Il "coltello svizzero" dell'esercito virale: svelato il segreto della trascrittasi inversa. Trascrittasi inversa Revertasi trascrittasi inversa

Si chiama così perché la maggior parte dei processi di trascrizione negli organismi viventi avviene in una direzione diversa, ovvero una trascrizione di RNA viene sintetizzata da una molecola di DNA.

Storia

La trascrittasi inversa è stata scoperta da Howard Temin all'Università del Wisconsin-Madison, e indipendentemente da David Baltimore nel 1970. Entrambi i ricercatori hanno ricevuto il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina nel 1975 con Renato Dulbecco.

Precisione di trascrizione

La trascrizione inversa da RNA a DNA è accompagnata da un alto livello di errori di traduzione, che distingue la trascrittasi inversa dalle altre DNA polimerasi. Questi errori possono portare a mutazioni responsabili della resistenza ai farmaci dei virus.

Importanza per i virus

La trascrizione inversa è necessaria, in particolare, per il ciclo di vita dei retrovirus, ad esempio virus dell'immunodeficienza umana e linfoma a cellule T umani di tipo 1 e 2. Dopo che l'RNA virale è entrato nella cellula, la trascrittasi inversa contenuta nelle particelle virali sintetizza un DNA complementare ad esso e quindi completa il secondo filamento su questo filamento di DNA, come su uno stampo.

Significato per gli eucarioti

Applicazione

Terapia antiretrovirale

Ruolo nell'ingegneria genetica

Nell'ingegneria genetica, la trascrittasi inversa viene utilizzata per produrre cDNA, una copia di un gene eucariotico che non contiene introni. Per questo, l'mRNA maturo (codifica il prodotto genico corrispondente: proteina, RNA) viene isolato dal corpo e viene eseguita la trascrizione inversa con esso come modello. Il cDNA risultante può essere trasformato in cellule batteriche per ottenere un prodotto transgenico.

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Note (modifica)

Estratto che caratterizza la trascrittasi inversa

- Oh! Oh! Oh!
- Bene, addio, Bolkonsky! Addio, principe; Vieni a cena prima ", arrivarono le voci. - Ci prendiamo cura di te.
"Cerca di lodare il più possibile l'ordine nella consegna delle provviste e dei percorsi quando parli con l'imperatore", ha detto Bilibin, scortando Bolkonsky al fronte.
"E vorrei lodare, ma non posso, per quanto ne so", rispose Bolkonsky, sorridendo.
- Beh, in generale, parla il più possibile. La sua passione è il pubblico; ma lui stesso non ama parlare e non sa come, come vedrai.

All'uscita, l'imperatore Francesco si limitò a guardare intensamente in faccia il principe Andrea, che si trovava nel posto designato tra gli ufficiali austriaci, e gli fece un cenno con la testa lunga. Ma dopo aver lasciato l'ala di ieri, l'aiutante ha cortesemente comunicato a Bolkonsky il desiderio dell'imperatore di dargli udienza.
L'imperatore Francesco lo ricevette, in piedi al centro della stanza. Prima di iniziare la conversazione, il principe Andrea rimase colpito dal fatto che l'imperatore sembrava confuso, non sapendo cosa dire, e arrossì.
- Dimmi, quando è iniziata la battaglia? chiese frettolosamente.
Rispose il principe Andrea. Questa domanda è stata seguita da altre domande altrettanto semplici: “Kutuzov è sano? quanto tempo fa ha lasciato Krems?" ecc. L'imperatore parlava con tale espressione come se tutto il suo scopo consistesse solo nel porre un certo numero di domande. Le risposte a queste domande, fin troppo ovvie, non potevano interessarlo.
- A che ora è iniziata la battaglia? chiese l'imperatore.
"Non so dire a Vostra Maestà a che ora è iniziata la battaglia dal fronte, ma a Durenstein, dove mi trovavo, l'esercito ha lanciato un attacco alle 6 di sera", ha detto Bolkonsky, animandosi e in questo caso presumendo che sarebbe stato in grado di presentare nella sua testa il ready-made una descrizione fedele di tutto ciò che sapeva e vedeva.
Ma l'imperatore sorrise e lo interruppe:
- Quante miglia?
- Dove e dove, Vostra Maestà?
- Da Durenstein a Krems?
«Tre miglia e mezzo, Vostra Maestà.
- I francesi hanno lasciato la riva sinistra?
- Come hanno riferito gli esploratori, gli ultimi hanno attraversato le zattere di notte.
- C'è abbastanza foraggio a Krems?
- Il foraggio non è stato consegnato in quella quantità...
L'imperatore lo interruppe.
- A che ora è stato ucciso il generale Schmitt?...
- Alle sette, credo.
- Alle 7:00. Molto triste! Molto triste!
L'imperatore si disse grato e si inchinò. Il principe Andrea uscì e fu subito circondato da cortigiani da tutte le parti. Occhi affettuosi lo guardavano da tutte le parti e si udivano parole gentili. L'aiutante di costruzione di ieri gli ha rimproverato di non essere rimasto nel palazzo e gli ha offerto la sua casa. Il ministro della Guerra si avvicinò, congratulandosi con lui per l'Ordine di Maria Teresa di 3° grado, che l'imperatore gli aveva conferito. Il ciambellano dell'Imperatrice lo invitò a Sua Maestà. Anche l'arciduchessa voleva vederlo. Non sapeva a chi rispondere e per diversi secondi raccolse i suoi pensieri. L'inviato russo lo prese per una spalla, lo portò alla finestra e cominciò a parlargli.
Contrariamente alle parole di Bilibin, la notizia che ha portato è stata accolta con gioia. È stato istituito un servizio di ringraziamento. Kutuzov ricevette la Gran Croce da Maria Teresa e l'intero esercito ricevette riconoscimenti. Bolkonsky ricevette inviti da tutte le parti e dovette fare visita ai principali dignitari dell'Austria tutta la mattina. Dopo aver terminato le sue visite alle cinque di sera, scrivendo mentalmente una lettera a suo padre sulla battaglia e sul suo viaggio a Brunn, il principe Andrey tornò a casa a Bilibin. Sotto il portico della casa occupata da Bilibin, c'era una chaise longue piena di cose, e Franz, il servitore di Bilibin, trascinando a fatica una valigia, uscì dalla porta.

