DNA odlišných nukleotidovou sekvenciou (obr. 53). Povaha DNA reasociačnej krivky prokaryotických buniek indikuje neprítomnosť opakovaných sekvencií báz v prokaryotickom genóme; všetky časti ich DNA nesú jedinečné sekvencie, ktorých počet a rozmanitosť odrážajú stupeň zložitosti genetického zloženia objektov a následne aj ich všeobecnú biologickú organizáciu.

Úplne iný obraz reasociácie DNA je pozorovaný u eukaryotických organizmov. Ukázalo sa, že ich DNA obsahuje frakcie, ktoré sa renaturujú oveľa vyššou rýchlosťou, než by sa dalo očakávať na základe veľkosti ich genómu, ako aj časť DNA, ktorá sa renaturuje pomaly, ako jedinečné sekvencie DNA prokaryotov. Eukaryoty však vyžadujú podstatne viac času na renaturáciu tejto frakcie, čo súvisí s celkovo veľkou veľkosťou ich genómu a veľkým počtom rôznych jedinečných génov.

V tej časti eukaryotickej DNA, ktorá sa vyznačuje vysokou rýchlosťou renaturácie, sa rozlišujú dve podfrakcie: 1) frakcia s vysoko alebo často sa opakujúcimi sekvenciami, kde sa podobné úseky DNA môžu opakovať 10 6-krát; 2) zlomok stredne sa opakujúcich sekvencií, ktoré sa v genóme vyskytujú 102-103-krát. U myší teda frakcia DNA s často opakovanými sekvenciami zahŕňa 10 % z celkového množstva DNA na genóm a 15 % pripadá na frakciu so stredne opakovanými sekvenciami. Zvyšných 75 % všetkej myšacej DNA predstavujú jedinečné oblasti zodpovedajúce veľkému počtu rôznych neopakujúcich sa génov.

Frakcie s vysoko opakovanými sekvenciami môžu mať inú hustotu nadnášania ako väčšina DNA, a preto sa môžu izolovať v čistej forme ako takzvané frakcie satelitnej DNA. U myši má táto frakcia hustotu 1,691 g/ml a hlavná časť DNA je 1,700 g/ml. Tieto rozdiely v hustote sú určené rozdielmi v zložení nukleotidov. Napríklad u myši je v tejto frakcii 35 % párov G a C a 42 % v hlavnom píku DNA.

Ako sa ukázalo, satelitná DNA alebo frakcia DNA s často opakovanými sekvenciami sa nezúčastňuje syntézy hlavných typov RNA v bunke a nie je spojená s procesom syntézy proteínov. Tento záver bol urobený na základe skutočnosti, že žiadny z typov bunkovej RNA (tRNA, mRNA, rRNA) nehybridizuje so satelitnou DNA. V dôsledku toho tieto DNA neobsahujú sekvencie zodpovedné za syntézu bunkovej RNA, t.j. satelitné DNA nie sú templátmi pre syntézu RNA a nezúčastňujú sa transkripcie.

Existuje hypotéza, že vysoko sa opakujúce sekvencie, ktoré nie sú priamo zapojené do syntézy proteínov, môžu niesť informácie, ktoré zohrávajú dôležitú štrukturálnu úlohu pri udržiavaní a fungovaní chromozómov. Tieto môžu zahŕňať početné úseky DNA spojené s jadrovými proteínmi interfázového jadra (pozri nižšie), miesta na začiatku replikácie alebo transkripcie, ako aj úseky DNA, ktoré regulujú tieto procesy.

Využitím metódy hybridizácie nukleových kyselín priamo na chromozómoch ( in situ) bola študovaná lokalizácia tejto frakcie. Na tento účel bola RNA značená 3H-uridínom syntetizovaná na izolovanej satelitnej DNA pomocou bakteriálnych enzýmov. Potom bol cytologický preparát s chromozómami podrobený takej úprave, aby došlo k denaturácii DNA (zvýšená teplota, alkalické prostredie a pod.). Potom sa na prípravok umiestnila RNA značená 3H a dosiahla sa hybridizácia medzi DNA a RNA. Autorádiografia odhalila, že väčšina označenia je lokalizovaná v zóne primárnych zúžení chromozómov, v zóne ich centromerických oblastí. Značka bola detegovaná aj v iných oblastiach chromozómov, ale veľmi slabo (obr. 54).

Za posledných 10 rokov sa v štúdiu urobili veľké pokroky centromerická DNA najmä v kvasinkových bunkách. Tak to urobte S. cerevisiae Centromerická DNA pozostáva z opakujúcich sa oblastí 110 bp. Pozostáva z dvoch konzervovaných oblastí (I a III) a centrálneho prvku (II), obohateného o páry báz AT. Chromozómy Drosophila majú podobnú štruktúru centromérovej DNA. Ľudská centromerická DNA (alfoidná satelitná DNA) pozostáva z tandemu 170 bp monomérov organizovaných do skupín dimérov alebo pentamérov, ktoré zase tvoria veľké sekvencie 1-6 x 103 bp. Táto najväčšia jednotka sa opakuje 100-1000 krát. Špeciálne centromerické proteíny sú v komplexe s touto špecifickou centromerickou DNA a podieľajú sa na tvorbe kinetochore, štruktúra, ktorá zabezpečuje spojenie chromozómov s vretenovitými mikrotubulmi a pri pohybe chromozómov v anafáze (pozri nižšie).

DNA s vysoko repetitívnymi sekvenciami bola tiež nájdená v telomerické oblasti chromozómy mnohých eukaryotických organizmov (od kvasiniek až po človeka). Najčastejšie sa tu nachádzajú opakovania, ktoré zahŕňajú 3-4 guanínové nukleotidy. U ľudí teloméry obsahujú 500-3000 opakovaní TTAGGG. Tieto úseky DNA plnia špeciálnu úlohu – obmedzujú konce chromozómu a zabraňujú jeho skracovaniu počas procesu opakovanej replikácie.

Nedávno sa zistilo, že vysoko repetitívne DNA sekvencie interfázových chromozómov sa špecificky viažu na laminové proteíny pod jadrovým obalom a podieľajú sa na ukotvení rozšírených dekondenzovaných interfázových chromozómov, čím určujú poradie v lokalizácii chromozómov v objeme interfázového jadra.

Bolo navrhnuté, že satelitná DNA sa môže podieľať na rozpoznávaní homológnych oblastí chromozómov počas meiózy. Podľa iných predpokladov zohrávajú oblasti s často opakovanými sekvenciami úlohu separátorov (spacerov) medzi rôznymi funkčnými jednotkami chromozomálnej DNA, napríklad medzi replikónmi (pozri nižšie).

Ako sa ukázalo, frakcia stredne sa opakujúcich (102 až 105-krát) sekvencií patrí do pestrej triedy oblastí DNA, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v procesoch vytvárania aparátu syntézy proteínov. Táto frakcia zahŕňa gény ribozomálnej DNA, ktoré sa môžu u rôznych druhov opakovať 100 až 1000-krát. Táto frakcia obsahuje mnohokrát opakované oblasti na syntézu všetkých tRNA. Navyše, niektoré štrukturálne gény zodpovedné za syntézu určitých proteínov sa môžu tiež mnohokrát opakovať, reprezentované mnohými kópiami. Sú to až 400-krát opakované gény pre chromatínové proteíny – históny.

Okrem toho táto frakcia zahŕňa úseky DNA s rôznymi sekvenciami (každá 100-400 nukleotidových párov), ktoré sa tiež mnohokrát opakujú, ale sú rozptýlené po celom genóme. Ich úloha ešte nie je úplne jasná. Bolo navrhnuté, že takéto úseky DNA môžu predstavovať akceptorové alebo regulačné oblasti rôznych génov.

DNA eukaryotických buniek má teda heterogénne zloženie, obsahuje niekoľko tried nukleotidových sekvencií: často sa opakujúce sekvencie (> 106-krát), zahrnuté v satelitnej frakcii DNA a neprepísané; zlomok stredne sa opakujúcich sekvencií (102 - 105), ktoré predstavujú bloky skutočných génov, ako aj krátke sekvencie roztrúsené po celom genóme; frakcia jedinečných sekvencií, ktorá nesie informácie pre väčšinu bunkových proteínov.

Na základe týchto myšlienok sa rozdiely v množstve DNA, ktoré sa pozorujú v rôznych organizmoch, stávajú jasnými: môžu byť spojené s nerovnakým podielom určitých tried DNA v genóme organizmov. Teda napríklad u obojživelníka Amphiuma(ktorý má 20-krát viac DNA ako človek) opakujúce sa sekvencie tvoria až 80 % celkovej DNA, u cibule – až 70, u lososa – až 60 % atď. Skutočné bohatstvo genetických informácií by sa malo odrážať v zlomku jedinečných sekvencií. Nesmieme zabúdať, že v natívnej, nefragmentovanej molekule DNA chromozómu sú všetky oblasti, ktoré obsahujú jedinečné, stredne a často sa opakujúce sekvencie, spojené do jedného obrovského kovalentného reťazca DNA.

