クロマチン: 細胞分裂における定義、構造、役割。真核生物 DNA の 3 つの分画、染色体におけるそれらの局在と機能クロマチンの構造および機能成分

細胞核の主成分であるクロマチンは、単離された間期核および単離された有糸分裂染色体から非常に簡単に入手できます。これを行うために、イオン強度の低い水溶液または単なる脱イオン水での抽出中に溶解状態になる能力を利用します。この場合、クロマチンの部分が膨張してゲルに変わります。このような薬物を実際の溶液に変換するには、振盪、撹拌、さらなる均質化などの強い機械的影響が必要です。もちろん、これは元のクロマチン構造の部分的な破壊につながり、小さな断片に粉砕されますが、実際にはその化学組成は変わりません。

さまざまな物体から得られたクロマチン画分には、かなり均一な成分のセットが含まれています。間期核からのクロマチンと有糸分裂染色体の総化学組成は互いにほとんど変わらないことが判明した。クロマチンの主成分は DNA とタンパク質であり、その大部分はヒストンと非ヒストンタンパク質です (表 3 を参照)。

表 3.クロマチンの化学組成。タンパク質と RNA の含有量は DNA と比較して示されます

平均して、クロマチンの約 40% は DNA であり、約 60% は特定の核タンパク質を含むタンパク質です。 ヒストン、単離されたクロマチンを構成するすべてのタンパク質の 40 ～ 80% を構成します。さらに、クロマチン画分には、膜成分、RNA、炭水化物、脂質、糖タンパク質が含まれます。これらの微量成分がクロマチン構造にどの程度含まれているかという問題はまだ解決されていません。したがって、例えば、RNAは、DNA鋳型との結合をまだ失っていない転写されたRNAであってもよい。他の微量成分は、核膜の共沈断片に由来する物質である可能性があります。

構造的には、クロマチンはデオキシリボ核タンパク質（DNP）分子の繊維状複合体であり、ヒストンと結合したDNAから構成されています（図57を参照）。したがって、クロマチンの別の名前が定着しました - ヌクレオヒストン。非常に不安定で可変の核酸-ヒストン複合体が形成されるのは、ヒストンと DNA の結合によるもので、DNA:ヒストンの比はおよそ 1、つまり 1 です。それらは等しい重量量で存在します。これらの繊維状 DNP フィブリルは基本的な染色体またはクロマチンフィラメントであり、その厚さは DNA パッケージングの程度に応じて 10 ～ 30 nm の範囲になります。これらの DNP 原線維は、さらに圧縮されて、有糸分裂染色体に至るまで、より高いレベルの DNP 構造を形成することができます。一部の非ヒストンタンパク質の役割は、まさに高レベルのクロマチン圧縮の形成にあります。

DNAクロマチン

クロマチン調製物では、通常、DNA が 30 ～ 40% を占めます。この DNA は二本鎖らせん分子であり、水溶液中で純粋に単離された DNA と同様です。これは多くの実験データによって証明されています。したがって、クロマチン溶液を加熱すると、純粋な DNA が加熱 (融解) したときに起こる現象と同様に、DNA 鎖間のヌクレオチド間水素結合の切断に関連する、いわゆる濃色効果である溶液の光学密度の増加が観察されます。。

クロマチン内の DNA 分子のサイズと長さの問題は、染色体全体の構造を理解するために重要です。標準的な DNA 単離法を使用すると、クロマチンの分子量は 7 ～ 9 x 10 6 であり、大腸菌由来の DNA の分子量 (2.8 x 10 9) よりも大幅に小さくなります。クロマチン調製物から得られる DNA の分子量がこのように比較的低いことは、クロマチン単離プロセス中の DNA への機械的損傷によって説明できます。振盪、均質化、その他の影響を排除した条件下で DNA を単離すると、細胞から非常に長い DNA 分子を取得することが可能です。真核細胞の核および染色体からの DNA 分子の長さは、原核細胞で研究したのと同じように、光光学オートラジオグラフィー法を使用して研究できます。

染色体内では、(原核生物の染色体とは異なり) 個々の直鎖状 DNA 分子の長さが数百マイクロメートル、さらには数センチメートルに達する場合があることが発見されました。このように、さまざまな物体から 0.5 mm から 2 cm の DNA 分子が得られ、染色体あたりの DNA の長さの計算値とオートラジオグラフィー観察がよく一致していることがわかりました。

真核細胞を穏やかに溶解した後、物理化学的方法によって DNA の分子量を直接測定できます。ショウジョウバエの DNA 分子の最大分子量は 41 x 10 9 で、これは約 2 cm の長さに相当しますが、一部の酵母では染色体ごとに分子量 1 x 10 8 の DNA 分子が存在します。 -10 9、約 0.5 mm です。

このような長い DNA は単一の分子であり、一部の研究者が信じていたように、いくつかの短い分子がタンパク質結合を使って一列に縫い合わされたものではありません。この結論は、タンパク質分解酵素による薬剤の処理後に DNA 分子の長さが変化しないことが判明した後に達されました。

生物のゲノム内の細胞の核構造に含まれる DNA の総量は種によって異なりますが、微生物の細胞あたりの DNA 量は無脊椎動物、高等植物や動物よりも大幅に少ないです。したがって、マウスは 1 核あたり大腸菌のほぼ 600 倍の DNA を持っています。真核生物の細胞あたりの DNA 量を比較する場合、生物の複雑さの程度と核あたりの DNA 量との間に相関関係を確認することは困難です。亜麻、ウニ、スズキ (1.4 ～ 1.9 pg)、またはイワナやウシ (6.4 および 7 pg) などのさまざまな生物は、ほぼ同じ量の DNA を持っています。

大きな分類群では DNA の量に大きな変動があります。魚類の間で両生類の DNA 量が数十倍異なるのと同様に、高等植物の間では、種ごとに DNA の量が数百倍異なる場合があります。

一部の両生類は、その核内に人間の核よりも 10 ～ 30 倍多くの DNA を持っていますが、人間の遺伝的構成はカエルのそれとは比較にならないほど複雑です。したがって、下等に組織化された生物における「過剰な」量の DNA は遺伝的役割の遂行と関連していないか、または遺伝子の数が何度か繰り返されていると推測できます。

表4. いくつかの物体の細胞内の DNA 含有量 (pg、10 ～ 12 g)

再生または DNA ハイブリダイゼーションの反応速度論を研究することで、これらの問題を解決できることが判明しました。溶液中の断片化された DNA 分子を熱変性させ、変性が起こる温度よりわずかに低い温度でインキュベートすると、相補鎖の再結合、つまり再生によって DNA 断片の元の二本鎖構造が復元されます。 DNA ウイルスと原核細胞の場合、そのような再生速度はゲノムのサイズに直接依存することが示されました。ゲノムが大きくなるほど、粒子または細胞あたりの DNA の量が多くなり、相補鎖のランダムなアプローチと、ヌクレオチド配列が異なる多数の DNA 断片の特異的な再結合により多くの時間が必要になります (図 53)。原核生物細胞の DNA 再結合曲線の性質は、原核生物のゲノムに反復塩基配列が存在しないことを示しています。それらの DNA のすべてのセクションには独自の配列があり、その数と多様性はオブジェクトの遺伝的構成の複雑さの程度、したがってそれらの一般的な生物学的組織を反映しています。

真核生物では、DNA 再結合のまったく異なる状況が観察されます。彼らの DNA には、ゲノムのサイズに基づいて予想されるよりもはるかに高い速度で再生する部分と、原核生物の独特の DNA 配列のようにゆっくりと再生する DNA 部分が含まれていることが判明しました。しかし、真核生物はこの部分を再生するのにかなり長い時間を必要とし、これはゲノム全体のサイズが大きく、異なる固有の遺伝子が多数存在することに関連しています。

高い再生率を特徴とする真核生物 DNA の部分では、2 つのサブフラクションが区別されます。1) 高度にまたは頻繁に繰り返される配列を含むフラクション。類似の DNA セクションが 10 6 回繰り返される可能性があります。 2) ゲノム内で 10 2 ～ 10 3 回発生する中程度の反復配列の一部。したがって、マウスでは、頻繁に繰り返される配列を含む DNA の割合はゲノムあたりの DNA 総量の 10% を含み、中程度に繰り返される配列を含む割合は 15% を占めます。全マウス DNA の残り 75% は、多数の異なる非反復遺伝子に対応する固有の領域によって表されます。

高度に反復された配列を含む画分は、DNA バルクとは異なる浮力密度を持つ可能性があるため、いわゆる画分として純粋な形で単離できます。 衛星DNA。マウスでは、この画分の密度は 1.691 g/ml で、DNA の主要部分は 1.700 g/ml です。これらの密度の違いは、ヌクレオチド組成の違いによって決まります。たとえば、マウスでは、この画分に 35% の G および C ペアが存在し、メイン DNA ピークには 42% が存在します。

