"Pisau Swiss" dari tentara virus: rahasia reverse transcriptase terurai. Transkriptase terbalik Transkriptase terbalik membalikkan

Disebut demikian karena sebagian besar proses transkripsi pada organisme hidup terjadi dalam arah yang berbeda, yaitu transkrip RNA disintesis dari molekul DNA.

Sejarah

Reverse transcriptase ditemukan oleh Howard Temin di University of Wisconsin-Madison, dan secara independen oleh David Baltimore pada tahun 1970. Kedua peneliti menerima Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Kedokteran pada tahun 1975 dengan Renato Dulbecco.

Akurasi transkripsi

Transkripsi balik dari RNA ke DNA disertai dengan kesalahan translasi tingkat tinggi, yang membedakan transkriptase balik dari polimerase DNA lainnya. Kesalahan ini dapat menyebabkan mutasi yang bertanggung jawab atas resistensi obat virus.

Pentingnya virus

Transkripsi terbalik diperlukan, khususnya, untuk siklus hidup retrovirus, misalnya, human immunodeficiency virus dan limfoma sel T manusia tipe 1 dan 2. Setelah RNA virus memasuki sel, transkriptase balik yang terkandung dalam partikel virus mensintesis DNA komplementer untuk itu, dan kemudian melengkapi untai kedua pada untai DNA ini, seperti pada cetakan.

Signifikansi untuk eukariota

Aplikasi

Terapi antiretroviral

Peran dalam rekayasa genetika

Dalam rekayasa genetika, reverse transcriptase digunakan untuk menghasilkan cDNA, salinan gen eukariotik yang tidak mengandung intron. Untuk ini, mRNA matang (mengkodekan produk gen yang sesuai: protein, RNA) diisolasi dari tubuh dan transkripsi balik dilakukan dengannya sebagai cetakan. cDNA yang dihasilkan dapat diubah menjadi sel bakteri untuk mendapatkan produk transgenik.

Lihat juga

Tulis ulasan tentang "Transkriptase Terbalik"

Catatan (edit)

Kutipan Karakterisasi Transkriptase Terbalik

- Oh! Hai! Hai!
- Nah, selamat tinggal, Bolkonsky! Selamat tinggal, pangeran; Datanglah untuk makan malam lebih awal, ”suara-suara itu datang. - Kami menjagamu.
“Cobalah untuk memuji perintah dalam pengiriman perbekalan dan rute sebanyak mungkin ketika Anda berbicara dengan kaisar,” kata Bilibin, mengawal Bolkonsky ke depan.
"Dan saya ingin memuji, tetapi saya tidak bisa, selama saya tahu," jawab Bolkonsky sambil tersenyum.
- Nah, secara umum, bicaralah sebanyak mungkin. Gairahnya adalah penonton; tetapi dia sendiri tidak suka berbicara dan tidak tahu caranya, seperti yang akan Anda lihat.