Molekuly DNA sú heterogénne nielen v oblastiach rôznych nukleotidových sekvencií, ale líšia sa aj svojou syntetickou aktivitou.

Replikácia eukaryotickej DNA

Bakteriálny chromozóm sa replikuje ako jedna štruktúrna jednotka, ktorá má jeden štartovací bod replikácie a jeden koncový bod. Bakteriálna kruhová DNA je teda jedna replikón. Od východiskového bodu replikácia prebieha v dvoch opačných smeroch, takže pri syntéze DNA vzniká takzvané replikačné oko, ohraničené na oboch stranách replikačnými vidličkami, ktoré je dobre viditeľné pri elektrónovom mikroskopickom vyšetrení vírusových a bakteriálnych replikujúcich sa chromozómov. .

V eukaryotických bunkách je organizácia replikácie iného charakteru - polyreplikón Ako už bolo spomenuté, pri pulznej inklúzii 3 HT sa takmer vo všetkých mitotických chromozómoch objavuje viacnásobné označenie. To znamená, že súčasne existuje veľa miest replikácie a veľa autonómnych počiatkov replikácie v interfázovom chromozóme. Tento jav bol podrobnejšie študovaný pomocou autorádiografie značených molekúl izolovaných z DNA (obr. 55) Ak boli bunky pulzne značené 3 HT, potom vo svetelnom mikroskope na autografoch izolovanej DNA vidieť oblasti redukovaného striebra. vo forme bodkovaných čiar. Sú to malé úseky DNA, ktoré sa dokázali replikovať a medzi nimi sú úseky nereplikovanej DNA, ktoré neopustili autorádiograf, a preto zostávajú neviditeľné. Keď sa čas kontaktu 3 NT s bunkou zvyšuje, veľkosť takýchto segmentov sa zväčšuje a vzdialenosť medzi nimi sa zmenšuje. Z týchto experimentov možno presne vypočítať rýchlosť replikácie DNA v eukaryotických organizmoch. Rýchlosť pohybu replikačnej vidlice sa ukázala byť 1-3 kb. za minútu u cicavcov asi 1 kb. za minútu v niektorých rastlinách, ktorá je oveľa nižšia ako rýchlosť replikácie DNA v baktériách (50 kb za minútu). V tých istých experimentoch bola priamo dokázaná polyreplikónová štruktúra DNA eukaryotických chromozómov: pozdĺž chromozomálnej DNA je pozdĺž nej veľa nezávislých replikačných miest - replikónov. Podľa vzdialenosti medzi stredmi susedných značkovacích replikónov, t.j. Na základe vzdialenosti medzi dvoma susednými začiatočnými bodmi replikácie možno určiť veľkosť jednotlivých replikónov. Priemerná veľkosť replikónu vyšších zvierat je asi 30 µm alebo 100 kb. V haploidnom súbore cicavcov by preto malo byť 20 000 – 30 000 replikónov. U nižších eukaryotov sú replikóny menšie, okolo 40 kb. V Drosophila je teda 3500 replikónov na genóm a v kvasinkách – 400. Ako už bolo spomenuté, syntéza DNA v replikóne prebieha v dvoch opačných smeroch. To sa dá ľahko dokázať autorádiografiou: ak sa bunkám po označení pulzom nechá nejaký čas pokračovať v syntéze DNA v médiu bez 3 HT, potom sa jej inklúzia v DNA zníži, dôjde k zriedeniu značky a na na autorádiografe bude možné vidieť symetrický vzor na oboch stranách replikovanej oblasti, čím sa zníži počet zŕn redukovaného striebra.

Replikujúce sa konce alebo vidlice v replikóne sa prestanú pohybovať, keď sa stretnú s vidlicami susedných replikónov (v koncovom bode spoločnom pre susedné replikóny). V tomto bode sú replikované časti susedných replikónov spojené do jednoduchých kovalentných reťazcov dvoch novosyntetizovaných molekúl DNA. Funkčné delenie chromozómovej DNA na replikóny sa zhoduje so štrukturálnym delením DNA na domény alebo slučky, ktorých základy, ako už bolo spomenuté, držia pohromade proteínovými väzbami.

Celá syntéza DNA na jednom chromozóme teda prebieha nezávislou syntézou na mnohých jednotlivých replikónoch, po ktorej nasleduje spojenie koncov susedných segmentov DNA. Biologický význam tejto vlastnosti je zrejmý pri porovnaní syntézy DNA v baktériách a eukaryotoch. Takto sa syntetizuje bakteriálny monoreplikónový chromozóm s dĺžkou 1600 mikrónov rýchlosťou asi pol hodiny. Ak by sa aj centimetrová molekula DNA chromozómu cicavca replikovala ako monoreplikónová štruktúra, trvalo by to asi týždeň (6 dní). Ale ak takýto chromozóm obsahuje niekoľko stoviek replikónov, potom jeho úplná replikácia bude trvať len asi hodinu. V skutočnosti je čas replikácie DNA u cicavcov 6-8 hodín. Je to spôsobené tým, že nie všetky replikóny jednotlivého chromozómu sú zapnuté súčasne.

V niektorých prípadoch sa pozoruje súčasné zahrnutie všetkých replikónov alebo objavenie sa ďalších počiatkov replikácie, čo umožňuje dokončiť syntézu všetkých chromozómov v minimálne krátkom čase. Tento jav sa vyskytuje v skorej embryogenéze niektorých zvierat. Je známe, že pri drvení vajíčok pazúrovitých žiab Xenopus laevis Syntéza DNA trvá len 20 minút, zatiaľ čo v kultúre somatických buniek tento proces trvá asi deň. Podobný obraz je pozorovaný u Drosophila: v skorých embryonálnych štádiách trvá celá syntéza DNA v jadre 3,5 minúty a v bunkách tkanivovej kultúry - 600 minút. Zároveň sa ukázalo, že veľkosť replikónov v kultivačných bunkách je takmer 5-krát väčšia ako v embryách.

Syntéza DNA prebieha nerovnomerne po dĺžke jednotlivého chromozómu. Zistilo sa, že v individuálnom chromozóme sú aktívne replikóny zostavené do skupín, replikačných jednotiek, ktoré zahŕňajú 20-80 počiatkov replikácie. Vyplynulo to z rozboru autogramov DNA, kde bolo presne takéto blokovanie replikujúcich sa segmentov pozorované. Ďalším základom pre myšlienku existencie blokov alebo zhlukov replikónov alebo replikačných jednotiek boli experimenty so zahrnutím tymidínového analógu, 5'-brómdeoxyuridínu (BrdU), do DNA. Zahrnutie BrdU do interfázového chromatínu vedie k tomu, že počas mitózy oblasti s BrdU kondenzujú v menšej miere (nedostatočná kondenzácia) ako oblasti, kde bol zahrnutý tymidín. Preto tie oblasti mitotických chromozómov, v ktorých je zahrnutý BrdU, budú počas diferenciálneho farbenia slabo zafarbené. To umožňuje určiť sekvenciu inkorporácie BrdU pomocou synchronizovaných bunkových kultúr, t.j. sekvencia syntézy DNA po dĺžke jedného chromozómu. Ukázalo sa, že k inklúzii prekurzora dochádza vo veľkých častiach chromozómu. Zahrnutie rôznych sekcií prebieha striktne postupne počas S-periódy. Každý chromozóm sa vyznačuje vysokou stabilitou poradia replikácie pozdĺž svojej dĺžky a má svoj vlastný špecifický vzor replikácie.

Zhluky replikónov, spojené do replikačných jednotiek, sú spojené s proteínmi jadrovej matrice (pozri nižšie), ktoré spolu s replikačnými enzýmami tvoria tzv. klusterozómy sú zóny v medzifázovom jadre, v ktorých prebieha syntéza DNA.

Poradie, v ktorom sú replikačné jednotky aktivované, môže byť pravdepodobne určené štruktúrou chromatínu v týchto oblastiach. Napríklad zóny konštitutívneho heterochromatínu (v blízkosti centroméry) sa zvyčajne replikujú na konci S-periódy; tiež na konci S-periódy sa časť fakultatívneho heterochromatínu zdvojnásobí (napríklad X chromozóm ženy cicavce). Sekvencia replikácie chromozómových úsekov obzvlášť jasne časovo koreluje so vzorom rozdielneho sfarbenia chromozómov: R-segmenty patria k skorým sa replikujúcim segmentom, G-segmenty zodpovedajú chromozómovým úsekom s neskorou replikáciou. C-segmenty (centroméry) sú miestami poslednej replikácie.

Keďže v rôznych chromozómoch je veľkosť a počet rôznych skupín odlišne sfarbených segmentov rôzny, vytvára to obraz asynchrónneho začiatku a konca replikácie rôznych chromozómov ako celku. V každom prípade postupnosť začiatku a konca replikácie jednotlivých chromozómov v súbore nie je náhodná. Existuje prísna sekvencia reprodukcie chromozómov vo vzťahu k ostatným chromozómom v sade.