結局のところ、サテライト DNA、または頻繁に繰り返される配列を含む DNA の部分は、細胞内の主要な種類の RNA の合成には関与しておらず、タンパク質合成のプロセスにも関与していません。この結論は、どの細胞 RNA タイプ (tRNA、mRNA、rRNA) もサテライト DNA とハイブリダイズしないという事実に基づいて行われました。したがって、これらの DNA には、細胞の RNA の合成に関与する配列が含まれていません。サテライト DNA は RNA 合成の鋳型ではなく、転写にも関与しません。

タンパク質合成に直接関与しない高度な反復配列には、染色体の維持と機能において重要な構造的役割を果たす情報が含まれているのではないかという仮説があります。これらには、間期核のコアタンパク質に関連する DNA の多数のセクション (下記を参照)、複製または転写の起点の部位、およびこれらのプロセスを調節する DNA のセクションが含まれる場合があります。

核酸を染色体上で直接ハイブリダイゼーションする方法を使用する（ 現場で) この部分の局在性が研究されました。これを行うために、細菌酵素を使用して、単離されたサテライト DNA 上で 3H-ウリジンで標識された RNA が合成されました。次に、染色体を含む細胞標本に、DNA 変性が起こるような処理（高温、アルカリ環境など）を施します。この後、３Ｈ標識ＲＮＡをプレパラート上に置き、ＤＮＡとＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションを達成した。オートラジオグラフィーにより、標識の大部分が染色体の一次収縮のゾーン、セントロメア領域のゾーンに局在していることが明らかになりました。このマークは染色体の他の領域でも検出されましたが、非常に弱かったです (図 54)。

過去10年間で研究は大きく進歩しました 動原体 DNA特に酵母細胞において。そうします S.セレビシエセントロメア DNA は 110 bp の繰り返し領域から構成されます。これは、AT 塩基対が豊富な 2 つの保存領域 (I および III) と中心要素 (II) で構成されます。ショウジョウバエの染色体は、同様のセントロメア DNA 構造を持っています。ヒト動原体 DNA (アルフォイドサテライト DNA) は、二量体または五量体のグループに組織化された 170 bp の単量体のタンデムで構成され、これらが 1 ～ 6 x 10 3 bp の大きな配列を形成します。この最大単位は 100 ～ 1000 回繰り返されます。特別なセントロメアタンパク質は、この特定のセントロメア DNA と複合体を形成し、セントロメア DNA の形成に関与します。 動原体、染色体と紡錘体微小管との接続、および後期の染色体の移動を確実にする構造です (下記を参照)。

高度な反復配列を持つ DNA も見つかっています。 テロメア領域多くの真核生物 (酵母から人間まで) の染色体。ここではリピートが最も多く見られ、3 ～ 4 個のグアニンヌクレオチドが含まれます。ヒトでは、テロメアには 500 ～ 3000 個の TTAGGG リピートが含まれています。 DNA のこれらの部分は、染色体の末端を制限し、複製が繰り返される過程での短縮を防ぐという特別な役割を果たします。

最近、間期染色体の高度に反復的な DNA 配列が核膜の根底にあるラミンタンパク質に特異的に結合し、伸長した非凝縮間期染色体の固定に関与し、それによって間期核の体積における染色体の局在の順序を決定することが判明した。

サテライト DNA が減数分裂中の染色体の相同領域の認識に関与している可能性があることが示唆されています。他の仮定によれば、頻繁に繰り返される配列を持つ領域は、染色体 DNA のさまざまな機能単位の間、たとえばレプリコンの間のセパレーター (スペーサー) の役割を果たします (下記を参照)。

結局のところ、中程度に繰り返される (10 2 ～ 10 5 回) 配列の部分は、タンパク質合成装置を作成するプロセスで重要な役割を果たす多彩なクラスの DNA 領域に属しています。この画分にはリボソーム DNA 遺伝子が含まれており、異なる種で 100 ～ 1000 回繰り返すことができます。この画分には、すべての tRNA の合成のために何度も繰り返される領域が含まれています。さらに、特定のタンパク質の合成に関与する一部の構造遺伝子は、多数のコピーで表されるように何度も繰り返される場合もあります。これらはクロマチンタンパク質、つまりヒストンの遺伝子であり、最大 400 回繰り返されます。

さらに、この画分には、異なる配列 (それぞれ 100 ～ 400 ヌクレオチド対) を持つ DNA セクションが含まれており、これも何度も繰り返されていますが、ゲノム全体に分散しています。彼らの役割はまだ完全には明らかではありません。このような DNA セクションは、さまざまな遺伝子のアクセプター領域または調節領域を表す可能性があることが示唆されています。

したがって、真核細胞の DNA は組成が不均質であり、いくつかのクラスのヌクレオチド配列を含んでいます。頻繁に繰り返される配列 (> 10 6 回)、サテライト DNA 画分に含まれ、転写されません。真の遺伝子のブロックを表す中程度の反復配列の一部 (10 2 ～ 10 5)、およびゲノム全体に散在する短い配列。大部分の細胞タンパク質の情報を運ぶ固有の配列の一部。

これらの考えに基づいて、さまざまな生物で観察される DNA 量の違いが明らかになります。それらは、生物のゲノムにおける特定のクラスの DNA の不均等な割合に関連している可能性があります。たとえば、両生類では アンフィウマ（人間の20倍のDNAを持っています）反復配列は全DNAの最大80％を占め、タマネギでは最大70％、サケでは最大60％などです。遺伝情報の真の豊かさは、固有の配列の割合によって反映されるはずです。染色体のネイティブで断片化されていない DNA 分子では、中程度かつ頻繁に繰り返される固有の配列を含むすべての領域が単一の巨大な共有結合 DNA 鎖に結合していることを忘れてはなりません。

DNA 分子は、異なるヌクレオチド配列の領域において不均一であるだけでなく、その合成活性も異なります。

真核生物の DNA 複製

細菌の染色体は、1 つの複製開始点と 1 つの複製終了点を持つ 1 つの構造単位として複製します。したがって、細菌の環状 DNA は 1 つです レプリコン。複製は開始点から 2 つの反対方向に進行するため、DNA が合成されると、両側が複製フォークで囲まれた、いわゆる複製の目が形成されます。これは、ウイルスや細菌の複製染色体の電子顕微鏡検査ではっきりと見ることができます。。

真核細胞では、複製組織はポリレプリコンという異なる性質を持っており、すでに述べたように、3 HT をパルス的に組み込むと、ほぼすべての有糸分裂染色体に複数の標識が現れます。これは、間期染色体に多くの複製部位と多くの自律的複製起点が同時に存在することを意味します。この現象は、DNA から単離された標識分子のオートラジオグラフィーを使用してさらに詳細に研究されました (図 55)。細胞が 3 HT でパルス標識された場合、単離された DNA のサインの光学顕微鏡では、銀が還元された領域が確認できます。点線の形で。これらは複製に成功した DNA の小さな部分であり、それらの間にはオートラジオグラフに残らなかったため、見えないままになっている複製されていない DNA の部分があります。 3 NT と細胞の接触時間が増加するにつれて、そのようなセグメントのサイズは増加し、それらの間の距離は減少します。これらの実験から、真核生物における DNA 複製速度を正確に計算できます。複製フォークの移動速度は 1 ～ 3 kb であることが判明しました。哺乳類では 1 分あたり約 1 kb。これは、細菌の DNA 複製速度 (1 分あたり 50 kb) よりもはるかに低いです。同じ実験で、真核生物の染色体の DNA のポリレプリコン構造が直接証明されました。染色体 DNA の長さに沿って、それに沿って多くの独立した複製部位、つまりレプリコンが存在します。隣接するタグ付けレプリコンの中点間の距離に従って、すなわち、 2 つの隣接する複製開始点間の距離に基づいて、個々のレプリコンのサイズを決定できます。平均して、高等動物のレプリコンサイズは約 30 μm または 100 kb です。したがって、哺乳類の半数体セットには 20,000 ～ 30,000 個のレプリコンが存在するはずです。下等真核生物では、レプリコンはより小さく、約 40 kb です。したがって、ショウジョウバエではゲノムあたり 3500 個のレプリコンが存在し、酵母では 400 個のレプリコンが存在します。前述したように、レプリコンでの DNA 合成は 2 つの反対方向で行われます。これはオートラジオグラフィーによって簡単に証明できます。パルス標識後、細胞が 3 HT を含まない培地中でしばらく DNA 合成を継続すると、DNA への細胞の包含が減少し、標識の希釈が起こり、オートラジオグラフでは、複製された領域の両側に対称的なパターンが見られ、還元された銀の粒子の数が減少します。