Di pintu keluar, Kaisar Franz hanya menatap tajam ke wajah Pangeran Andrew, yang berdiri di tempat yang ditentukan di antara para perwira Austria, dan mengangguk kepadanya dengan kepala panjangnya. Tetapi setelah meninggalkan sayap kemarin, ajudan dengan sopan menyampaikan kepada Bolkonsky keinginan kaisar untuk memberinya audiensi.
Kaisar Franz menerimanya, berdiri di tengah ruangan. Sebelum memulai percakapan, Pangeran Andrew dikejutkan oleh kenyataan bahwa kaisar tampak bingung, tidak tahu harus berkata apa, dan tersipu.
- Katakan padaku, kapan pertempuran dimulai? Dia bertanya dengan tergesa-gesa.
Pangeran Andrew menjawab. Pertanyaan ini diikuti oleh pertanyaan lain yang sama sederhananya: “Apakah Kutuzov sehat? sudah berapa lama dia meninggalkan Krems?" dll. Kaisar berbicara dengan ekspresi seolah-olah seluruh tujuannya hanya terdiri dari mengajukan sejumlah pertanyaan tertentu. Jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini, karena sudah terlalu jelas, tidak menarik baginya.
- Pukul berapa pertempuran dimulai? Kaisar bertanya.
`` Saya tidak bisa memberi tahu Yang Mulia jam berapa pertempuran dimulai dari depan, tetapi di Durenstein, tempat saya berada, tentara melancarkan serangan pada pukul 6 malam, '' kata Bolkonsky, menjadi bersemangat dan dalam kasus ini dengan asumsi bahwa dia akan mampu menyajikan yang sudah jadi di kepalanya deskripsi yang benar dari segala sesuatu yang dia tahu dan lihat.
Tetapi kaisar tersenyum dan memotongnya:
- Berapa mil?
- Di mana dan ke mana, Yang Mulia?
- Dari Durenstein ke Krems?
“Tiga setengah mil, Yang Mulia.
- Apakah Prancis meninggalkan tepi kiri?
- Seperti yang dilaporkan pramuka, yang terakhir menyeberangi rakit di malam hari.
- Apakah ada cukup makanan ternak di Krems?
- Pakan tidak dikirim dalam jumlah itu ...
Kaisar memotongnya.
- Pada jam berapa Jenderal Schmitt dibunuh? ...
- Pada pukul tujuh, saya pikir.
- Jam 7:00. Sangat sedih! Sangat sedih!
Kaisar berkata dia berterima kasih dan membungkuk. Pangeran Andrew keluar dan segera dikelilingi oleh para abdi dalem dari semua sisi. Mata penuh kasih menatapnya dari semua sisi dan kata-kata lembut terdengar. Ajudan bangunan luar kemarin mencelanya karena tidak tinggal di istana, dan menawarinya rumahnya. Menteri Perang datang, mengucapkan selamat kepadanya atas Ordo Maria Theresa tingkat ke-3, yang telah diberikan kaisar kepadanya. Bendahara Permaisuri mengundangnya ke Yang Mulia. Archduchess juga ingin melihatnya. Dia tidak tahu harus menjawab siapa, dan selama beberapa detik mengumpulkan pikirannya. Utusan Rusia itu memegang bahunya, membawanya ke jendela dan mulai berbicara dengannya.
Berlawanan dengan ucapan Bilibin, kabar yang dibawakannya disambut dengan suka cita. Sebuah kebaktian syukur ditunjuk. Kutuzov dianugerahi Salib Besar oleh Maria Theresa, dan seluruh pasukan menerima penghargaan. Bolkonsky menerima undangan dari semua pihak dan harus melakukan kunjungan ke pejabat utama Austria sepanjang pagi. Setelah menyelesaikan kunjungannya pada pukul lima sore, secara mental menulis surat kepada ayahnya tentang pertempuran dan tentang perjalanannya ke Brunn, Pangeran Andrey kembali ke Bilibin. Di beranda rumah yang ditempati Bilibin, ada kursi malas yang setengah penuh dengan barang-barang, dan Franz, pelayan Bilibin, dengan susah payah menyeret koper, keluar dari pintu.

Revertase adalah enzim yang mensintesis cDNA pada template RNA.

Pada beberapa virus, genom bukanlah DNA, seperti biasanya, tetapi RNA. Virus semacam itu disebut retrovirus (retro - terbalik). Pada tahun 1970, D. Baltimore dan H.M. Temin menemukan mekanisme untuk mentransfer informasi dari RNA virus ke DNA, yaitu sebaliknya dengan apa yang terjadi dalam sel-sel organisme yang lebih tinggi. Proses ini disebut transkripsi balik, dan enzim yang melakukannya disebut reverse transcriptase, atau revertase (revertase).

Reverse transcriptase, atau reverse transcriptase, [lat. transkripsi- penulisan ulang) - enzim DNA polimerase yang bergantung pada RNA, dengan bantuan transkripsi balik yang dilakukan - sintesis DNA pada matriks RNA; dikodekan oleh genom dari beberapa virus yang mengandung RNA dan elemen genetik bergerak dari genom organisme yang lebih tinggi, sebuah "alat" penting untuk rekayasa genetika. Reverse transcriptase memiliki setidaknya tiga aktivitas enzimatik:

1) DNA polimerase, menggunakan RNA dan DNA sebagai cetakan;

2) aktivitas RNase H, yang menghidrolisis RNA sebagai bagian dari hibrid RNA-DNA, tetapi bukan RNA untai tunggal atau ganda, dan

3) aktivitas DNA endonuklease.

Ditemukan secara independen satu sama lain oleh D. Baltimore dan H. Temin pada tahun 1970 dalam virus pembawa tumor yang mengandung RNA (Hadiah Nobel untuk tahun 1975 bersama dengan R. Dulbecco).

Jadi, transkriptase balik mampu mensintesis DNA pada cetakan RNA dengan mempolimerisasi empat deoksiribonukleosida trifosfat. Dan sama seperti DNA polimerase, mereka hanya berfungsi ketika disiapkan.

Transkriptase terbalik digunakan dalam sintesis DNA untai ganda, komplementer dengan RNA (terutama mRNA), untuk kloning berikutnya dalam vektor plasmid ketika memperoleh perpustakaan cDNA (klon). Transkriptase terbalik, seperti DNA polimerase, dapat digunakan untuk memasukkan label radioaktif atau fluoresen ke dalam probe DNA dalam deoksiribonukleosida trifosfat yang diberi label dengan tepat.