Trvanie procesu replikácie jednotlivých chromozómov priamo nezávisí od ich veľkosti. Veľké ľudské chromozómy skupiny A (1-3) sú teda označené počas celej S-periódy, ako aj kratšie chromozómy skupiny B (4-5).

Syntéza DNA v eukaryotickom genóme teda začína takmer súčasne na všetkých chromozómoch jadra na začiatku S-periódy. Zároveň však dochádza k sekvenčnému a asynchrónnemu začleneniu rôznych replikónov v rôznych častiach chromozómov aj v rôznych chromozómoch. Replikačná sekvencia konkrétnej oblasti genómu je striktne určená geneticky. Toto posledné tvrdenie je dokázané nielen vzorom zahrnutia značky do rôznych segmentov S-periódy, ale aj skutočnosťou, že existuje prísna sekvencia výskytu vrcholov v citlivosti určitých génov na mutagény počas S-periódy. - obdobie.

1. Typy chromatínu

2. Gény, medzerníky

3. Sekvencia nukleotidov v DNA

4. Priestorová organizácia DNA

1. Počas odpočinku medzi dejmi delenia zostávajú určité úseky chromozómov a celé chromozómy kompaktné. Tieto oblasti chromatínu sa nazývajú heterochromatín. Dobre sa maľuje.

Po jadrovom delení sa chromatín uvoľňuje a v tejto forme je tzv euchromatínu. Heterochromatín je neaktívny vo vzťahu k transkripcii a vo vzťahu k replikácii DNA sa správa inak ako euchromatín.

Fakultatívne heterochromatín je heterochromatický len občas. Je informatívny, t.j. obsahuje gény. Keď vstúpi do euchromatického stavu, tieto gény sa môžu stať dostupnými na transkripciu. Z dvoch homológnych chromozómov môže byť jeden heterochromatický. Táto fakultatívna heterochromatizácia je tkanivovo špecifická a v určitých tkanivách sa nevyskytuje.

Konštitutívny heterochromatín vždy heterochromatické. Pozostáva z opakovane sa opakujúcich sekvencií báz, je neinformatívna (neobsahuje gény) a preto je vo vzťahu k transkripcii vždy neaktívna. Môžete ho vidieť A počas jadrového štiepenia. On chodí:

Najčastejšie na centromére;

Na koncoch chromozómov (vrátane satelitov);

V blízkosti organizátora jadierka;

Blízko génu 5S-RNA.

Heterochromatín, primárne fakultatívny, sa počas medzifázy môže zjednotiť do intenzívne zafarbeného chromocentra, ktoré sa vo väčšine prípadov nachádza na okraji bunkového jadra alebo jadierka.

2. Každý chromozóm je súvislá dvojitá špirála DNA, ktorý u vyšších organizmov pozostáva z viac ako 10 8 párov báz. V chromozómoch vyšších rastlín a živočíchov má každá dvojzávitnica DNA (priemer 2 nm) dĺžku od jedného do niekoľkých centimetrov. V dôsledku opakovaného skrúcania sa balí do chromatidy dlhej niekoľko mikrometrov.

Pozdĺž tejto dvojitej špirály sú lineárne rozložené gény, ktoré spolu tvoria až 25 % DNA.

Geneje funkčná jednotka DNA, obsahujúce informácie pre syntézu polypeptidu alebo RNA. Priemerná dĺžka génu je asi 1000 párov báz. Sekvencia báz v každom géne je jedinečná.

Medzi génmi sú rozpery- neinformatívne úseky DNA rôznej dĺžky (niekedy viac ako 20 000 párov báz), ktoré sú dôležité pre reguláciu transkripcie susedného génu.

Prepísané rozpery sú ukončené počas transkripcie spolu s génom a ich komplementárne kópie sa objavujú v pre-i-RNA na oboch stranách génovej kópie. Aj v samotnom géne existujú (len v eukaryotoch a ich vírusoch) neinformatívne sekvencie, takzvané intróny, ktoré sa tiež prepisujú. Počas spracovania sú všetky kópie intrónov a väčšina kópií spacerov vyrezané enzýmami.

Neprepisovateľné rozpery sa vyskytujú medzi génmi pre históny, ako aj medzi génmi pre rRNA.

Prebytočné gény sú zastúpené veľkým počtom (až 10 4 a viac) identických kópií. Toto sú gény:

pre tRNA;

5S-RNA a históny;

Pre produkty syntetizované vo veľkých množstvách.

Kópie sú umiestnené priamo vedľa seba a sú riešené identickými rozperami. V ježovke ležia gény pre históny H4, H2b, H2a a Hi jeden po druhom a táto génová sekvencia sa v DNA opakuje viac ako 100-krát.

3. Opakujúce sa sekvencie - Sú to sekvencie nukleotidov, ktoré sa v DNA nachádzajú viackrát. Stredne opakujúce sa sekvencie - sekvencie s priemernou dĺžkou 300 párov báz s 10 2 -10 4 opakovaniami. Patria sem nadbytočné gény, ako aj väčšina spacerov.

Vysoko opakujúce sa sekvencie s 105-106 opakovaniami tvoria konštitutívny heterochromatín. Oni vždy neinformatívne. Väčšinou ide o krátke sekvencie, najčastejšie sa v nich nachádza 7-10 a len zriedkavo - len 2 (napríklad AT) alebo naopak nad 300 nukleotidových párov. Zhlukujú sa, pričom jedna opakujúca sa sekvencia bezprostredne nasleduje za druhou. Vysoko sa opakujúce chromatínové DNA sa nazývajú „satelitné DNA“ kvôli ich správaniu počas analytických frakcionačných postupov. Asi 75 % všetkého chromatínu sa nezúčastňuje transkripcie: ide o vysoko repetitívne sekvencie a netranskriptovateľné medzerníky.

4. V izolovanom chromatíneúseky dvojzávitnice DNA sa ovinú okolo molekúl histónu, takže sa tu objaví superhelix prvého rádu. Komplexy DNA s histónom sú tzv nukleozómy. Majú tvar disku alebo šošovky a rozmery sú asi 10 x 10 x 5 nm. Jeden nukleozóm zahrnuté:

8 molekúl históny:

Centrálny tetramér dvoch molekúl H3 a dvoch H4; a oddelene dva H2a a H2b;

Úsek DNA (asi 140 párov báz), ktorý tvorí približne 1,25 závitu špirály a je pevne viazaný na centrálny tetramér.

Medzi nukleozómami sú úseky špirály s 30-100 pármi báz bez superhelikálnej štruktúry; Histón sa tu viaže Ahoj

V prešitom chromatíne DNA je ďalej skrátená málo pochopeným ďalším zvinutím (nadzávitnica vyššieho rádu), ktorá je zjavne fixovaná histónom Hi (a niektorými nehistónovými proteínmi). Počas prechodu do interfázy sa euchromatín uvoľňuje, keď sa odvíjajú niektoré zo supercoilov vyššieho rádu. K tomu pravdepodobne dochádza v dôsledku konformačných zmien histónov a oslabenia interakcií medzi molekulami Hi.Chromatínové štruktúry s hrúbkou 10-25 nm (hlavné chromatínové vlákna alebo helixy) sú viditeľné aj počas medzifázy.

1. Typy chromatínu

2. Gény, medzerníky

3. Sekvencia nukleotidov v DNA

4. Priestorová organizácia DNA

1. Počas odpočinku medzi dejmi delenia zostávajú určité úseky chromozómov a celé chromozómy kompaktné. Tieto oblasti chromatínu sa nazývajú heterochromatín. Dobre sa maľuje.

Najčastejšie na centromére;

Na koncoch chromozómov (vrátane satelitov);

V blízkosti organizátora jadierka;

Blízko génu 5S-RNA.

Pozdĺž tejto dvojitej špirály sú lineárne rozložené gény, ktoré spolu tvoria až 25 % DNA.

Geneje funkčná jednotka DNA, obsahujúce informácie pre syntézu polypeptidu alebo RNA. Priemerná dĺžka génu je asi 1000 párov báz. Sekvencia báz v každom géne je jedinečná.

Medzi génmi sú rozpery- neinformatívne úseky DNA rôznej dĺžky (niekedy viac ako 20 000 párov báz), ktoré sú dôležité pre reguláciu transkripcie susedného génu.

Neprepisovateľné rozpery sa vyskytujú medzi génmi pre históny, ako aj medzi génmi pre rRNA.

Prebytočné gény sú zastúpené veľkým počtom (až 10 4 a viac) identických kópií. Toto sú gény:

pre tRNA;

5S-RNA a históny;

Pre produkty syntetizované vo veľkých množstvách.

8 molekúl históny:

Centrálny tetramér dvoch molekúl H3 a dvoch H4; a oddelene dva H2a a H2b;

Úsek DNA (asi 140 párov báz), ktorý tvorí približne 1,25 závitu špirály a je pevne viazaný na centrálny tetramér.