レプリコン内の複製端またはフォークは、隣接するレプリコンのフォークと出会うと (隣接するレプリコンに共通の終点で) 移動を停止します。この時点で、隣接するレプリコンの複製された部分が結合されて、新たに合成された 2 つの DNA 分子の単一の共有結合鎖になります。染色体 DNA のレプリコンへの機能的分割は、DNA のドメインまたはループへの構造的分割と一致しており、すでに述べたように、その塩基はタンパク質結合によって結合されています。

したがって、単一の染色体上のすべての DNA 合成は、多くの個々のレプリコンでの独立した合成を通じて行われ、その後、隣接する DNA セグメントの末端が結合されます。この特性の生物学的意味は、細菌と真核生物の DNA 合成を比較すると明らかになります。したがって、長さ 1600 ミクロンの細菌のモノレプリコン染色体は、約 30 分の速度で合成されます。哺乳類の染色体のセンチメートル長の DNA 分子もモノレプリコン構造として複製される場合、約 1 週間 (6 日) かかります。しかし、そのような染色体に数百のレプリコンが含まれている場合、その完全な複製にはわずか 1 時間程度しかかかりません。実際、哺乳類の DNA 複製時間は 6 ～ 8 時間です。これは、個々の染色体のすべてのレプリコンが同時にオンになるわけではないという事実によるものです。

場合によっては、すべてのレプリコンが同時に含まれたり、追加の複製起点が出現したりすることが観察され、これによりすべての染色体の合成を最小限の短時間で完了することが可能になります。この現象は、一部の動物の胚発生の初期に発生します。ツメガエルの卵を砕くと、 アフリカツメガエル レイビス DNA 合成にはわずか 20 分しかかかりませんが、体細胞培養ではこのプロセスが約 1 日続きます。同様の状況がショウジョウバエでも観察されます。初期胚段階では、核内での DNA 合成全体に 3.5 分かかりますが、組織培養細胞では 600 分かかります。同時に、培養細胞内のレプリコンのサイズは、胚内のレプリコンのサイズよりもほぼ 5 倍大きいことが判明しました。

DNA 合成は、個々の染色体の長さに沿って不均一に発生します。個々の染色体では、活性レプリコンがグループ、つまり複製単位に組み立てられており、これには 20 ～ 80 の複製起点が含まれることがわかりました。これは、まさに複製セグメントの遮断が観察された DNA オートグラフの分析から得られたものです。レプリコンまたは複製単位のブロックまたはクラスターが存在するという考えのもう 1 つの根拠は、チミジン類似体である 5'-ブロモデオキシウリジン (BrdU) を DNA に組み込む実験でした。間期クロマチンに BrdU が含まれると、有糸分裂中に、BrdU を含む領域の凝縮がチミジンが含まれる領域よりも少ない程度 (不十分な凝縮) になるという事実が生じます。したがって、BrdU が含まれる有糸分裂染色体の領域は、分別染色中に弱く染色されます。これにより、同期した細胞培養を使用して BrdU 取り込みの順序を決定することが可能になります。 1 本の染色体の長さに沿った DNA 合成の順序。染色体の大きな部分に前駆体が含まれることが判明しました。異なるセクションの組み込みは、S 期間中に厳密に順次に発生します。各染色体は、その長さに沿った複製順序の高い安定性を特徴とし、独自の特定の複製パターンを持っています。

複製ユニットに結合されたレプリコンのクラスターは、核マトリックスタンパク質（以下を参照）と会合しており、核マトリックスタンパク質は複製酵素とともに、いわゆるタンパク質を形成します。クラスターソームは、DNA 合成が起こる間期核内のゾーンです。

複製ユニットが活性化される順序は、おそらくこれらの領域のクロマチン構造によって決定される可能性があります。たとえば、構成的ヘテロクロマチンのゾーン（セントロメア近く）は通常、S 期の終わりに複製され、また、S 期の終わりには、通性ヘテロクロマチンの一部が二重になります（たとえば、女性の X 染色体）哺乳類）。染色体セクションの複製の順序は、染色体の異なる色のパターンと特に明確に相関しています。R セグメントは初期複製セグメントに属し、G セグメントは後期複製の染色体セクションに対応します。 C セグメント (セントロメア) は、最新の複製部位です。

異なる染色体では、色の異なるセグメントの異なるグループのサイズと数が異なるため、これにより、異なる染色体の複製の非同期の開始と終了の全体像が作成されます。いずれの場合も、セット内の個々の染色体の複製の開始と終了の順序はランダムではありません。セット内の他の染色体と比較して、染色体の複製には厳密な順序があります。

個々の染色体の複製プロセスの期間は、染色体のサイズに直接依存しません。したがって、グループ A (1 ～ 3) の大きなヒト染色体は、グループ B (4 ～ 5) の短い染色体と同様に、S 期間全体を通して標識されます。

したがって、真核生物のゲノムにおける DNA 合成は、S 期の開始時に核のすべての染色体上でほぼ同時に始まります。しかし同時に、異なるレプリコンの連続的かつ非同期的な組み込みが、染色体の異なる部分と異なる染色体の両方で発生します。特定のゲノム領域の複製配列は遺伝的に厳密に決定されています。この最後のステートメントは、S 期のさまざまなセグメントに標識が含まれるパターンだけでなく、S 期における変異原に対する特定の遺伝子の感受性のピークの出現には厳密な順序があるという事実によっても証明されています。 -期間。

1. クロマチンの種類

2. 遺伝子、スペーサー

3. DNA のヌクレオチドの配列

4. DNAの空間構成

1. 分裂行為の間の休止中、染色体の特定の部分と染色体全体はコンパクトなままです。クロマチンのこれらの領域はと呼ばれます ヘテロクロマチン。 良く塗れます。

核分裂後、クロマチンは緩み、この形態ではクロマチンと呼ばれます。 ユークロマチン。 ヘテロクロマチンは転写に関しては不活性であり、DNA 複製に関してはユークロマチンとは異なる動作をします。

通性ヘテロクロマチン時々だけ異色性があります。これには情報が含まれています。つまり、遺伝子が含まれています。ユークロマティック状態に入ると、これらの遺伝子が転写に利用できるようになる可能性があります。 2 つの相同染色体のうち、1 つは異色性である可能性があります。この条件的ヘテロクロマ化は組織特異的であり、特定の組織では発生しません。

構成的ヘテロクロマチン常に異色性。それは繰り返し繰り返される塩基配列からなり、情報を含まない（遺伝子を含まない）ため、転写に関して常に不活性です。あなたには彼が見えます そして核分裂中。 彼は付き合っています:

ほとんどの場合セントロメアで発生します。

染色体の末端（サテライトを含む）。

核小体の主催者の近く。

5S-RNA 遺伝子の近く。

ヘテロクロマチンは主に通性で、間期中に結合して強く染色された色中心になることがあり、これはほとんどの場合、細胞核または核小体の端に位置します。

2. それぞれの染色体は DNAの連続二重らせん、高等生物では 10 8 塩基対以上で構成されます。高等動植物の染色体では、DNA二重らせん（直径2nm）の長さは1～数センチメートルです。ねじれを繰り返すことにより、長さ数マイクロメートルの染色分体に詰め込まれます。

遺伝子はこの二重らせんに沿って直線的に分布しており、合わせて DNA の最大 25% を構成します。

遺伝子DNAの機能単位であり、ポリペプチドまたは RNA の合成に関する情報が含まれています。平均的な遺伝子の長さは約 1000 塩基対です。各遺伝子の塩基配列はユニークです。

遺伝子の間には、 スペーサー- 有益ではないさまざまな長さの DNA ストレッチ (場合によっては 20,000 塩基対以上)。これは、隣接する遺伝子の転写を制御するために重要です。

転写されたスペーサー遺伝子とともに転写中に終結し、その相補的なコピーが遺伝子コピーの両側の pre-i-RNA に現れます。遺伝子自体の中にさえ（真核生物とそのウイルスにのみ）非情報配列、いわゆるイントロンがあり、これも転写されます。処理中に、イントロンのすべてのコピーとスペーサーのほとんどのコピーが酵素によって切除されます。

非転写性スペーサーヒストンの場合は遺伝子間で、rRNA の場合は遺伝子間で発生します。

重複遺伝子多数 (最大 10 4 以上) の同一コピーで表されます。 これは遺伝子です:

tRNAの場合;

5S-RNA とヒストン。

大量に合成された製品の場合。

コピーは互いに直接隣接して配置され、同一のスペーサーによって解決されます。ウニでは、ヒストンH4、H2b、H2a、Hiの遺伝子が順番に並んでおり、この遺伝子配列はDNA内で100回以上繰り返されています。

3. シーケンスの繰り返し - これらは、DNA 内に複数回存在するヌクレオチドの配列です。 中程度の繰り返し配列 - 平均長が 300 塩基対で、繰り返しが 10 2 ～ 10 4 の配列。これらには、ほとんどのスペーサーだけでなく、冗長な遺伝子も含まれます。