Kemampuan untuk mensintesis DNA pada cetakan RNA dalam kondisi tertentu telah ditunjukkan untuk DNA polimerase termostabil Thermus thermophilus. Hal ini memungkinkan untuk digunakan untuk deteksi langsung RNA spesifik dalam sampel biologis dengan PCR. Modifikasi modern dari pendekatan ini memungkinkan dalam satu campuran reaksi (dan tabung reaksi) untuk mensintesis dalam reaksi transkripsi terbalik sejumlah kecil salinan fragmen DNA yang diperkuat pada template RNA, yang segera digunakan oleh enzim yang sama sebagai template. pada PCR konvensional (one tube PCR).

Ketika mempelajari retrovirus, yang genomnya diwakili oleh molekul RNA untai tunggal, ditemukan bahwa dalam proses perkembangan intraseluler, mereka melalui tahap integrasi genom mereka dalam bentuk DNA untai ganda ke dalam kromosom. sel inang. Pada tahun 1964, H. Temin mengajukan hipotesis tentang keberadaan enzim spesifik virus yang mampu mensintesis DNA komplementer pada cetakan RNA. Pada tahun 1970 X. Temin dan S. Mizutani, serta secara independen dari mereka D. Baltimore, menemukan enzim seperti itu dalam persiapan virion ekstraseluler dari virus sarkoma Rous. Polimerase DNA yang bergantung pada RNA ini disebut transkriptase balik (reverse transcriptase).

Studi yang paling rinci adalah revertase retrovirus unggas. Setiap virion mengandung sekitar 50 molekul enzim ini. Reverse transcriptase terdiri dari dua subunit - (65 kDa) dan (95 kDa), yang hadir dalam jumlah yang sama. -subunit adalah bagian N-terminal (dua pertiga) dari -subunit.

Reverse transcriptase memiliki setidaknya tiga aktivitas enzimatik:

· DNA polimerase, menggunakan RNA dan DNA sebagai cetakan;

· Aktivitas RNase H, yang menghidrolisis RNA dalam hibrid RNA-DNA, tetapi bukan RNA untai tunggal atau ganda;

· DNA endonuklease.

Dua aktivitas pertama diperlukan untuk sintesis DNA virus, dan endonuklease tampaknya penting untuk integrasi DNA virus ke dalam genom sel inang. Subunit dari revertase memiliki ketiga aktivitas tersebut, sedangkan subunit hanya memiliki polimerase dan RNase H.

Transkriptase balik yang dimurnikan mensintesis DNA pada cetakan RNA dan DNA. Untuk memulai sintesis, revertase, seperti polimerase lainnya, membutuhkan wilayah untai ganda pendek - primer. Primer dapat berupa segmen untai tunggal dari RNA dan DNA, yang selama reaksi menjadi terikat secara kovalen dengan untai DNA yang baru disintesis.

Reverse transcriptase sebagian besar digunakan untuk mentranskripsikan messenger RNA menjadi DNA komplementer (cDNA). Reaksi transkripsi terbalik dilakukan dengan adanya inhibitor kuat aktivitas RNase. Dalam hal ini, dimungkinkan untuk memperoleh salinan DNA panjang penuh dari molekul RNA target. Oligo (dT) digunakan sebagai primer untuk transkripsi balik poli (A) -mengandung mRNA (Gbr.), Dan untuk molekul RNA tanpa ujung 3 "poli (A), oligonukleotida yang disintesis secara kimia melengkapi ujung 3" yang dipelajari RNA. Selain itu, jenis molekul RNA yang terakhir dapat diubah menjadi poli (A) -mengandung melalui E. coli poli (A) -polimerase.

Setelah sintesis untai DNA komplementer pada mRNA dan penghancuran RNA (biasanya digunakan perlakuan alkali), untai DNA kedua disintesis. Dalam hal ini, kemampuan revertase untuk membentuk jepit rambut yang saling melengkapi pada ujung 3' dari cDNA untai tunggal, yang dapat bertindak sebagai primer, digunakan. Template adalah untai pertama cDNA. Reaksi ini dapat dikatalisis oleh revertase dan DNA polimerase I. Kombinasi kedua enzim ini memungkinkan peningkatan hasil molekul cDNA untai ganda yang lengkap.

Pada akhir sintesis, untaian cDNA pertama dan kedua tetap terikat secara kovalen oleh loop jepit rambut, yang berfungsi sebagai primer dalam sintesis untaian kedua. Loop ini dibelah dengan endonuklease S1, yang secara khusus menghancurkan daerah untai tunggal asam nukleat. Ujung yang dihasilkan tidak selalu tumpul, dan untuk meningkatkan efisiensi kloning berikutnya, ujungnya diperbaiki menjadi tumpul menggunakan fragmen Klenow dari E. coli DNA polimerase I. cDNA untai ganda yang dihasilkan kemudian dapat dimasukkan ke dalam vektor kloning, diperluas dalam molekul DNA hibrid, dan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.