Medzi nukleozómami sú úseky špirály s 30-100 pármi báz bez superhelikálnej štruktúry; Histón sa tu viaže Ahoj

Transkripčne aktívny chromatín – gény, ktoré prenášajú svoje informácie syntézou RNA, následkom ďalšej despiralizácie sa ešte viac uvoľní. Podľa niektorých údajov v zodpovedajúcich častiach špirály DNA histón Hi buď chýba, alebo je chemicky pozmenený, napríklad fosforylovaný.

Štruktúra nukleozómov sa tiež mení alebo je úplne zničená (v génoch pre r-RNA v jadierku). Dvojzávitnica sa na určitých miestach odvíja. Tieto procesy zjavne zahŕňajú určité nehistónové proteíny, ktoré sa akumulujú v transkribovaných oblastiach DNA.

Otázka 38. Sada chromozómov

/. genóm. Bunková ploidia

2. Polyténové chromozómy

1. Celý fond genetickej informácie každého bunkového jadra - genóm- rozdelené medzi určitý konštantný počet chromozómov (n). Toto číslo je špecifické pre každý druh alebo poddruh. U škrkavky koňskej je to 1, u kukurice - 10, u ľudí - 23, u rias Netrium digitus - asi 600. Chromozómy tej istej sady sú odlišné podľa nasledujúcich kritérií:

veľkosť;

Obrázok chromometra;

Poloha zúžení;

Záležiac na mnohopočetnosť chromozómovej sady - ploidia- bunky sa delia:

haploidný;

diploidný;

Polyploidný.

Haploidný sa nazývajú bunky, ktoré obsahujú jednu sadu chromozómov (“), napríklad pohlavné bunky.

Ak bunky obsahujú dvojitú sadu chromozómov (2 P), sú diploidný, keďže genetická informácia je v nich prezentovaná dvakrát. Takmer všetky somatické bunky vyšších rastlín a živočíchov sú diploidné. Obsahujú jednu otcovskú a jednu materskú sadu chromozómov.

IN polyploidný bunky majú niekoľko sád chromozómov (4 P, 8 P, 16 P atď.). Tieto bunky sú často obzvlášť metabolicky aktívne, ako napríklad mnohé pečeňové bunky u cicavcov.

Haploidné bunky vznikajú z diploidných buniek v dôsledku meiózy a diploidné bunky sa tvoria z haploidných buniek v dôsledku oplodnenia.

Polyploidné bunky vznikajú z diploidných endomitózou – predčasne prerušeným delením jadra: po kompletnej replikácii a oddelení chromatíd ostávajú dcérske chromozómy v jednom bunkovom jadre, namiesto toho, aby boli rozdelené medzi dve jadrá. Tento proces sa môže opakovať mnohokrát.

Anomálie pri tvorbe zárodočných buniek môže viesť k polyploidii celého organizmu. O neúplná replikácia Niektoré časti genómu, ako napríklad heterochromatín, sa po endomitóze nereplikujú a zostávajú diploidné, na rozdiel od iných častí, ktoré sa stávajú polyploidnými.

Génová amplifikácia - ide o viacnásobnú superreplikáciu, keď sa replikujú len určité gény a stanú sa polyploidnými (gény pre rRNA v jadierku).

Chromozómy diploidné jadro môžu byť zoskupené do párov, dvoch homológnych chromozómov. Väčšina z nich (tzv autozómy) párovo identické. Len dva pohlavné chromozómy, ktoré určujú pohlavie jedinca, nie sú rovnaké u mužov – sú to chromozómy X a Y (heterochromozómy). Väčšinu chromozómu Y zaberá konštitutívny heterochromatín. Ženy majú dva X chromozómy. U motýľov, vtákov a mnohých iných zvierat je však situácia opačná: samce majú nastavené XX, samice majú nastavené XY.

2. Polyténové chromozómy(obrovské chromozómy) obsahujú mnohonásobne viac DNA ako normálne. Počas celého deliaceho cyklu nemenia svoj tvar a dosahujú dĺžku až 0,5 mm a hrúbku 25 mikrónov. Nachádzajú sa napríklad v slinných žľazách dvojkrídlovcov (muchy a komáre), v makronuklee nálevníkov a v tkanivách vaječníkov fazule. Najčastejšie sú viditeľné v haploidnom počte, pretože homológne chromozómy sú úzko spárované. Polyténia vzniká v dôsledku endoreplikácie. V porovnaní s endomitózou ide o ešte viac redukovaný proces delenia – po replikácii nedochádza k separácii chromatíd (proces sa mnohokrát opakuje). V čom rôzne úseky DNA sú znásobené v rôznej miere:

Oblasti Centromer - nevýznamné;

Väčšina informačných oblastí je približne 1000-krát;

Niektoré - viac ako 30 000 krát.

Preto polyténové chromozómy Sú to zväzky nespočetných chromatidov, ktoré nie sú úplne oddelené. Chromatidy sú natiahnuté, homológne chromoméry tvoria tmavé disky tesne umiestnené pozdĺž chromozómu. Tieto disky sú oddelené svetlejšími pruhmi. Pravdepodobne na chromatíde jeden disk a jeden stredný pruh tvoria okrem medzerníka jeden gén (menej často niekoľko génov), ktorý sa zjavne nachádza na disku. Polyténové chromozómy sú extrémne chudobné na heterochromatín.

Na polyténových chromozómoch samostatné disky niekedy napučiavať do pufy(Balbianiho krúžky). Tam sa homológne chromatidy od seba oddelia, homológne chromoméry sa vzdialia a objaví sa voľná štruktúra transkripčne aktívneho chromatínu. Puffy obsahujú menej histónu Hi ako disky a namiesto toho obsahujú enzým RNA polymerázu (ktorá indikuje syntézu RNA). V stredných pásoch je tiež málo histónu Hi, ale je tu RNA polymeráza a možno sa vyskytne aspoň malá syntéza RNA.

V chromatínovom prípravku tvorí DNA zvyčajne 30 – 40 %. Táto DNA je dvojvláknová špirálová molekula. Chromatínová DNA má molekulovú hmotnosť 7-9*106. Takúto relatívne malú hmotnosť DNA z prípravkov možno vysvetliť mechanickým poškodením DNA počas procesu izolácie chromatínu.

Celkové množstvo DNA obsiahnuté v jadrových štruktúrach buniek, v genóme organizmov, sa líši od druhu k druhu. Pri porovnávaní množstva DNA na bunku v eukaryotických organizmoch je ťažké rozlíšiť akúkoľvek koreláciu medzi stupňom zložitosti organizmu a množstvom DNA na jadro. Rôzne organizmy, ako je ľan, ježovka, ostriež (1,4-1,9 pg) alebo sivoň a býčie ryby (6,4 a 7 pg), majú približne rovnaké množstvo DNA.

Niektoré obojživelníky majú vo svojich jadrách 10-30-krát viac DNA ako v ľudských, hoci genetická konštitúcia človeka je neporovnateľne zložitejšia ako u žiab. V dôsledku toho možno predpokladať, že „nadbytočné“ množstvo DNA v nižšie organizovaných organizmoch buď nesúvisí s plnením genetickej úlohy, alebo sa počet génov toľkokrát opakuje.

Satelitná DNA alebo frakcia DNA s často opakovanými sekvenciami sa môže podieľať na rozpoznávaní homológnych oblastí chromozómov počas meiózy. Podľa iných predpokladov zohrávajú tieto oblasti úlohu separátorov (spacerov) medzi rôznymi funkčnými jednotkami chromozomálnej DNA.

Ako sa ukázalo, frakcia stredne sa opakujúcich (od 102 do 105-krát) sekvencií patrí do pestrej triedy oblastí DNA, ktoré hrajú dôležitú úlohu v metabolických procesoch. Táto frakcia zahŕňa gény ribozomálnej DNA, opakovane opakované úseky na syntézu všetkých tRNA. Navyše niektoré štruktúrne gény zodpovedné za syntézu určitých proteínov sa môžu tiež mnohokrát opakovať, reprezentované mnohými kópiami (gény pre chromatínové proteíny - históny).

DNA eukaryotických buniek má teda heterogénne zloženie a obsahuje niekoľko tried nukleotidových sekvencií:

často opakované sekvencie (>106-krát), zahrnuté v satelitnej frakcii DNA a neprepísané;

zlomok stredne sa opakujúcich sekvencií (102 - 105), ktoré predstavujú bloky skutočných génov, ako aj krátke sekvencie roztrúsené po celom genóme;

frakcia jedinečných sekvencií, ktorá nesie informácie pre väčšinu bunkových proteínov.

DNA prokaryotického organizmu je jedna obrovská cyklická molekula. DNA eukaryotických chromozómov sú lineárne molekuly pozostávajúce z replikónov rôznych veľkostí usporiadaných v tandeme (jeden po druhom). Priemerná veľkosť replikónu je asi 30 mikrónov. Ľudský genóm by teda mal obsahovať viac ako 50 000 replikónov, úsekov DNA, ktoré sú syntetizované ako nezávislé jednotky. Tieto replikóny majú počiatočný a konečný bod pre syntézu DNA.