反復性が高い 10 5 ～10 6 回の繰り返しを持つ配列は構成的ヘテロクロマチンを形成します。彼らは いつも情報不足。これらはほとんどが短い配列であり、ほとんどの場合 7 ～ 10 個が見つかりますが、まれに 2 個だけ (AT など)、あるいは逆に 300 個を超えるヌクレオチド対が見つかることもあります。それらは互いに集まり、1 つの繰り返しシーケンスがもう 1 つの繰り返しシーケンスの直後に続きます。反復性の高いクロマチン DNA は、分析分画手順中の挙動から「サテライト DNA」と呼ばれます。全クロマチンの約 75% は転写に関与していません。これらは反復性の高い配列と転写不可能なスペーサーです。

4. 単離されたクロマチン内 DNA 二重らせんの一部がヒストン分子の周りを包み込むため、ここに一次超らせんが現れます。 DNAとヒストンの複合体は、 ヌクレオソーム。 それらは円盤またはレンズの形状をしており、寸法は約 10 x 10 x 5 nm です。 1つのヌクレオソーム含まれています:

8分子 ヒストン:

2 つの H3 分子と 2 つの H4 分子からなる中央四量体。そして別々に2つのH 2a とH 2 b。

約 1.25 回転のらせんを形成し、中央の四量体にしっかりと結合している DNA のセクション (約 140 塩基対)。

ヌクレオソーム間には、超らせん構造を持たない 30 ～ 100 塩基対のらせん部分があります。ヒストンはここに結合しますこんにちは。

縫い合わされたクロマチン内 DNA は、ほとんど理解されていないさらなるコイル巻き (高次スーパーコイル) によってさらに短縮され、明らかにヒストン Hi (およびいくつかの非ヒストンタンパク質) によって固定されています。間期への移行中、高次のスーパーコイルの一部がほどけるにつれてユークロマチンが緩みます。これはおそらくヒストンの構造変化と Hi 分子間の相互作用の弱化の結果として起こり、間期には厚さ 10 ～ 25 nm のクロマチン構造 (クロマチンの主要な糸またはヘリックス) も観察されます。

1. クロマチンの種類

2. 遺伝子、スペーサー

3. DNA のヌクレオチドの配列

4. DNAの空間構成

ほとんどの場合セントロメアで発生します。

染色体の末端（サテライトを含む）。

核小体の主催者の近く。

5S-RNA 遺伝子の近く。

遺伝子はこの二重らせんに沿って直線的に分布しており、合わせて DNA の最大 25% を構成します。

非転写性スペーサーヒストンの場合は遺伝子間で、rRNA の場合は遺伝子間で発生します。

重複遺伝子多数 (最大 10 4 以上) の同一コピーで表されます。 これは遺伝子です:

tRNAの場合;

5S-RNA とヒストン。

大量に合成された製品の場合。

8分子 ヒストン:

2 つの H3 分子と 2 つの H4 分子からなる中央四量体。そして別々に2つのH 2a とH 2 b。

約 1.25 回転のらせんを形成し、中央の四量体にしっかりと結合している DNA のセクション (約 140 塩基対)。

ヌクレオソーム間には、超らせん構造を持たない 30 ～ 100 塩基対のらせん部分があります。ヒストンはここに結合しますこんにちは。

転写活性があるクロマチン - 合成を通じて情報を伝達する遺伝子 RNA、さらに意気消沈した結果、さらに緩みます。いくつかのデータによると、DNA ヘリックスの対応する部分では、ヒストン Hi が存在しないか、リン酸化などの化学変化が生じています。

ヌクレオソーム構造また、（核小体のr-RNAの遺伝子において）変化するか、完全に破壊されます。二重らせんは特定の場所でほどけます。これらのプロセスには、明らかに、DNA の転写領域に蓄積する特定の非ヒストンタンパク質が関与しています。

質問38. 染色体のセット

/。ゲノム。細胞の倍数性

2. 多糸染色体

1. 各細胞核の遺伝情報の全体 - ゲノム- 特定の一定数の染色体 (n) に分散されます。この数は各種または亜種に固有です。馬回虫では 1、トウモロコシでは 10、人間では 23、藻類では 23 ネトリウム・ディジトゥス -約600。 同じ染色体セットでも異なる染色体以下の基準に従って:

サイズ;

測色計の写真。

くびれの位置。

状況に応じて、 染色体セットの多重度 - 倍数性- 細胞が分裂する:

一倍体に。

二倍体。

倍数体。

一倍体単一セットの染色体 (「」) を含む細胞は、たとえば、性細胞と呼ばれます。

細胞に二重セットの染色体 (2 P) が含まれている場合、 二倍体、遺伝情報が 2 回表現されているためです。高等植物および動物のほとんどすべての体細胞は二倍体です。それらには、父方と母方の染色体セットが 1 つずつ含まれています。

で 倍数体細胞はいくつかの染色体セット (4 P、8 P、16 P など) を持っています。これらの細胞は、哺乳類の多くの肝細胞のように、特に代謝活性が高いことがよくあります。

半数体細胞は減数分裂の結果として二倍体細胞から形成され、二倍体細胞は受精の結果として半数体細胞から形成されます。

倍数体細胞は、核内分裂（早期に中断された核分裂）を介して二倍体細胞から生じます。染色分体の完全な複製と分離の後、娘染色体は 2 つの核に分散されるのではなく、1 つの細胞核に残ります。このプロセスは何度も繰り返すことができます。

異常生殖細胞の形成中に、生物全体の倍数性が引き起こされる可能性があります。で 不完全な複製ヘテロクロマチンなどのゲノムの一部の部分は、倍数体になる他の部分とは対照的に、子宮内膜症後も複製せず、二倍体のままです。

遺伝子増幅 -これは、特定の遺伝子のみが複製されて倍数体 (核小体の rRNA の遺伝子) になる場合の多重超複製です。

染色体 二倍体核 2 つの相同染色体をペアとしてグループ化できます。それらのほとんど（いわゆる、 常染色体)ペアごとに同一です。個人の性別を決定する性染色体は、男性では同じではない 2 つのみです。これらは X 染色体と Y 染色体です。 (ヘテロ染色体)。 Y染色体のほとんどは構成的ヘテロクロマチンによって占められています。女性はX染色体を2本持っています。しかし、蝶、鳥、その他多くの動物では状況が逆で、オスは XX セットを持ち、メスは XY セットを持ちます。

2. 多糸染色体(巨大な染色体)通常のものよりも何倍ものDNAが含まれています。それらは分裂サイクルを通してその形状を変えることはなく、長さは最大 0.5 mm、厚さは 25 ミクロンに達します。それらは、例えば双翅目（ハエや蚊）の唾液腺、繊毛虫の大核、インゲン豆の卵巣組織などに存在します。相同染色体は密接に対になっているため、ほとんどの場合、それらは半数体の数で表示されます。 ポリテニアエンドレプリケーションの結果として起こります。子宮内膜症と比較して、これはさらに減少した分裂プロセスです。複製後、染色分体は分離されません（このプロセスは何度も繰り返されます）。その中で さまざまな DNA が掛け合わされる程度は様々ですが:

セントロメア領域 - 重要ではありません。

最も有益な領域は約 1000 回です。

場合によっては30,000回以上。

それが理由です 多糸染色体完全に分離されていない無数の染色分体の束です。染色分体は引き伸ばされ、相同染色体は染色体に沿って密接に位置する暗い円盤を形成します。これらのディスクは明るいストライプで区切られています。おそらく、染色分体上では、スペーサーに加えて、1つのディスクと1つの中間ストライプが形成され、1つの遺伝子（まれに複数の遺伝子）がディスク内に位置していると思われます。多糸染色体はヘテロクロマチンが非常に少ないです。

多糸染色体について 個別のディスク時々膨らみます プーフ（バルビアーニリング）。そこでは、相同染色分体が互いに分離し、相同染色体が離れて、転写活性のあるクロマチンの緩い構造が現れます。パフにはディスクよりもヒストン Hi が少なく、その代わりに酵素 RNA ポリメラーゼ (RNA 合成を示す) が含まれています。中間バンドにもヒストン Hi はほとんどありませんが、RNA ポリメラーゼが存在し、おそらく少なくとも少量の合成が発生します。 RNA。

クロマチン調製物では、通常、DNA が 30 ～ 40% を占めます。この DNA は二本鎖のらせん分子です。クロマチン DNA の分子量は 7 ～ 9*10 6 です。調製物からの DNA の質量がこのように比較的小さいことは、クロマチン単離のプロセス中の DNA への機械的損傷によって説明できます。