La revertasi è un enzima che sintetizza il cDNA su uno stampo di RNA.

In alcuni virus, il genoma non è DNA, come al solito, ma RNA. Tali virus erano chiamati retrovirus (retro - reverse). Nel 1970, D. Baltimore e H.M. Temin scoprirono un meccanismo per trasferire informazioni dall'RNA virale al DNA, ad es. al contrario di quanto avviene nelle cellule degli organismi superiori. Questo processo è chiamato trascrizione inversa e l'enzima che lo esegue è stato chiamato trascrittasi inversa o revertasi (revertasi).

Trascrittasi inversa, o trascrittasi inversa, [lat. trascrizione- riscrittura) - l'enzima DNA polimerasi RNA-dipendente, con l'aiuto del quale viene eseguita la trascrizione inversa - sintesi del DNA sulla matrice dell'RNA; codificato dai genomi di alcuni virus contenenti RNA e da elementi genetici mobili del genoma di organismi superiori, un importante "strumento" per l'ingegneria genetica. La trascrittasi inversa ha almeno tre attività enzimatiche:

1) DNA polimerasi, utilizzando sia RNA che DNA come stampo;

2) l'attività della RNasi H, che idrolizza l'RNA come parte di un ibrido RNA-DNA, ma non l'RNA a singolo o doppio filamento, e

3) Attività della DNA endonucleasi.

Scoperto indipendentemente l'uno dall'altro da D. Baltimore e H. Temin nel 1970 in virus portatori di tumore contenenti RNA (Premio Nobel per il 1975 insieme a R. Dulbecco).

Quindi, le trascrittasi inverse sono in grado di sintetizzare il DNA su uno stampo di RNA polimerizzando quattro deossiribonucleosidi trifosfati. E proprio come le DNA polimerasi, funzionano solo quando innescate.

Le trascrittasi inverse sono utilizzate nella sintesi del DNA a doppio filamento, complementare all'RNA (soprattutto mRNA), per il suo successivo clonaggio in vettori plasmidici quando si ottengono librerie di cDNA (cloni). Le trascrittasi inverse, come le DNA polimerasi, possono essere utilizzate per introdurre etichette radioattive o fluorescenti nelle sonde di DNA in deossiribonucleosidi trifosfati opportunamente etichettati.

La capacità di sintetizzare il DNA su uno stampo di RNA in determinate condizioni è stata dimostrata per la DNA polimerasi termostabile Thermus thermophilus. Ciò consente di utilizzarlo per la rilevazione diretta di RNA specifici in campioni biologici mediante PCR. Modifiche moderne di questo approccio consentono di sintetizzare in una miscela di reazione (e provetta) in una reazione di trascrizione inversa un piccolo numero di copie del frammento di DNA amplificato su uno stampo di RNA, che vengono immediatamente utilizzate dallo stesso enzima come stampo in una PCR convenzionale (un tubo PCR).