Predstavme si, že v eukaryotických bunkách je každá z chromozomálnej DNA, podobne ako v baktériách, jeden replikón. V tomto prípade by pri rýchlosti syntézy 0,5 mikrónu za minútu (u ľudí) mala reduplikácia prvého chromozómu s dĺžkou DNA asi 7 cm trvať 140 000 minút, teda asi tri mesiace. V skutočnosti, kvôli polyreplikónovej štruktúre molekúl DNA, celý proces trvá 7-12 hodín.

Odstránenie histónu H1 z transkripčne aktívneho chromatínu 1*2*. Skoré experimenty J. Bonnera (USA) ukázali, že DNA v chromatíne je oveľa horšia matrica ako voľná DNA. Na základe týchto pozorovaní bolo navrhnuté, že históny sú transkripčné represory.

L. N. Ananyeva a Yu. V. Kozlov Naše laboratórium sa pustilo do zisťovania, či majú inhibičný účinok všetky históny alebo len niektoré z nich. Za týmto účelom boli históny odstránené z chromatínu myších Ehrlichových ascitických rakovinových buniek extrakciou roztokmi NaCl s postupne sa zvyšujúcimi koncentráciami. Výsledné prípravky slúžili ako templát pre syntézu RNA. Transkripcia sa uskutočnila v prítomnosti RNA polymerázy z Escherichia coli, E. coli, ktorá sa odobrala v nadbytku, a zmesi nukleozidtrifosfátov. V rozsahu 0,4-0,6 M NaCl došlo k prudkej dekondenzácii materiálu, ktorá sa prejavila napučaním jadrového gélu a dokonca rozpustením DNP (ak sa uskutočnilo ďalšie mechanické spracovanie). Ukázalo sa, že to selektívne odstraňuje histón HI. Súčasne s dekondenzáciou chromatínu došlo k prudkému zvýšeniu jeho matricovej aktivity (obr. 26). Ďalšie zvýšenie koncentrácie soli v extrakčnom roztoku viedlo k odstráneniu ďalších histónov a miernemu, ale nie veľmi výraznému dodatočnému zvýšeniu aktivity matrice.

0 t. Hybridizovateľnosť teda odhaľuje percento opakujúcich sa sekvencií v syntetizovanej RNA (podľa výsledkov, ktoré získali L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov a autor); b - hlavné parametre syntézy RNA na rôznych matriciach: voľná DNA, pôvodný chromatín (DNP 0) a chromatín, z ktorého bol histón H1 odstránený extrakciou 0,6 M NaCl (DNP 0,6). Syntéza RNA sa uskutočnila s použitím RNA polymerázy Escherichia coli v prítomnosti značených nukleozidtrifosfátov: [14C]-ATP a buď [y-32P]-ATP alebo [y-32P]-GTP. [14C]-UMP bol zahrnutý v celej RNA a [y-32P] - iba na začiatku reťazca (pp x A- alebo pp x G). Inými slovami, zahrnutie [32P] poskytlo informácie o začatí syntézy a [14C] - o samotnej syntéze RNA. V niektorých experimentoch sa 3-4 minúty po začiatku inkubácie pridalo do média rifampicín, antibiotikum, ktoré zabránilo iniciácii nových reťazcov RNA, ale neovplyvnilo už začatú syntézu, teda predlžovanie. 1 - zahrnutie [14C] - UMP, 2 - to isté po pridaní rifampicínu; 3 - zahrnutie [y-32P]-ATP + GTP; 4 - to isté po pridaní rifampicínu. Na základe týchto inklúznych kriviek je možné vypočítať hlavné parametre RNA polymerázovej reakcie (na základe výsledkov získaných Yu. V. Kozlovom a autorom)">
Ryža. 26. Vplyv histónu H1 na templátovú aktivitu DNA v chromatíne. a - účinok odstránenia proteínov z chromatínu (1) na matricovú aktivitu (2) chromatínu v prítomnosti exogénnej RNA polymerázy Escherichia coli, ako aj na hybridizovateľnosť syntetizovanej RNA (3). Históny a nehistónové proteíny sa extrahovali so zvyšujúcimi sa koncentráciami roztokov NaCl. V rozsahu 0,4 M NaCl - 0,6 M NaCl bol histón H1 selektívne odstránený. Syntetizovaná RNA sa hybridizovala s nadbytkom DNA pri stredných hodnotách COt. Hybridizovateľnosť teda odhaľuje percento opakujúcich sa sekvencií v syntetizovanej RNA (podľa výsledkov, ktoré získali L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov a autor); b - hlavné parametre syntézy RNA na rôznych matriciach: voľná DNA, pôvodný chromatín (DNP 0) a chromatín, z ktorého bol histón H1 odstránený extrakciou 0,6 M NaCl (DNP 0,6). Syntéza RNA sa uskutočnila s použitím RNA polymerázy Escherichia coli v prítomnosti značených nukleozidtrifosfátov: [14C]-UTP a buď [y-32P]-ATP alebo [y-32P]-GTP. [14C]-UMP bol zahrnutý v celej RNA a [y-32P] - iba na začiatku reťazca (pp x A- alebo pp x G). Inými slovami, zahrnutie [32P] poskytlo informácie o začatí syntézy a [14C] - o samotnej syntéze RNA. V niektorých experimentoch sa 3-4 minúty po začiatku inkubácie pridalo do média rifampicín, antibiotikum, ktoré zabránilo iniciácii nových reťazcov RNA, ale neovplyvnilo už začatú syntézu, teda predlžovanie. 1 - zahrnutie [14C] - UMP, 2 - to isté po pridaní rifampicínu; 3 - zahrnutie [y-32P]-ATP + GTP; 4 - to isté po pridaní rifampicínu. Na základe týchto inklúznych kriviek možno vypočítať hlavné parametre RNA polymerázovej reakcie (na základe výsledkov získaných Yu. V. Kozlovom a autorom)

Vlastnosti syntetizovaného in vitro RNA hybridizáciou s celkovou myšacou DNA. V tomto prípade bola detegovaná frakcia RNA syntetizovaná na opakujúcich sa sekvenciách DNA. Ukázalo sa, že v chromatíne je transkripcia opakovaných sekvencií DNA obmedzená. Avšak po extrakcii chromatínu 0,6 M NaCl, keď bol odstránený histón H1, sa hybridizačné vlastnosti RNA syntetizovanej na matrici takéhoto chromatínu a na matrici voľnej DNA stali nerozoznateľnými. Predpokladali sme, že históny H2a, H2b, H3 a H4 (vtedy nazývané inak - históny stredne bohaté na lyzín a bohaté na arginín) sa nezúčastňujú na potlačovaní transkripcie, ale hrajú čisto štrukturálnu úlohu v organizácii chromatínu, zatiaľ čo histón H1 (v starom terminológia histón bohatý na lyzín) je inhibítorom syntézy RNA. Zároveň je tiež faktorom spôsobujúcim kondenzáciu chromatínu (pozri vyššie).

Neskôr Yu.V. Kozlov študoval mechanizmus inhibície transkripcie histónom H1, opäť na bezbunkovom systéme s RNA polymerázou izolovanou z E, coli. Študoval sa účinok histónu H1 na procesy iniciácie a predĺženia (pozri obr. 26, tabuľka 4). Ukázalo sa, že niekoľkokrát znižuje počet reťazcov RNA iniciovaných na natívnej chromatínovej matrici. Predĺženie je obzvlášť výrazne inhibované: RNA polymeráza nečíta viac ako 100-150 bp. DNA a potom sa zastaví. Medzitým na chromatíne, z ktorého bol odstránený histón H1, RNA polymeráza číta niekoľko tisíc párov nukleotidov naraz a dĺžka reťazcov sa nelíši od dĺžky reťazcov syntetizovaných na templáte voľnej DNA. Je pravda, že na voľnej DNA v porovnaní s chromatínom, z ktorého bol odstránený histón H1, prebiehajú procesy iniciácie syntézy RNA efektívnejšie. Dospelo sa k záveru, že histón H1 kondenzáciou chromatínu vytvára prekážky v ceste RNA polymerázy a tým zastavuje syntézu RNA.

* (DNPM je DNP izolovaný pôsobením močoviny, ktorá je úplne solubilizovaná, ale zachováva si histón H1.)

Vo svetle moderných údajov o štruktúre solenoidu fibrily 300 A-DNP, ktorá závisí od prítomnosti histónu H1, je tento výsledok ľahko vysvetliteľný. V skutočnosti RNA polymeráza zjavne nedokáže prečítať viac ako 100 bp v solenoide. kvôli čisto topologickým obmedzeniam.