生物のゲノムに含まれる細胞の核構造に含まれる DNA の総量は、種によって異なります。真核生物の細胞あたりの DNA 量を比較する場合、生物の複雑さの程度と核あたりの DNA 量との間に相関関係を確認することは困難です。亜麻、ウニ、スズキ (1.4 ～ 1.9 pg)、またはイワナやウシ (6.4 および 7 pg) などのさまざまな生物は、ほぼ同じ量の DNA を持っています。

一部の両生類は、その核内に人間の核よりも 10 ～ 30 倍多くの DNA を持っていますが、人間の遺伝的構成はカエルのそれとは比較にならないほど複雑です。したがって、下等に組織化された生物における「過剰な」量の DNA は遺伝的役割の遂行に関連していないか、または遺伝子の数が何度か繰り返されていると推測できます。

サテライト DNA、または頻繁に繰り返される配列を含む DNA 部分は、減数分裂中の染色体の相同領域の認識に関与している可能性があります。他の仮定によれば、これらの領域は染色体 DNA のさまざまな機能単位間のセパレーター (スペーサー) の役割を果たします。

結局のところ、中程度に繰り返される (10 2 ～ 10 5 回) 配列の一部は、代謝プロセスで重要な役割を果たす多彩なクラスの DNA 領域に属しています。この画分にはリボソーム DNA 遺伝子が含まれており、すべての tRNA を合成するために繰り返されるセクションです。さらに、特定のタンパク質の合成に関与する一部の構造遺伝子も何度も繰り返すことができ、多くのコピーで表されます（クロマチンタンパク質の遺伝子 - ヒストン）。

したがって、真核細胞の DNA は組成が不均一であり、いくつかのクラスのヌクレオチド配列を含んでいます。

サテライト DNA 画分に含まれるが転写されない、頻繁に繰り返される配列 (>10 6 回)。

真の遺伝子のブロックを表す中程度の反復配列の一部 (10 2 ～ 10 5)、およびゲノム全体に散在する短い配列。

大部分の細胞タンパク質の情報を運ぶ固有の配列の一部。

原核生物の DNA は 1 つの巨大な環状分子です。真核生物の染色体の DNA は、タンデムに (次々に) 配置された異なるサイズのレプリコンからなる線状分子です。平均的なレプリコンのサイズは約 30 ミクロンです。したがって、ヒトゲノムには、独立した単位として合成される DNA セクションであるレプリコンが 50,000 個以上含まれているはずです。これらのレプリコンには、DNA 合成の開始点と終点があります。

真核細胞では、細菌と同様に、各染色体 DNA が 1 つのレプリコンであると想像してみましょう。この場合、毎分 0.5 ミクロンの合成速度 (人間の場合) では、DNA 長さ約 7 cm の最初の染色体の複製には 140,000 分、つまり約 3 か月かかるはずです。実際、DNA 分子のポリレプリコン構造により、プロセス全体には 7 ～ 12 時間かかります。

転写活性のあるクロマチンからのヒストン H1 の除去 1*2* 。 J. Bonner (米国) による初期の実験では、クロマチン内の DNA は遊離 DNA よりもはるかに悪いマトリックスであることが示されました。これらの観察に基づいて、ヒストンは転写抑制因子であることが提案されています。

L.N.アナニーワとユウ.V.コズロフ私たちの研究室は、すべてのヒストンが抑制効果を持っているのか、それとも一部のヒストンだけが抑制効果を持っているのかを調べることにしました。これを行うために、徐々に濃度を上げた NaCl 溶液で抽出することにより、マウスエールリッヒ腹水癌細胞のクロマチンからヒストンを除去しました。得られた調製物は、RNA合成のテンプレートとして機能しました。転写は、過剰に採取した大腸菌、大腸菌由来のRNAポリメラーゼ、およびヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下で実施した。 0.4 ～ 0.6 M NaCl の範囲では、材料の急激な脱凝縮が起こり、核ゲルの膨張、さらには DNP の溶解 (さらに機械的処理が行われた場合) として現れました。これはヒストン HI を選択的に除去することが示されました。クロマチンの脱凝縮と同時に、そのマトリックス活性が急激に増加した(図26)。抽出溶液中の塩濃度がさらに増加すると、他のヒストンが除去され、それほど顕著ではありませんが、マトリックスの活性がさらに増加しました。

0トン。したがって、ハイブリダイゼーション可能性は、合成された RNA 内の反復配列のパーセンテージを明らかにします (L. N. Ananyeva、Yu. V. Kozlov および著者によって得られた結果による)。 b - さまざまなマトリックスでの RNA 合成の主なパラメーター: 遊離 DNA、元のクロマチン (DNP 0)、および 0.6 M NaCl での抽出によってヒストン H1 が除去されたクロマチン (DNP 0.6)。 RNA合成は、標識ヌクレオシド三リン酸：[ 14 C]-ATPおよび[γ- 32 P]-ATPまたは[γ- 32 P]-GTPの存在下で大腸菌RNAポリメラーゼを使用して実施した。 [ 14 C]-UMP は RNA 全体に含まれ、[γ- 32 P] - は鎖の先頭にのみ含まれていました (pp x A- または pp x G)。言い換えれば、[ 32 P]を含めることで合成の開始に関する情報、および[ 14 C] - RNA合成自体に関する情報が提供されました。いくつかの実験では、インキュベーションの開始から3〜4分後に、抗生物質であるリファンピシンが培地に添加されました。これは、新しいRNA鎖の開始を妨げましたが、すでに始まっていた合成、つまり伸長には影響を与えませんでした。 1 - [14 C] - UMP の含有、2 - リファンピシン添加後も同様。 3 - [γ- 32 P]-ATP + GTP を含む。 4 - リファンピシンを加えた後も同じ。これらの封入曲線に基づいて、RNA ポリメラーゼ反応の主なパラメーターを計算することができます (Yu. V. Kozlov と著者によって得られた結果に基づく)">
米。 26. クロマチンにおけるDNAの鋳型活性に対するヒストンH1の影響。 a - 大腸菌の外因性 RNA ポリメラーゼの存在下でのクロマチンのマトリックス活性 (2) および合成された RNA のハイブリダイゼーション能力 (3) に対するクロマチンからのタンパク質の除去 (1) の影響。ヒストンおよび非ヒストンタンパク質は、NaCl 溶液の濃度を増加させて抽出されました。 0.4 M NaCl ～ 0.6 M NaCl の範囲では、ヒストン H1 が選択的に除去されました。合成されたRNAは、中間のC0t値で過剰なDNAとハイブリダイズした。したがって、ハイブリダイゼーション可能性は、合成された RNA 内の反復配列のパーセンテージを明らかにします (L. N. Ananyeva、Yu. V. Kozlov および著者によって得られた結果による)。 b - さまざまなマトリックスでの RNA 合成の主なパラメーター: 遊離 DNA、元のクロマチン (DNP 0)、および 0.6 M NaCl での抽出によってヒストン H1 が除去されたクロマチン (DNP 0.6)。 RNA合成は、標識ヌクレオシド三リン酸：[ 14 C]-UTPおよび[γ- 32 P]-ATPまたは[γ- 32 P]-GTPの存在下で大腸菌RNAポリメラーゼを使用して実施した。 [ 14 C]-UMP は RNA 全体に含まれ、[γ- 32 P] - は鎖の先頭にのみ含まれていました (pp x A- または pp x G)。言い換えれば、[ 32 P]を含めることで合成の開始に関する情報、および[ 14 C] - RNA合成自体に関する情報が提供されました。いくつかの実験では、インキュベーションの開始から3〜4分後に、抗生物質であるリファンピシンが培地に添加されました。これは、新しいRNA鎖の開始を妨げましたが、すでに始まっていた合成、つまり伸長には影響を与えませんでした。 1 - [14 C] - UMP の含有、2 - リファンピシン添加後も同様。 3 - [γ- 32 P]-ATP + GTP を含む。 4 - リファンピシンを加えた後も同じ。これらの封入曲線に基づいて、RNA ポリメラーゼ反応の主要パラメーターを計算できます (Yu. V. Kozlov と著者によって得られた結果に基づいて)

合成されたものの特性 試験管内で全マウス DNA とのハイブリダイゼーションによる RNA。この場合、反復する DNA 配列上で合成された RNA の一部が検出されました。クロマチンでは、繰り返される DNA 配列の転写が制限されていることが判明しました。しかし、0.6 M NaClでクロマチンを抽出した後、ヒストンH1を除去すると、そのようなクロマチンのマトリックス上と遊離DNAのマトリックス上で合成されたRNAのハイブリダイゼーション特性は区別できなくなった。私たちは、ヒストン H2a、H2b、H3、および H4 (当時は別名で呼ばれていました - 中程度にリジンが豊富なヒストンとアルギニンが豊富なヒストン) は転写抑制には関与しておらず、クロマチン組織化において純粋に構造的な役割を果たしているのに対し、ヒストン H1 (古いヒストンでは、用語ヒストン (リジンが豊富) は RNA 合成の阻害剤です。同時に、クロマチン凝縮を引き起こす要因でもあります (上記参照)。