Quando si studiano i retrovirus, il cui genoma è rappresentato da molecole di RNA a filamento singolo, è stato scoperto che nel processo di sviluppo intracellulare attraversano lo stadio di integrazione del loro genoma sotto forma di DNA a doppio filamento nei cromosomi del cellula ospite. Nel 1964, H. Temin avanzò un'ipotesi sull'esistenza di un enzima virus-specifico in grado di sintetizzare DNA complementare su uno stampo di RNA. Nel 1970 X. Temin e S. Mizutani, nonché indipendentemente da loro D. Baltimore, scoprirono un tale enzima in una preparazione di virioni extracellulari del virus del sarcoma di Rous. Questa DNA polimerasi RNA-dipendente è chiamata trascrittasi inversa (trascrittasi inversa).

Lo studio più dettagliato è la revertasi dei retrovirus aviari. Ogni virione contiene circa 50 molecole di questo enzima. La trascrittasi inversa consiste di due subunità - (65 kDa) e β (95 kDa), che sono presenti in quantità equimolari. La subunità è la parte N-terminale (due terzi) della subunità .

La trascrittasi inversa ha almeno tre attività enzimatiche:

· DNA polimerasi, utilizzando come stampo sia l'RNA che il DNA;

· L'attività della RNasi H, che idrolizza l'RNA nell'ibrido RNA-DNA, ma non l'RNA a singolo o doppio filamento;

· DNA endonucleasi.

Le prime due attività sono necessarie per la sintesi del DNA virale e l'endonucleasi sembra essere importante per l'integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite. La subunità della revertasi ha tutte e tre le attività, mentre la subunità ha solo la polimerasi e la RNasi H.

La trascrittasi inversa purificata sintetizza il DNA sia su RNA che su modelli di DNA. Per iniziare la sintesi, la revertasi, come altre polimerasi, ha bisogno di una breve regione a doppio filamento: un primer. Il primer può essere un segmento a singolo filamento sia di RNA che di DNA, che durante la reazione risultano essere legati covalentemente al filamento di DNA appena sintetizzato.

La trascrittasi inversa viene utilizzata principalmente per trascrivere l'RNA messaggero in DNA complementare (cDNA). La reazione di trascrizione inversa viene condotta in presenza di potenti inibitori dell'attività della RNasi. In questo caso, è possibile ottenere copie di DNA a lunghezza intera delle molecole di RNA bersaglio. Oligo (dT) viene utilizzato come primer per la trascrizione inversa di mRNA contenente poli (A) (Fig.), E per molecole di RNA senza estremità 3 "poli (A), oligonucleotidi sintetizzati chimicamente complementari all'estremità 3" dell'estremità studiata RNA. Inoltre, quest'ultimo tipo di molecole di RNA può essere convertito in poli (A) -contenente per mezzo di E. coli poli (A) -polimerasi.

Dopo la sintesi del filamento di DNA complementare sull'mRNA e la distruzione dell'RNA (di solito si usa un trattamento con alcali), viene sintetizzato il secondo filamento di DNA. In questo caso, viene utilizzata la capacità della revertasi di formare forcine autocomplementari alle estremità 3' di cDNA a filamento singolo, che possono fungere da primer. Il modello è il primo filamento di cDNA. Questa reazione può essere catalizzata sia dalla revertasi che dalla DNA polimerasi I. La combinazione di questi due enzimi consente di aumentare la resa di molecole di cDNA a doppio filamento a tutti gli effetti.

Alla fine della sintesi, il primo e il secondo filamento di cDNA rimangono legati in modo covalente dall'ansa della forcina, che è servita da primer nella sintesi del secondo filamento. Questo ciclo viene scisso con l'endonucleasi S1, che distrugge specificamente le regioni a singolo filamento degli acidi nucleici. Le estremità risultanti non sono sempre smussate e, per aumentare l'efficienza della successiva clonazione, vengono riparate per smussare utilizzando il frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Il cDNA a doppio filamento risultante può quindi essere inserito in vettori di clonazione, espanso all'interno di molecole di DNA ibride e utilizzato per ulteriori ricerche.