Transkriptase terbalik (revertase atau DNA polimerase yang bergantung pada RNA) adalah enzim yang mengkatalisis sintesis DNA pada cetakan RNA dalam proses yang disebut “ transkripsi terbalik "... Nama proses mencerminkan kebalikan dari proses transkripsi dilakukan dalam arah yang berbeda: transkrip RNA disintesis dari molekul template DNA.

Enzim ini diisolasi dari virus RNA ( retrovirus). Reverse transcriptase digunakan oleh virus tumorigenik untuk mentranskripsi mRNA ke dalam untai DNA komplementer. Ketika mempelajari retrovirus, yang genomnya diwakili oleh molekul RNA untai tunggal, ditemukan bahwa dalam proses perkembangan intraseluler, retrovirus melewati tahap integrasi genomnya dalam bentuk DNA untai ganda ke dalam kromosom. dari sel inang. Pada tahun 1964, Temin mengajukan hipotesis tentang keberadaan enzim spesifik virus yang mampu mensintesis DNA komplementer pada template RNA. Upaya yang bertujuan untuk mengisolasi enzim semacam itu berhasil, dan pada tahun 1970 Temin dan Mizutani, dan terlepas dari mereka Baltimore, menemukan enzim yang diinginkan dalam persiapan virion ekstraseluler dari virus sarkoma Rous. DNA polimerase yang bergantung pada RNA ini disebut reverse transcriptase, atau reverse transcriptase.

Studi yang paling rinci adalah revertase retrovirus unggas. Setiap virion mengandung sekitar 50 molekul enzim ini. Reverse transcriptase terdiri dari dua subunit, a (65 kDa) dan b (95 kDa), hadir dalam jumlah yang sama. Reverse transcriptase memiliki setidaknya tiga aktivitas enzimatik:

1) DNA polimerase, menggunakan RNA dan DNA sebagai cetakan;

2) aktivitas RNase H, yang menghidrolisis RNA dalam hibrid RNA-DNA;

3) aktivitas DNA endonuklease.

Dua aktivitas pertama diperlukan untuk sintesis DNA virus, dan endonuklease tampaknya penting untuk integrasi DNA virus ke dalam genom sel inang. Transkriptase balik yang dimurnikan mensintesis DNA pada cetakan RNA dan DNA (Gbr. 11).

Beras. 11. Skema untuk sintesis salinan DNA untai ganda dari molekul RNA

Untuk memulai sintesis, revertase, seperti polimerase lainnya, membutuhkan wilayah untai ganda pendek (primer). Primer dapat berupa segmen untai tunggal dari RNA dan DNA, yang selama reaksi menjadi terikat secara kovalen dengan untai DNA yang baru disintesis. Dalam rekayasa genetika, baik primer oligo- (dT) yang melengkapi ujung 3'-polyA dari mRNA dan satu set heksanukleotida "acak" dalam komposisi dan urutan (primer acak) digunakan. Ujung poli (A), oligonukleotida yang disintesis secara kimia saling melengkapi ke 3 "akhir digunakan

Reverse transcriptase sebagian besar digunakan untuk mentranskripsikan messenger RNA menjadi DNA komplementer (cDNA). Reaksi transkripsi terbalik dilakukan di bawah kondisi yang dipilih secara khusus menggunakan penghambat kuat aktivitas RNase. Dalam hal ini, dimungkinkan untuk memperoleh salinan DNA panjang penuh dari molekul RNA target. Setelah sintesis untai DNA komplementer pada mRNA dan penghancuran RNA (biasanya digunakan perlakuan alkali), untai DNA kedua disintesis. Dalam hal ini, kemampuan reverse transcriptase untuk membentuk jepit rambut yang saling melengkapi pada ujung 3' dari cDNA untai tunggal, yang dapat bertindak sebagai primer, digunakan.

Template adalah untai pertama cDNA. Reaksi ini dapat dikatalisis oleh revertase dan E. coli DNA polimerase I. Kombinasi kedua enzim ini telah terbukti meningkatkan hasil molekul cDNA untai ganda penuh. Pada akhir sintesis, untaian cDNA pertama dan kedua tetap terikat secara kovalen oleh loop jepit rambut, yang berfungsi sebagai primer dalam sintesis untaian kedua. Loop ini dibelah dengan endonuklease S1, yang secara khusus menghancurkan daerah untai tunggal asam nukleat. Ujung yang dihasilkan tidak selalu tumpul, dan untuk meningkatkan efisiensi kloning berikutnya, ujungnya diperbaiki menjadi tumpul menggunakan fragmen Klenow dari E. coli DNA polimerase I. cDNA untai ganda yang dihasilkan kemudian dapat dimasukkan ke dalam vektor kloning, diperluas dalam molekul DNA hibrid, dan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.