その後、Yu. V. Kozlov は、大腸菌から単離された RNA ポリメラーゼを用いた無細胞系で、ヒストン H1 による転写阻害のメカニズムを研究しました。開始および伸長のプロセスに対するヒストンH1の影響を研究した(図26、表4を参照)。天然のクロマチンマトリックス上で開始される RNA 鎖の数が数倍減少することが判明しました。伸長は特に急激に阻害されます。RNA ポリメラーゼは 100 ～ 150 bp しか読み取りません。 DNA が停止します。一方、ヒストンH1が除去されたクロマチンでは、RNAポリメラーゼが一度に数千塩基対を読み取り、その鎖の長さは遊離DNA鋳型上で合成された鎖の長さと変わらない。確かに、遊離 DNA では、ヒストン H1 が除去されたクロマチンと比較して、RNA 合成の開始プロセスがより効率的に起こります。ヒストン H1 はクロマチンを凝縮することによって RNA ポリメラーゼの経路に障害物を作り、それによって RNA 合成を停止すると結論づけられました。

* (DNPM は、尿素処理によって単離された DNP であり、完全に可溶化されていますが、ヒストン H1 は保持されています。)

ヒストン H1 の存在に依存する 300 A-DNP 原線維のソレノイド構造に関する最新のデータを考慮すると、この結果は簡単に説明されます。実際、RNA ポリメラーゼはソレノイド内で 100 bp を超える情報を読み取ることができないのは明らかです。純粋にトポロジ上の制限によるものです。

私たちの仮説によれば、遺伝子が活性化されるとヒストン H1 が除去されるはずです。しかし、その時点ではそれを確認することはできませんでした。遺伝子活性化中にクロマチンからヒストン H1 が失われるという証拠が明らかになったのは比較的最近になってからです。したがって、クロマチンの活発に転写される領域、たとえばミニ核小体が多くの生物から単離された場合、それらの中でヒストン H1 は検出されませんでした。すべての遺伝子が潜在的に活性である酵母にも見つかりません。

実験室で納得のいく結果が得られた A.D.ミルザベコワ V.L.カルポフとO.V.プレオブラジェンスカヤ。彼らは「ヒストンシャドウハイブリダイゼーション」と呼ばれる手法を開発した。これを行うために、平均して長さ約 200 ～ 300 bp の DNA セグメントごとに 1 つのヒストン分子が架橋される条件下で、硫酸ジメチルを使用して DNA をヒストンで架橋しました。次いで、ＤＮＡを断片化し、二次元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。第一の方向に走った後、DNA に結合したヒストンはプロテイナーゼによって破壊され、すでに遊離していた DNA は第二の方向に加速されました。電気泳動の最初のラウンドでは、さまざまなヒストンがさまざまな方法で DNA 断片の動きを遅くしたため、2 回目の電気泳動後にいくつかの対角線が明らかになりました (図 27)。通常、3 つがはっきりと見えます。1 つは最初に遊離していた DNA に対応し、もう 1 つはコアヒストンとの元の DNA 複合体に対応し、3 つ目 (下) はヒストン H1 との元の DNA 複合体に対応します。得られた DNA はフィルターに移され、特定のサンプルとハイブリダイズされます。ゲノムの不活性領域、たとえばショウジョウバエのリボソーム遺伝子のスペーサーがハイブリダイゼーションに使用された場合、ラベルはすべての対角線に関連付けられます。しかし、クロマチンが単離された細胞内で転写された熱ショック遺伝子をサンプルとして使用した場合、ヒストンH1とのDNA複合体に対応する対角線とのハイブリダイゼーションは急激に弱まるか、完全に消失する。言い換えれば、核内では、転写された遺伝子の DNA は、結合する前はヒストン H1 と接触していません。

米。 27. 転写活性化時のヒストンH1およびコアヒストンの喪失。実験は、25° (a) および熱ショック (b) の培養条件下で D. melanogaster 培養細胞 (a、b) に対して実行されました。ケースaではヒートショック遺伝子の発現は見られませんが、ケースbでは非常に活性化されています。さらに、脱絨毛処理された胚（c）に対して実験が行われましたが、熱ショック遺伝子の発現は平均的なレベルでした。 DNA-タンパク質複合体の形成、DNA フラグメントの単離、それらの二次元分離 (タンパク質除去後の垂直方向)、およびフィルターへの移し後、同じフィルターを異なるサンプルとハイブリダイズさせました。 p70 熱ショック遺伝子 (HS-5") ; 同じ遺伝子のコード領域 (TS コード) ; rDNA 遺伝子 (不活性) への転写的に不活性な挿入のサンプルを含む。不活性な遺伝子には 3 つの対角線が見られます。 ; 1 - 遊離 DNA、2 - 八量体ヒストンとの DNA 複合体; 3 - ヒストン H1 との DNA 複合体クロマチン活性化による DNA-ヒストン複合体の弱体化または消失が目に見えます (A. D. Mirzabekov らによって得られた結果による)。

現在入手可能なすべてのデータは、個別に解釈すると他の解釈が可能ですが、総合すると、活性クロマチンからのヒストン H1 の除去を支持する強力な証拠となります。しかし、このプロセスのメカニズムはまだ完全に不明です。

クロマチン活性化中のヌクレオソームの運命 2* [ 154-157]。ヌクレオソームの核を形成するヒストン H2a、H2b、H3、および H4 の運命の問題は、それほど明確ではありません。上記の実験では ユウ・V・コズロワそれらの存在は、RNA ポリメラーゼによる DNA の転写には実質的に影響を与えませんでした。 大腸菌。真核生物のクロマチン加水分解産物を研究する際、多くの著者は、ヌクレオソームには活性遺伝子の DNA が含まれていること、つまり後者もヌクレオソームに組織化されていることを発見しました。大規模な実験材料から得られたデータ A.D.ミルザベコワ他。活発に転写される DNA を含むヌクレオソームは、その中の DNA-ヒストン接触の一部が変化しているものの、基本的には不活性 DNA を含むヌクレオソームと同じように構築されることを示しています。

前のセクションで説明したヒストンシャドウとのハイブリダイゼーションに関する実験も実施しました（図27を参照）。斜線が付いた標本は、熱ショック遺伝子がまったく機能しないか、つまりオフになっているか、低レベルで機能しているか、または最終的に熱ショックによって刺激されて転写が活発になっているショウジョウバエ細胞から調製されました。すべての場合において、対照サンプルは、コアヒストンとのDNA複合体に由来する対角線を含む、3つの対角線すべてでハイブリダイズするリボソーム遺伝子スペーサーのDNAでした。

熱ショック遺伝子も、転写されなかった細胞からのこの対角線と正常にハイブリダイズしました。しかし、熱ショック遺伝子の転写が中程度である細胞から得られた材料では、第 2 対角線のハイブリダイゼーションが大幅に減少しました。最後に、熱ショック mRNA の合成が非常に活発な細胞から対角線が得られた場合、2 番目の対角線は (3 番目と同様に) ハイブリダイゼーション中にまったく表示されず、架橋されていない DNA に対応する対角線のみが明らかになります。 DNA-タンパク質架橋法を用いた研究から得られた一般的な結論は、転写中に、DNA鎖に沿って移動するRNAポリメラーゼが可逆的にヌクレオソームとDNAを衝突させ、実質的に裸のDNAを転写するというものでした。転写レベルが低く、DNA に沿って移動する RNA ポリメラーゼがほとんどない場合、RNA ポリメラーゼがすでに通過した領域でヌクレオソームが再び形成される時間があります。転写が活発であれば、DNA のヌクレオソーム構造を修復する時間がなく、通常、DNA にはヒストンがありません。同時に、活性クロマチンのヌクレオソームの構成は不活性クロマチンのヌクレオソームの構成と実質的に変わらないと仮定されています。最近、A.D. ミルザベコフら。彼らは、単離された核を白金製剤で処理するという別の方法を使用して、ヒストンの DNA への結合に関する実験を再現しました。この方法は硫酸ジメチルよりも穏やかです。基本的には同じ結果が得られました。

この一連のデータに加えて、著者らが多少異なる結論に達した研究もあります。 W. ガラードと A. ウォーセル(米国) は、ヌクレアーゼ加水分解と電子顕微鏡を使用してクロマチン内の活性遺伝子の状態を研究し、ヌクレオソームは活性クロマチン内に残りますが、向きを変えてハーフヌクレオソームになるなどの構造変化を受けるという結論に達しました。その結果、マイクロコッカルヌクレアーゼによる加水分解物のエレクトロフェログラムの周期性は約 200 bp です。約 100 bp の周期に置き換えられます。電子顕微鏡では、ビーズの数は 2 倍になり、サイズは小さくなります。 RNA ポリメラーゼは、このような折り畳まれていないヌクレオソームを通過できると考えられています。