Trascrittasi inversa (revertasi o DNA polimerasi RNA-dipendente) è un enzima che catalizza la sintesi del DNA su uno stampo di RNA in un processo chiamato “ trascrizione inversa"... Il nome del processo riflette l'opposto del processo trascrizioni effettuata in una direzione diversa: un trascritto di RNA viene sintetizzato dalla molecola stampo di DNA.

Questi enzimi sono stati isolati da virus a RNA ( retrovirus). La trascrittasi inversa viene utilizzata dai virus tumorigenici per trascrivere l'mRNA nel filamento di DNA complementare. Studiando i retrovirus, il cui genoma è rappresentato da molecole di RNA a filamento singolo, è stato scoperto che nel processo di sviluppo intracellulare, il retrovirus attraversa lo stadio di integrazione del suo genoma sotto forma di DNA a doppio filamento nei cromosomi della cellula ospite. Nel 1964, Temin avanzò un'ipotesi sull'esistenza di un enzima virus-specifico in grado di sintetizzare DNA complementare su uno stampo di RNA. Gli sforzi volti a isolare un tale enzima furono coronati da successo e nel 1970 Temin e Mizutani, e indipendentemente da loro Baltimora, scoprirono l'enzima desiderato in una preparazione di virioni extracellulari del virus del sarcoma di Rous. Questa DNA polimerasi RNA-dipendente è chiamata trascrittasi inversa o trascrittasi inversa.

Lo studio più dettagliato è la revertasi dei retrovirus aviari. Ogni virione contiene circa 50 molecole di questo enzima. La trascrittasi inversa è costituita da due subunità, a (65 kDa) e b (95 kDa), presenti in quantità equimolari. La trascrittasi inversa ha almeno tre attività enzimatiche:

1) DNA polimerasi, utilizzando sia RNA che DNA come stampo;

2) l'attività della RNasi H, che idrolizza l'RNA nell'ibrido RNA-DNA;

3) Attività della DNA endonucleasi.

Le prime due attività sono necessarie per la sintesi del DNA virale e l'endonucleasi sembra essere importante per l'integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite. La trascrittasi inversa purificata sintetizza il DNA sia su RNA che su modelli di DNA (Fig. 11).

Riso. 11. Schema di sintesi di copie di DNA a doppio filamento di molecole di RNA

Per iniziare la sintesi, la revertasi, come altre polimerasi, necessita di una breve regione a doppio filamento (primer). Il primer può essere un segmento a singolo filamento sia di RNA che di DNA, che durante la reazione risultano essere legati covalentemente al filamento di DNA appena sintetizzato. Nell'ingegneria genetica, vengono utilizzati sia primer oligo- (dT) complementari alle estremità 3'-polyA dell'mRNA che un insieme di esanucleotidi "casuali" nella composizione e sequenza (primer casuali) estremità poli (A), oligonucleotidi sintetizzati chimicamente complementari fino all'estremità 3" vengono utilizzati

La trascrittasi inversa viene utilizzata principalmente per trascrivere l'RNA messaggero in DNA complementare (cDNA). La reazione di trascrizione inversa viene eseguita in condizioni appositamente selezionate utilizzando forti inibitori dell'attività della RNasi. In questo caso, è possibile ottenere copie di DNA a lunghezza intera delle molecole di RNA bersaglio. Dopo la sintesi del filamento di DNA complementare sull'mRNA e la distruzione dell'RNA (di solito si usa un trattamento con alcali), viene sintetizzato il secondo filamento di DNA. In questo caso, viene utilizzata la capacità della trascrittasi inversa di formare forcine autocomplementari alle estremità 3' di cDNA a filamento singolo, che possono fungere da primer.

Il modello è il primo filamento di cDNA. Questa reazione può essere catalizzata sia dalla revertasi che dalla DNA polimerasi I di E. coli. La combinazione di questi due enzimi ha dimostrato di aumentare la resa di molecole di cDNA a doppio filamento a tutti gli effetti. Alla fine della sintesi, il primo e il secondo filamento di cDNA rimangono legati in modo covalente dall'ansa della forcina, che è servita da primer nella sintesi del secondo filamento. Questo ciclo viene scisso con l'endonucleasi S1, che distrugge specificamente le regioni a singolo filamento degli acidi nucleici. Le estremità risultanti non sono sempre smussate e, per aumentare l'efficienza della successiva clonazione, vengono riparate per smussare utilizzando il frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Il cDNA a doppio filamento risultante può quindi essere inserito in vettori di clonazione, espanso all'interno di molecole di DNA ibride e utilizzato per ulteriori ricerche.