Podľa našej hypotézy, keď bol gén aktivovaný, histón H1 by mal byť odstránený. V tom čase to však nebolo možné overiť. Len relatívne nedávno sa objavili dôkazy o strate histónu H1 z chromatínu počas aktivácie génu. Keď sa teda aktívne transkribované oblasti chromatínu, napríklad minijadierka, izolovali z množstva organizmov, histón H1 sa v nich nezistil. Nenachádza sa ani v kvasinkách, kde sú potenciálne aktívne všetky gény.

Presvedčivé výsledky boli získané v laboratóriu A. D. Mirzabekova V. L. Karpov a O. V. Preobraženskaja. Vyvinuli metódu nazvanú „histónová tieňová hybridizácia“. Aby sa to dosiahlo, DNA sa zosieťovala s histónmi pomocou dimetylsulfátu za podmienok, kde je v priemere jedna molekula histónu zosieťovaná na segment DNA s dĺžkou približne 200 až 300 bp. DNA sa potom fragmentovala a uskutočnila sa dvojrozmerná elektroforéza na polyakrylamidovom géli dodecylsulfát sodný. Po prebehnutí prvým smerom boli históny naviazané na DNA zničené proteinázou a už voľná DNA bola urýchlená druhým smerom. Keďže počas prvého kola elektroforézy rôzne históny rôznymi spôsobmi spomaľovali pohyb fragmentov DNA, po druhom behu sa odhalilo niekoľko uhlopriečok (obr. 27). Zvyčajne sú jasne viditeľné tri: jeden zodpovedá pôvodne voľnej DNA, druhý pôvodným komplexom DNA s jadrovými histónmi a tretí (dole) pôvodnému komplexu DNA s histónom H1. Výsledná DNA sa prenesie na filter a hybridizuje s konkrétnou vzorkou. Ak sa na hybridizáciu použila neaktívna oblasť genómu, napríklad medzerník ribozomálneho génu Drosophila, potom bola značka spojená so všetkými diagonálami. Ak sa však ako vzorka použil gén tepelného šoku, ktorý bol transkribovaný v bunkách, z ktorých bol izolovaný chromatín, potom hybridizácia s diagonálou zodpovedajúcou komplexom DNA s histónom H1 bola prudko oslabená alebo úplne chýbala. Inými slovami, v jadrách pred pripojením DNA transkribovaného génu nemala žiadne kontakty s histónom H1.

Ryža. 27. Strata histónu H1 a jadrových histónov po aktivácii transkripcie. Experimenty sa uskutočňovali na kultivačných bunkách D. melanogaster (a, b) v podmienkach kultivácie pri 25 °C (a) a tepelnom šoku (b). V prípade a nedochádza k expresii génov tepelného šoku, v prípade b je veľmi aktívny. Okrem toho sa uskutočnili experimenty na dechorionizovaných embryách (c), kde je expresia génov tepelného šoku na priemernej úrovni. Po vytvorení komplexov DNA-proteín, izolácii fragmentov DNA, ich dvojrozmernej separácii (vo vertikálnom smere po odstránení proteínu) a prenose na filter boli rovnaké filtre hybridizované s rôznymi vzorkami: s regulačnou oblasťou gén tepelného šoku p70 (HS-5") ; s kódujúcou oblasťou rovnakého génu (kód TS); so vzorkou transkripčne neaktívnej inzercie do génu rDNA (neaktívna). V neaktívnom géne sú viditeľné tri diagonály ; 1 - voľná DNA, 2 - komplexy DNA s oktamérovými histónmi; 3 - komplexy DNA s histónom H1 Oslabenie alebo vymiznutie komplexov DNA-histón pri aktivácii chromatínu je viditeľné (podľa výsledkov získaných A. D. Mirzabekovom a kol.)

Hoci všetky v súčasnosti dostupné údaje, brané jednotlivo, umožňujú iné interpretácie, spolu poskytujú silný dôkaz v prospech odstránenia histónu H1 z aktívneho chromatínu. Mechanizmus tohto procesu je však stále úplne nejasný.

Osud nukleozómov počas aktivácie chromatínu 2* [154-157]. Menej jasná je otázka osudu histónov H2a, H2b, H3 a H4, ktoré tvoria jadro nukleozómu. Vo vyššie uvedených experimentoch Yu.V. Kozlová ich prítomnosť nemala prakticky žiadny vplyv na transkripciu DNA RNA polymerázou z E. coli. Pri štúdiu produktov hydrolýzy eukaryotického chromatínu mnohí autori zistili, že nukleozómy obsahujú DNA aktívnych génov, t.j. tie sú tiež organizované do nukleozómov. Údaje získané z veľkého experimentálneho materiálu A. D. Mirzabeková a kol. ukazujú, že nukleozómy obsahujúce aktívne transkribovanú DNA sú v zásade konštruované rovnakým spôsobom ako nukleozómy obsahujúce neaktívnu DNA, hoci niektoré kontakty DNA-histón v nich sú zmenené.

Uskutočnili sa aj experimenty s hybridizáciou s histónovými tieňmi, o ktorých sa hovorilo v predchádzajúcej časti (pozri obr. 27). Prípravky s uhlopriečkami boli pripravené z buniek Drosophila, v ktorých gény tepelného šoku buď nefungovali vôbec, teda boli vypnuté, alebo fungovali na nízkej úrovni, alebo boli nakoniec tepelným šokom stimulované k aktívnej transkripcii. Vo všetkých prípadoch bola kontrolnou vzorkou DNA medzerníka ribozomálneho génu, ktorý hybridizoval vo všetkých troch uhlopriečkach, vrátane uhlopriečky odvodenej z komplexov DNA s jadrovými histónmi.

Gén tepelného šoku tiež normálne hybridizoval s touto diagonálou z buniek, kde nebol transkribovaný. Avšak s materiálom získaným z buniek so strednou transkripciou génu tepelného šoku bola hybridizácia druhej diagonály výrazne znížená. Nakoniec, ak boli uhlopriečky získané z buniek s veľmi aktívnou syntézou mRNA tepelného šoku, potom druhá uhlopriečka nebola počas hybridizácie vôbec viditeľná (rovnako ako tretia) a odhalila sa iba uhlopriečka, ktorá zodpovedala nezosieťovanej DNA. Všeobecným záverom zo štúdií s použitím metódy DNA-proteínového zosieťovania bolo, že počas transkripcie RNA polymeráza pohybujúca sa pozdĺž reťazca DNA reverzibilne koliduje nukleozómy s DNA a prepisuje prakticky nahú DNA. Ak je úroveň transkripcie nízka a po DNA sa plazí málo RNA polymeráz, potom majú nukleozómy čas na opätovné vytvorenie v oblasti, cez ktorú už RNA polymeráza prešla. Ak je transkripcia aktívna, potom nukleozomálna štruktúra DNA nemá čas na obnovenie a DNA vo všeobecnosti neobsahuje históny. Zároveň sa predpokladá, že organizácia nukleozómov v aktívnom chromatíne sa prakticky nelíši od organizácie v neaktívnom chromatíne. Nedávno A.D. Mirzabekov a kol. reprodukovali experimenty na pripojenie histónov k DNA s použitím inej metódy, ošetrením izolovaných jadier platinovými prípravkami. Táto metóda je miernejšia ako dimetylsulfát. V zásade sa dosiahli rovnaké výsledky.

Spolu s týmto súborom údajov existujú štúdie, v ktorých autori dospeli k trochu iným záverom. W. Garrard a A. Worsel(USA), ktorí študovali stav aktívnych génov v chromatíne pomocou nukleázovej hydrolýzy a elektrónovej mikroskopie, dospeli k záveru, že nukleozómy zostávajú v aktívnom chromatíne, ale podliehajú štrukturálnym zmenám, ako je otáčanie sa, premena na polovičné nukleozómy. V dôsledku toho je periodicita v elektroferogramoch hydrolyzátov s mikrokokovou nukleázou ~ 200 bp. nahradená periodicitou ~100 bp. Pomocou elektrónovej mikroskopie sa počet guľôčok zdvojnásobí a ich veľkosť sa zníži. Predpokladá sa, že RNA polymeráza môže prechádzať cez takéto rozvinuté nukleozómy.

Túto možnosť podporujú aj získané údaje T. Koller(Švajčiarsko). Vyvinul originálnu metódu na štúdium nukleozómov. Bunky sú ošetrené psoralénom, látkou, ktorá sa viaže na DNA a potom zosieťuje dva reťazce DNA spolu s UV svetlom. Ak je však DNA súčasťou nukleozómov, nedochádza k jej reakcii s psoralénom. Ak sa teda DNA izolovaná z ošetrených buniek denaturuje v prítomnosti formaldehydu (bráni renaturácii DNA), potom sa pri elektrónovej mikroskopii objavia striedavé bubliny (dve vlákna denaturovanej DNA) zodpovedajúce nukleozómom, ktoré sú navzájom spojené jednoduchými vláknami (skrížené). -spojené, neschopné denaturácie) sú viditeľné na DNA.DNA) zodpovedajúce internukleozomálnym linkerom. Najprv boli študované aktívne transkribované ribozomálne RNA gény, ktoré sú súčasťou extrachromozomálnych štruktúr, a preto sa dajú ľahko analyzovať pomocou elektrónovej mikroskopie. V nich nie sú viditeľné vezikuly zodpovedajúce nukleozómom, t.j. s najväčšou pravdepodobnosťou sú históny úplne odstránené z transkribovaných oblastí. Je zaujímavé, že v neprepísaných oblastiach sú jasne viditeľné medzerníky, bubliny DNA (nukleozómy).