この可能性は、得られたデータによっても裏付けられています T. コラー（スイス）。彼はヌクレオソームを研究するための独自の方法を開発しました。細胞は、DNA に結合し、UV 光で 2 本の DNA 鎖を架橋する物質であるソラレンで処理されます。しかし、DNA がヌクレオソームの一部である場合、ソラレンとの反応は起こりません。したがって、処理した細胞から単離した DNA がホルムアルデヒドの存在下で変性すると (DNA の再生が妨げられます)、電子顕微鏡で観察すると、一本鎖 (交差) で互いに接続されたヌクレオソームに対応する交互の泡 (変性した DNA の 2 本の鎖) が観察されます。ヌクレオソーム間リンカーに対応する DNA) が DNA 上に表示されます。まず、染色体外構造の一部であるため、電子顕微鏡を使用して容易に分析できる、活発に転写されるリボソーム RNA 遺伝子を研究しました。それらでは、ヌクレオソームに対応する小胞は見えません。つまり、おそらく、ヒストンは転写領域から完全に除去されています。興味深いことに、非転写領域では、スペーサー、DNA バブル (ヌクレオソーム) がはっきりと見えます。

しかしながら、リボソームRNA遺伝子のようなRNAポリメラーゼIではなくRNAポリメラーゼIIによって転写されるSV40ミニ染色体では異なる結果が得られた(図28)。転写活性のあるミニ染色体は、その上で成長する RNA 鎖 (通常は 1 つまたは 2 つ) の存在によって識別されます。このようなミニ染色体は、細胞から単離されたすべてのミニ染色体の 1 ～ 2% を占めます。ただし、これらには不活性ミニ染色体と同じ数の小胞が含まれており、そのサイズはどちらの場合も同じです。最も興味深いのは、RNA 鎖がリンカーからと小胞から直接伸びていることです。つまり、RNA ポリメラーゼが明らかにヌクレオソームを転写しているようです。これらのデータは、ヌクレオソームのアンフォールディングと RNA ポリメラーゼによる転写を裏付けています。

上記の結果はすべて直接的なものではないため、今後の実験によって、転写中のヌクレオソームの運命の問題に対する最終的な解決策が得られるはずです。

ヒストン修飾とヒストン変異体: 活性クロマチンとの関連。 60 年代初頭に遡ると、Allfrey (米国) は、ヒストンがさまざまな修飾を受ける可能性があることを示しました。したがって、ヒストン HI はリジンの ε-アミノ基でリン酸化されます。ヒストン H3 と H4 は同じ基でアセチル化されています。他にも多数の修飾 (メチル化、ADP - リボシル化、ユビキチン化など) があります。

ヒストンの酵素的修飾がクロマチンの構造とその活性に影響を与える可能性があるとすぐに考えられました。実際、リジンがリン酸化されると、ヒストンの 1 つの正電荷が負電荷に置き換えられ、アピールすると正電荷が失われます。このような電荷の変化のおかげで、演奏時に修飾されたヒストンを未修飾のヒストンから分離することができます。尿素を含む酢酸緩衝液中でのゲル電気泳動。したがって、高分解能電気泳動では、ヒストン H4 は 1 つではなく 4 つのバンドを示し、アセチル化されていない分子と 1、2、および 3 つのリジン残基がアセチル化されている分子に対応します。異なる組織では、フラクション間の比率が変化します。ヒストン H3、H2a、H2b、および H1 は、いくつかの画分 (アセチル化とリン酸化の度合いが異なる) に分割されます。

残念ながら、転写活性クロマチンと不活性クロマチンを分離するための優れた方法はまだ存在しないため、変化したヒストンの形態を 1 つまたは別のクロマチンの状態に帰することは困難です。この方向で最も興味深いデータは、同じ方法で得られたものです。 W・アルフリー（アメリカ合衆国）。活性クロマチンの加水分解中に、彼は、通常のヌクレオソームよりもゆっくりとショ糖勾配中で沈降する異常な粒子を単離し、著者の意見では、折り畳まれていないヌクレオソームに相当した。 A 粒子と呼ばれるこれらの粒子には、すべてのコアヒストンが含まれていました。通常のヌクレオソームとは異なり、A 粒子内のヒストン H3 の SH 基は多くの化学試薬にアクセス可能であり、このため、安息香酸クロロ水銀カラム (SH 基結合試薬) での分画によって A 粒子をヌクレオソームから分離することができました。 A 粒子には、アセチル化されたヒストンの含有量が増加しています。著者は、クロマチン活性化時のヒストンのアセチル化によりヌクレオソーム粒子の展開が起こり、これによりヒストン H3 の SH 基の利用可能性が増加すると示唆しています。

一部のヒストンは、複数の種類の遺伝子によってコードされています。その結果、これらのヒストンには、アミノ酸配列がわずかに異なるいくつかの変異体が存在します。個体発生の過程で、あるヒストンサブクラスが別のヒストンサブクラスに自然に置き換えられることがあります。ただし、これに規制上の意味があるかどうかは依然として不明です。この問題は、転写活性のあるクロマチンを単離するための適切な方法が開発された後にも解決できることは明らかです。

特別な位置はヒストン H1 によって占められています。構造上の組織が大きく異なるオプションがあります。このオプションは、たとえば、鳥類の赤血球の核内のヒストン H1 の重要な部分を置き換えるヒストン H5 です。おそらく、この置換は、赤血球の核における転写の完全な停止における重要な要素です。正常な細胞には、ヒストン H1 の変異体、つまりヒストン H1 0 が存在します。その含有量は、ヒストン H1 全体のほんの一部を占めます。 H1 0 が活性遺伝子と関連している、あるいは逆に、安定してオフになっている遺伝子と関連しているという矛盾したデータが多数あります。質問は未解決のままです。

HMGタンパク質は活性クロマチンの組織化に関与している可能性がある 1* 。ヒストンに加えて、クロマチンには機能が不明な非ヒストンタンパク質が多数含まれています。その中には、明らかに、構造タンパク質、複製、転写などのプロセスを確実にする酵素、および調節タンパク質が含まれるはずです。 E・ジョーンズ(英国) は、分析と同定を可能にするのに十分な量で存在するタンパク質成分を単離することを試みました。彼は実際に、新しいクラスの核タンパク質を単離することに成功しました。これを彼は「高移動性タンパク質グループ」と呼んでいました。 高機動性グループ）、またはHMGタンパク質。この名前は、ゲル電気泳動中のこれらのタンパク質の高い移動度に基づいています。 HMG タンパク質画分は、多数の個別の成分に分解されます。それらの中で、最も代表的でよく特徴付けられているのは、HMG-1、HMG-2、HMG-14、および HMG-17 です。

HMG タンパク質は低分子量です。塩基性アミノ酸とジカルボン酸アミノ酸の両方が豊富に含まれています。 HMG タンパク質の含有量はヒストンの含有量の約 7% です。細胞の種類によって核が異なる場合があります。これに関連して、我々はタンパク質 HMG-14 および HMG-17 に最も興味を持っています。これらのタンパク質については、転写活性化における役割の可能性についての証拠が得られています。 H. ワイントローブ(米国) は、HMG タンパク質を抽出する 0.35 M NaCl による核抽出により活性クロマチンの一部の特性が変化し、HMG-14 および HMG-17 がクロマチンに添加されると回復することを示しました。 G・ディクソン(カナダ) は、ヌクレアーゼによる加水分解の初期段階でクロマチンから放出されるヌクレオソームの組成中にこれらのタンパク質が存在することを発見しました。彼のデータによれば、これらのタンパク質には牽引活性遺伝子の DNA が豊富に含まれていました。