Rozdielne výsledky sa však získali na minichromozómoch SV40, ktoré sú transkribované skôr RNA polymerázou II než RNA polymerázou I, ako sú ribozomálne gény RNA (obr. 28). Transkripčne aktívne minichromozómy sa identifikujú vďaka prítomnosti rastúcich reťazcov RNA (zvyčajne jedného alebo dvoch) na nich. Takéto minichromozómy tvoria 1-2% všetkých minichromozómov izolovaných z bunky. Obsahujú však rovnaký počet vezikúl ako neaktívne minichromozómy a ich veľkosť je v oboch prípadoch rovnaká. Najzaujímavejšie je, že RNA reťazce siahajú od linkerov aj priamo z vezikúl, t.j. RNA polymeráza zjavne transkribuje nukleozómy. Tieto údaje podporujú rozvinutie nukleozómov a ich transkripciu pomocou RNA polymerázy.

Všetky vyššie uvedené výsledky nie sú priame, a preto by budúce experimenty mali poskytnúť konečné riešenie otázky osudu nukleozómov počas transkripcie.

Histónová modifikácia a histónové varianty: asociácia s aktívnym chromatínom. Začiatkom 60. rokov Allfrey (USA) ukázal, že históny môžu prejsť rôznymi úpravami. Histón HI je teda fosforylovaný na e-aminoskupinách lyzínov. Históny H3 a H4 sú acetylované na rovnakých skupinách. Existuje množstvo ďalších modifikácií (metylácia, ADP – ribozylácia, ubikvitinácia atď.).

Okamžite sa predpokladalo, že enzymatické modifikácie histónov môžu ovplyvniť štruktúru chromatínu a jeho aktivitu. Pri fosforylácii lyzínu sa totiž jeden pozitívny náboj v históne nahradí negatívnym, pri odvolaní sa pozitívny náboj stratí atď. gélová elektroforéza v acetátovom pufri s močovinou. Pri elektroforéze s vysokým rozlíšením teda histón H4 nedáva jeden, ale štyri pásy zodpovedajúce molekulám, ktoré nie sú acetylované a acetylované na jednom, dvoch a troch lyzínových zvyškoch. V rôznych tkanivách sa pomer medzi frakciami mení. Históny H3, H2a, H2b a H1 sú rozdelené do niekoľkých frakcií (rôzne stupne acetylácie a fosforylácie).

Bohužiaľ stále neexistujú žiadne dobré metódy na separáciu transkripčne aktívneho a neaktívneho chromatínu, a preto je ťažké pripísať zmenené histónové formy jednému alebo druhému stavu chromatínu. Najzaujímavejšie údaje v tomto smere získal ten istý W. Alfrey(USA). Pri hydrolýze aktívneho chromatínu izoloval nezvyčajné častice, ktoré sedimentovali v sacharózovom gradiente pomalšie ako bežné nukleozómy a podľa názoru autora zodpovedali rozvinutým nukleozómom. Tieto častice, nazývané častice A, obsahovali všetky jadrové históny. Na rozdiel od normálnych nukleozómov boli SH skupiny histónu H3 v časticiach A prístupné pre množstvo chemických činidiel, a preto bolo možné častice A od nukleozómov oddeliť frakcionáciou na chlórortuťnatých benzoátových kolónach (činidlo viažuce SH skupinu). A-častice obsahujú zvýšený obsah acetylovaných foriem histónov. Autor naznačuje, že acetylácia histónu po aktivácii chromatínu vedie k rozvinutiu nukleozomálnych častíc, čo zase zvyšuje dostupnosť SH skupín histónu H3.

Niektoré históny sú kódované viac ako jedným typom génu. Výsledkom je, že existuje niekoľko variantov týchto histónov, ktoré sa mierne líšia v sekvencii aminokyselín. Niekedy v procese ontogenézy dochádza k prirodzenému nahradeniu jednej histónovej podtriedy inou. Zostáva však nejasné, či to má nejaký regulačný význam. Problém je samozrejme možné vyriešiť aj po vývoji adekvátnych metód na izoláciu transkripčne aktívneho chromatínu.

Osobitné postavenie zaujíma histón H1. Existujú možnosti, ktoré sa výrazne líšia svojou štruktúrnou organizáciou. Touto možnosťou je napríklad histón H5, ktorý nahrádza významnú časť histónu H1 v jadrách vtáčích erytrocytov. S najväčšou pravdepodobnosťou je táto substitúcia dôležitým faktorom pre úplné vypnutie transkripcie v jadrách erytrocytov. V normálnych bunkách existuje variant histónu H1 - histón H10. Jeho obsah tvorí malý zlomok celkového histónu H1. Existuje množstvo protichodných údajov o tom, že H1 0 súvisí s aktívnymi génmi alebo, naopak, so stabilne vypnutými génmi. Otázka zostáva otvorená.

HMG proteíny sa môžu podieľať na organizácii aktívneho chromatínu 1*. Okrem histónov obsahuje chromatín mnoho nehistónových proteínov, ktorých funkcia nie je známa. Medzi nimi by samozrejme mali byť štrukturálne proteíny, enzýmy, ktoré zabezpečujú procesy replikácie, transkripcie atď., a regulačné proteíny. E. Jones(Veľká Británia) sa pokúsili izolovať proteínové zložky prítomné v dostatočne veľkých množstvách, aby umožnili ich analýzu a identifikáciu. V skutočnosti sa mu podarilo izolovať novú triedu jadrových proteínov, ktoré nazval „skupina proteínov s vysokou mobilitou“ ( skupina s vysokou mobilitou alebo HMG proteíny. Názov závisel od vysokej mobility týchto proteínov počas gélovej elektroforézy. Proteínová frakcia HMG sa rozkladá na množstvo jednotlivých zložiek. Z nich najreprezentatívnejšie a dobre charakterizované sú HMG-1, HMG-2, HMG-14 a HMG-17.

HMG proteíny majú nízku molekulovú hmotnosť. Sú obohatené o bázické aj dikarboxylové aminokyseliny. Obsah HMG proteínov je približne 7% obsahu histónov. Môže sa líšiť v jadrách z rôznych typov buniek. V tejto súvislosti nás najviac zaujímajú proteíny HMG-14 a HMG-17, pre ktoré boli získané dôkazy o možnej úlohe pri aktivácii transkripcie. H. Weintraub(USA) ukázali, že jadrová extrakcia s 0,35 M NaCl, ktorá extrahuje HMG proteíny, mení niektoré vlastnosti aktívneho chromatínu, ktoré sa obnovia po pridaní HMG-14 a HMG-17 do chromatínu. G. Dixon(Kanada) objavil tieto proteíny v zložení nukleozómov uvoľnených z chromatínu v skorých štádiách hydrolýzy nukleázou, ktoré boli podľa jeho údajov obohatené o DNA trakčne aktívnych génov.

konce [32P] a potom hybridizované s hnRNA z L buniek. Hybridy sa detegovali gélovou filtráciou. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - celková DNA bunky (podľa výsledkov získaných V.V. Bakaevom a kol.)">
Ryža. 29. Možné spojenie HMG proteínov (14 a 17) s aktívnym chromatínom. a - detekcia subnukleozómov v hydrolyzátoch chromatínu pomocou mikrokokovej nukleázy. V rôznych štádiách hydrolýzy sa objavujú určité frakcie subnukleozómov. Elektroforéza sa uskutočnila v polyakrylamidovom géli za nedenaturačných podmienok. Farbenie etídiumbromidom, fluorografia v pravom stĺpci; b - použitie dvojrozmernej elektroforézy na stanovenie proteínového zloženia subnukleozómov CH2 a CH3. Chromatín značený [14 C] proteínom bol hydrolyzovaný mikrokokovou nukleázou a separovaný dvojrozmernou elektroforézou (1. smer – nedisociujúce médium, 2. smer – roztok dodecylsulfátu sodného), po ktorej bola vykonaná autorádiografia na identifikáciu proteínov. Písmená označujú HMG proteíny, ktoré v čase experimentu ešte neboli identifikované so známymi. Teraz vieme, že A je HMG-1, B je HMG-2, E je HMG-14, G je HMG-17, HMG proteíny F a H nie sú jasne identifikované, pravdepodobne H tiež zodpovedá HMG-17. Je možné vidieť, že HMG proteíny sú súčasťou mononukleozómov (MH-2 a MH-3) a subnukleozómov CH-2 (HMG-17) a CH-3 (HMG-14); c - demonštrácia obohatenia DNA prepisovaných sekvencií CH-2 a CH-3. DNA izolovaná z CH-2 a CH-3 pásov L buniek bola označená na 5" koncoch [32 P] a potom hybridizovaná s hnRNA z L buniek. Hybridy sa detegovali gélovou filtráciou. 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - celková DNA bunky (podľa výsledkov získaných V.V. Bakaevom a kol.)

V. V. Bakajev v našom laboratóriu dospeli k záveru o úlohe HMG proteínov pri transkripcii pomocou odlišného experimentálneho prístupu. Počas elektroforetickej analýzy hydrolyzátov chromatínu odhalil okrem nukleozómov a oligonukleozómov aj menšie zložky s väčšou pohyblivosťou. Nazývali sa subnukleozómy a samozrejme boli produktmi ďalšieho rozpadu nukleozómu (obr. 29, tabuľka 5). Subnukleozóm CH-7 zodpovedal nukleozómu, ktorý stratil jednu molekulu H2a a H2b a obsahoval DNA skrátenú o 40 bp; CH-6 zodpovedal komplexu DNA s dĺžkou 30-40 bp. s histónom H1, ktorý sa odštiepi z MH-2 pri jeho transformácii na MH-1. CH-4 obsahoval DNA segment a pár histónov H2a a H2b (produkt reakcie MH-1→CH-7→CH-4). Dva subnukleozómy, CH-3 a CH-2, pozostávali z krátkej DNA a HMG proteínov (HMG-14 a HMG-17). Dalo by sa predpokladať, že ide o spojovacie oblasti spojené s proteínmi HMG-14 a HMG-17, ktoré prechádzajú do roztoku po štiepení zodpovedajúcich nukleozómov. Zozbierali sa CH-2 a CH-3, izolovala sa z nich DNA, koncovo sa označila a študovala sa jej hybridizácia s jadrovou RNA. Ukázalo sa, že DNA z CH-2 a CH-3 hybridizuje oveľa efektívnejšie s jadrovou RNA ako celková bunková DNA fragmentovaná na rovnakú veľkosť.

Preto sa dospelo k záveru, že DNA spojená s proteínmi HMG-14 a HMG-17 pravdepodobne pochádza z transkripčne aktívneho chromatínu.

Všetky tieto údaje získané nezávisle naznačujú, že HMG-14 a HMG-17 sú nejakým spôsobom spojené s aktiváciou génu. Mechanizmus aktivácie bol však úplne nejasný. HMG-14 a HMG-17 nemôžu byť primárnymi faktormi ovplyvňujúcimi gén, pretože im chýba špecifickosť. Niekto by si mohol myslieť, že sa podieľajú na udržiavaní „otvorenej konformácie“ aktívneho chromatínu.

V nasledujúcich rokoch sa objavil skepticizmus týkajúci sa úlohy HMG-14 a HMG-17 pri aktivácii chromatínu. Najmä nedávno A. D. Mirzabekov a kol. pomocou metódy hybridizácie s proteínovými tkanivami sme získali údaje o deplécii aktívneho chromatínu HMG-14 a HMG-17. Keďže sú však všetky vyššie uvedené údaje nepriame, vo všeobecnosti zostáva otázka úlohy HMG proteínov otvorená a vyžaduje si ďalšie štúdium.

Topoizomeráza I a proteíny pevne viazané na DNA sú súčasťou transkripčne aktívneho chromatínu 1*. S. Elgin (USA), nasledovaný radom ďalších autorov, ukázal, že transkripčne aktívny chromatín obsahuje topoizomerázu I, enzým, ktorý uvoľňuje nadzávitnicovú DNA. Prvýkrát to bolo demonštrované na cytologických preparátoch polyténových chromozómov Drosophila pomocou fluorescenčných protilátok proti topoizomeráze I. Tento enzým zavádza jednovláknový zlom do DNA a kovalentne sa viaže na výsledný 5" koniec DNA. To umožňuje DNA voľne rotovať na miesto zlomu. Potom sa fragment odštiepi a obnoví sa fosfodiesterová väzba v DNA. Z hľadiska molekulovej hmotnosti je topoizomeráza I alebo skrátene topo I heterogénna. Najťažšia zložka má molekulovú hmotnosť 135 kDa a najbohatšie zastúpené - 80 kDa. Pri jeho štiepení proteinázami vznikajú kratšie polypeptidy, ktoré si napriek tomu zachovávajú enzymatickú aktivitu.

Antibiotikum kaptotecín je inhibítor topo I a keď sa ním bunky ošetria, enzým vytvorí kovalentné zosieťovanie s DNA v mieste, kde sa nachádzal v čase kontaktu s antibiotikom. Umiestnenie takýchto krížových väzieb možno ľahko určiť mapovaním pomocou hybridizačnej značky. Týmto spôsobom sa zistilo, že topo I je prítomný výlučne v transkribovaných oblastiach genómu, t.j. s najväčšou pravdepodobnosťou funguje v spolupráci s RNA polymerázou II, pričom odstraňuje lokálne zákruty DNA, ku ktorým dochádza počas transkripcie.

Ďalšou proteínovou zložkou zistenou v transkribovaných oblastiach genómu je súbor proteínov pevne viazaných na DNA (DBP), ktorý zodpovedá prepisovanej DNA bunky (pozri časť 3.4).

S. V. Razin a V. V. Černochvostov Urobil sa pokus podrobne charakterizovať komplexy DNA s PBP. Fragmenty DNA s dĺžkou 1 až 2 kb spojené s PBP sa purifikovali a podrobili sa rovnovážnej ultracentrifugácii v gradiente hustoty CsCl. Ich hustota vztlaku sa ukázala byť rovnaká 1,7 g/cm3 t.j. zodpovedalo nadnášajúcej hustote voľnej DNA neobsahujúcej žiadny proteín. V experimentoch navrhnutých na vysvetlenie tohto paradoxu sa zistilo, že liečba DRNázou vedie k zníženiu hustoty komplexov. 1,62-1,65 g/cm3. Približné výpočty založené na hustote bielkovín ( ~ 1,3 g/cm3) a RNA ( ~ 1,9 g/cm3), (ukazujú, že na každú molekulu DNA pripadá približne 150 kDa proteín a asi 200 nukleotidov RNA. Povaha tejto RNA je nejasná, ale boli získané dôkazy o jej homogenite a jedinečnej nukleotidovej sekvencii.

Veľa o komplexoch DNA-PBP teda zostáva záhadných, ale s najväčšou pravdepodobnosťou zohrávajú významnú úlohu v organizácii transkripčného mechanizmu. Ich výskum v súčasnosti prebieha.

Demetylácia DNA v transkribovaných génoch 2*. Ďalšou dôležitou vlastnosťou aktívneho chromatínu je demetylácia určitých úsekov DNA. V neaktívnych génoch je väčšina cytidylových zvyškov v sekvenciách CG metylovaná. najprv B.V. Vanyushin v laboratóriu A. N. Belozersky bolo preukázané, že DNA v rôznych tkanivách toho istého zvieraťa sa líši v úrovni metylácie C. Na základe toho sa predpokladalo, že metylácia môže mať regulačnú úlohu pri diferenciácii. Neskôr mnohí autori ukázali, že niektoré oblasti v transkribovanej DNA sú nedostatočne metylované. Najpoužívanejšou analytickou metódou je porovnanie reštrikčných máp získaných s reštrikčnými enzýmami, ktoré rozpoznávajú rovnakú sekvenciu, ako je CGCG alebo CCGG, ale majú odlišnú metylačnú citlivosť. Jeden z reštrikčných enzýmov štiepi metylované aj nemetylované sekvencie a druhý štiepi len nemetylované. Typicky sú nemetylované sekvencie lokalizované v regulačnej oblasti génu. Oblasť samotného génu, jeho kódujúca časť a intróny sú rovnako metylované v pracovných aj tichých génoch.

Keď sa do buniek zavedie metylovaná DNA, jej expresia v bunke sa výrazne zníži v porovnaní s nemetylovanou DNA. Boli získané údaje, podľa ktorých sa počas replikácie DNA reprodukuje stav metylácie DNA: ak je jeden z reťazcov metylovaný, potom sa na rovnakom mieste metyluje aj novovytvorený reťazec.

Kedysi sa zdalo, že metylácia-demetylácia cytidínu v CG sekvenciách regulačnej oblasti je hlavným mechanizmom génovej inaktivácie-aktivácie. Nedávno sa však objavilo množstvo údajov, ktoré sú v rozpore s touto hypotézou. Plne CG metylovaná SV40 DNA je teda aktívne exprimovaná. Zároveň sa metylcytozín v DNA Drosophila vôbec nezisťuje. Je možné, že demetylácia C je dôsledkom aktivácie génu a iba udržiava stav transkripčnej aktivity. Tu, rovnako ako v iných oblastiach štúdia aktivácie génov, sú potrebné nové experimenty.