末端 [ 32 P] を結合し、L 細胞からの hnRNA とハイブリダイズします。ハイブリッドはゲル濾過によって検出された。 1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - 細胞の総 DNA (V.V. Bakaev らによって得られた結果による)">
米。 29. HMG タンパク質 (14 および 17) と活性クロマチンの関連の可能性。 a - ミクロコッカスヌクレアーゼを使用したクロマチン加水分解物中のサブヌクレオソームの検出。加水分解のさまざまな段階で、サブヌクレオソームの特定の画分が現れます。電気泳動は、非変性条件下でポリアクリルアミドゲル中で実施した。エチジウムブロマイドによる染色、右の列のフルオログラフィー。 b - CH2 および CH3 サブヌクレオソームのタンパク質組成を決定するための二次元電気泳動の使用。 [14C]タンパク質で標識したクロマチンをミクロコッカスヌクレアーゼで加水分解し、二次元電気泳動（第一方向－非解離媒体、第二方向－ドデシル硫酸ナトリウム溶液）で分離した後、オートラジオグラフィーを行ってタンパク質を同定した。文字は、実験時点では既知のタンパク質とまだ同定されていなかった HMG タンパク質を示します。これで、A が HMG-1、B が HMG-2、E が HMG-14、G が HMG-17 であることがわかりました。HMG タンパク質 F と H は明確に同定されていませんが、おそらく H も HMG-17 に対応します。 HMG タンパク質はモノヌクレオソーム (MH-2 および MH-3) とサブヌクレオソーム CH-2 (HMG-17) および CH-3 (HMG-14) の一部であることがわかります。 c - CH-2 および CH-3 転写配列の DNA 濃縮の実証。 L 細胞の CH-2 および CH-3 バンドから単離した DNA の 5" 末端 [32 P] を標識し、L 細胞からの hnRNA とハイブリダイズさせました。ハイブリッドはゲル濾過によって検出されました。1 - CH-2 DNA; 2 - CH-3 DNA; 3 - 細胞の全 DNA (V.V. Bakaev らによって得られた結果による)

V.V.バカエフ私たちの研究室では、別の実験アプローチを使用して、転写におけるHMGタンパク質の役割についての結論に達しました。クロマチン加水分解物の電気泳動分析中に、彼はヌクレオソームとオリゴヌクレオソームに加えて、より大きな移動度をもつ微量成分を明らかにしました。それらはサブヌクレオソームと呼ばれ、明らかに、ヌクレオソームがさらに分解された産物でした（図２９、表５）。サブヌクレオソーム CH-7 は、H2a と H2b のそれぞれ 1 分子を失い、40 bp 短縮された DNA を含むヌクレオソームに対応し、CH-6 は 30 ～ 40 bp 長の DNA 複合体に対応しました。ヒストン H1 は、MH-2 が MH-1 に変換される際に切断されます。 CH-4 には、DNA セグメントと一対のヒストン H2a および H2b (MH-1→CH-7→CH-4 の反応生成物) が含まれていました。 2 つのサブヌクレオソーム、CH-3 および CH-2 は、短い DNA と HMG タンパク質 (HMG-14 および HMG-17) で構成されています。これらは、対応するヌクレオソームの消化時に溶液中に入る、HMG-14 および HMG-17 タンパク質に関連するリンカー領域であると想定できます。 CH-2およびCH-3を収集し、それらからDNAを単離し、末端標識し、核RNAとのハイブリダイゼーションを研究した。 CH-2 および CH-3 からの DNA は、同じサイズに断片化された全細胞 DNA よりもはるかに効率的に核 RNA とハイブリダイズすることが判明しました。

したがって、HMG-14 および HMG-17 タンパク質に関連する DNA は転写活性のあるクロマチンに由来する可能性が高いと結論付けられました。

これらのデータはすべて独立して得られたもので、HMG-14 および HMG-17 が何らかの形で遺伝子活性化に関連していることを示唆しています。しかし、その活性化メカニズムは完全に不明でした。 HMG-14 と HMG-17 は特異性がないため、遺伝子をオンにする主な要因とは考えられません。それらは活性クロマチンの「開いた構造」の維持に関与していると考える人もいるかもしれません。

その後、クロマチン活性化における HMG-14 および HMG-17 の役割に関して懐疑的な見方が浮上しました。特に最近は A.D.ミルザベコフ他。タンパク質組織とのハイブリダイゼーション法を使用して、HMG-14 および HMG-17 の活性クロマチンの枯渇に関するデータを取得しました。しかし、上記のデータはすべて間接的なものであるため、一般に HMG タンパク質の役割の問題は未解決のままであり、さらなる研究が必要です。

トポイソメラーゼ I および DNA に強く結合したタンパク質は、転写活性のあるクロマチンの一部です 1* 。 S. Elgin (USA) は、他の多くの著者に続いて、転写活性のあるクロマチンに、スーパーコイル DNA を弛緩させる酵素であるトポイソメラーゼ I が含まれていることを示しました。このことは、トポイソメラーゼ I に対する蛍光抗体を使用したショウジョウバエの多糸染色体の細胞学的調製物で最初に実証されました。この酵素は DNA に一本鎖切断を導入し、結果として生じる DNA の 5 インチ末端に共有結合します。これにより、DNA は自由に回転できるようになります。切断部位が切断され、DNA のホスホジエステル結合が復元されます。分子量の点では、トポイソメラーゼ I (略してトポ I) は不均一です。最も重い成分は分子量を持ちます。 135 kDa、そして最も豊富に表現されているのは - 80kDa。プロテイナーゼによって切断されると、より短いポリペプチドが形成されますが、それでも酵素活性は保持されます。

抗生物質カプトテシンはトポ I 阻害剤であり、細胞がカプトテシンで処理されると、酵素は抗生物質と接触した時点で存在していた場所で DNA と共有結合架橋を形成します。このような架橋の位置は、ハイブリダイゼーションタグを使用したマッピングによって簡単に決定できます。このようにして、トポ I はゲノムの転写領域にのみ存在し、おそらく RNA ポリメラーゼ II と協力して働き、転写中に生じる局所的な DNA ねじれを除去していることが判明しました。

ゲノムの転写領域で検出されるもう 1 つのタンパク質成分は、DNA に強く結合したタンパク質のセット (DBP) であり、これは細胞の転写された DNA に対応します (セクション 3.4 を参照)。

S.V.ラジンとV.V.チェルノフヴォストフ DNA と PBP の複合体を詳細に特徴付ける試みが行われました。 PBP に関連する長さ 1 ～ 2 kb の DNA 断片を精製し、CsCl 密度勾配中で平衡超遠心分離を行いました。それらの浮力密度は等しいことが判明した 1.7g/cm3つまり、タンパク質を含まない遊離 DNA の浮遊密度に相当します。この矛盾を説明するために計画された実験では、DRNase で処理すると複合体の浮力密度が減少することがわかりました。 1.62～1.65g/cm3。タンパク質密度に基づくおおよその計算 ( ～ 1.3 g/cm3) と RNA ( ～ 1.9 g/cm3)、(各 DNA 分子には約 150 kDaタンパク質と約200ヌクレオチドのRNA。この RNA の性質は不明ですが、その均一性とユニークなヌクレオチド配列の証拠が得られています。

このように、DNA-PBP 複合体については多くが謎のままですが、転写機構の組織化において重要な役割を果たしている可能性は十分にあります。彼らの研究は現在進行中です。

転写された遺伝子における DNA の脱メチル化 2*。活性クロマチンのもう 1 つの重要な特徴は、DNA の特定の部分の脱メチル化です。不活性遺伝子では、CG 配列内のシチジル残基のほとんどがメチル化されています。初め B.V.ヴァニュシン研究室で A.N. ベロゼルスキー同じ動物の異なる組織の DNA では C メチル化のレベルが異なることが実証され、これに基づいて、メチル化が分化において調節的役割を果たしている可能性が示唆されました。その後、多くの著者が、転写された DNA の一部の領域がメチル化不足であることを示しました。最も広く使用されている解析方法は、CGCG や CCGG など、同じ配列を認識するがメチル化感度が異なる制限酵素を使用して得られた制限マップの比較です。制限酵素の 1 つはメチル化配列と非メチル化配列の両方を切断し、もう 1 つは非メチル化配列のみを切断します。通常、非メチル化配列は遺伝子の調節領域に局在します。遺伝子自体の領域、そのコード部分およびイントロンは、作動遺伝子とサイレント遺伝子の両方で同様にメチル化されています。

メチル化 DNA が細胞に導入されると、細胞内でのその発現は非メチル化 DNA に比べて大幅に減少します。 DNA複製中にDNAメチル化の状態が再現されるというデータが得られており、鎖の1つがメチル化されると、新たに形成された鎖も同じ場所でメチル化されます。

かつては、調節領域の CG 配列におけるシチジンのメチル化 - 脱メチル化が遺伝子の不活化 - 活性化の主なメカニズムであると考えられていました。しかし、最近、この仮説を否定するデータがいくつか明らかになりました。したがって、完全に CG メチル化された SV40 DNA が活発に発現されます。同時に、ショウジョウバエの DNA ではメチルシトシンはまったく検出されません。 C の脱メチル化は遺伝子活性化の結果であり、転写活性の状態を永続させるだけである可能性があります。遺伝子活性化を研究する他の分野と同様に、ここでも新しい実験が必要です。

クロマチン: 細胞分裂における定義、構造、役割。 真核生物 DNA の 3 つの分画、染色体におけるそれらの局在と機能 クロマチンの構造および機能成分

クロマチン: 細胞分裂における定義、構造、役割。真核生物 DNA の 3 つの分画、染色体におけるそれらの局在と機能クロマチンの構造および機能成分