Kromatin: definisi, struktur dan peran dalam pembelahan sel. Tiga fraksi DNA eukariotik, lokalisasinya dalam kromosom dan fungsinya Komponen struktural dan fungsional kromatin

Kromatin, komponen utama inti sel, cukup mudah diperoleh dari inti interfase terisolasi dan dari kromosom mitosis terisolasi. Untuk melakukan ini, mereka menggunakan kemampuannya untuk berubah menjadi keadaan terlarut selama ekstraksi dengan larutan berair dengan kekuatan ionik rendah atau hanya air deionisasi. Dalam hal ini, bagian kromatin membengkak dan berubah menjadi gel. Untuk mengubah obat tersebut menjadi larutan nyata, diperlukan pengaruh mekanis yang kuat: pengocokan, pengadukan, homogenisasi tambahan. Hal ini, tentu saja, menyebabkan kerusakan sebagian struktur kromatin asli, menghancurkannya menjadi fragmen-fragmen kecil, tetapi secara praktis tidak mengubah komposisi kimianya.

Fraksi kromatin yang diperoleh dari objek berbeda mempunyai kumpulan komponen yang cukup seragam. Ditemukan bahwa komposisi kimia total kromatin dari inti interfase dan kromosom mitosis sedikit berbeda satu sama lain. Komponen utama kromatin adalah DNA dan protein, yang sebagian besar adalah protein histon dan non-histon (lihat Tabel 3).

Tabel 3. Komposisi kimia kromatin. Kandungan protein dan RNA diberikan relatif terhadap DNA

Rata-rata, sekitar 40% kromatin adalah DNA dan sekitar 60% adalah protein, termasuk protein inti spesifik - histon, membentuk 40 hingga 80% dari semua protein yang membentuk kromatin terisolasi. Selain itu, fraksi kromatin meliputi komponen membran, RNA, karbohidrat, lipid, dan glikoprotein. Pertanyaan tentang seberapa banyak komponen kecil ini termasuk dalam struktur kromatin belum terpecahkan. Jadi, misalnya, RNA mungkin merupakan RNA yang ditranskripsi yang belum kehilangan hubungannya dengan cetakan DNA. Komponen kecil lainnya mungkin mewakili zat dari fragmen membran inti yang terkopresipitasi.

Secara struktural, kromatin adalah kompleks molekul deoksiribonukleoprotein (DNP) berfilamen, yang terdiri dari DNA yang berasosiasi dengan histon (lihat Gambar 57). Oleh karena itu, nama lain untuk kromatin telah berakar - nukleohisiton. Hal ini disebabkan oleh asosiasi histon dengan DNA sehingga terbentuk kompleks asam nukleat-histon variabel yang sangat labil, di mana rasio DNA:histone kira-kira satu, yaitu. mereka hadir dalam jumlah berat yang sama. Fibril DNP berfilamen ini adalah filamen kromosom dasar atau kromatin, yang ketebalannya, tergantung pada tingkat pengemasan DNA, dapat berkisar antara 10 hingga 30 nm. Fibril DNP ini selanjutnya dapat dipadatkan untuk membentuk struktur DNP tingkat yang lebih tinggi, hingga kromosom mitosis. Peran beberapa protein non-histon justru dalam pembentukan pemadatan kromatin tingkat tinggi.

kromatin DNA

Dalam persiapan kromatin, DNA biasanya menyumbang 30-40%. DNA ini adalah molekul heliks beruntai ganda, mirip dengan DNA terisolasi murni dalam larutan air. Hal ini dibuktikan dengan banyak data eksperimen. Jadi, ketika larutan kromatin dipanaskan, terjadi peningkatan kepadatan optik larutan, yang disebut efek hiperkromik yang terkait dengan pemutusan ikatan hidrogen internukleotida antara rantai DNA, mirip dengan apa yang terjadi ketika DNA murni dipanaskan (dicairkan) .

Pertanyaan tentang ukuran dan panjang molekul DNA dalam kromatin penting untuk memahami struktur kromosom secara keseluruhan. Dengan menggunakan metode isolasi DNA standar, kromatin memiliki berat molekul 7-9 x 10 6, yang jauh lebih kecil dari berat molekul DNA dari Escherichia coli (2,8 x 10 9). Berat molekul DNA yang relatif rendah dari sediaan kromatin dapat dijelaskan oleh kerusakan mekanis pada DNA selama proses isolasi kromatin. Jika DNA diisolasi dalam kondisi yang tidak termasuk pengocokan, homogenisasi, dan pengaruh lainnya, molekul DNA yang sangat panjang dapat diperoleh dari sel. Panjang molekul DNA dari inti dan kromosom sel eukariotik dapat dipelajari dengan menggunakan metode autoradiografi optik cahaya, seperti yang dipelajari pada sel prokariotik.

Ditemukan bahwa di dalam kromosom, panjang molekul DNA linier individu (tidak seperti kromosom prokariotik) dapat mencapai ratusan mikrometer dan bahkan beberapa sentimeter. Dengan demikian, molekul DNA dengan rentang 0,5 mm hingga 2 cm diperoleh dari objek yang berbeda.Hasil ini menunjukkan bahwa terdapat kesesuaian yang erat antara perhitungan panjang DNA per kromosom dan pengamatan autoradiografi.

Setelah sel eukariotik mengalami lisis ringan, berat molekul DNA dapat langsung ditentukan dengan metode fisikokimia. Telah terbukti bahwa berat molekul maksimum molekul DNA Drosophila adalah 41 x 10 9, yang setara dengan panjang sekitar 2 cm.Pada beberapa ragi, terdapat molekul DNA per kromosom dengan berat molekul 1 x 10 8 -10 9, yang berukuran sekitar 0,5 mm .

DNA yang begitu panjang adalah satu molekul, dan bukan beberapa molekul yang lebih pendek, yang dijahit menjadi satu file menggunakan ikatan protein, seperti yang diyakini beberapa peneliti. Kesimpulan ini dicapai setelah ternyata panjang molekul DNA tidak berubah setelah pemberian obat dengan enzim proteolitik.

Jumlah total DNA yang termasuk dalam struktur inti sel, dalam genom organisme, bervariasi dari satu spesies ke spesies lainnya, meskipun pada mikroorganisme jumlah DNA per sel jauh lebih rendah dibandingkan pada invertebrata, tumbuhan tingkat tinggi, dan hewan. Jadi, seekor tikus memiliki DNA per nukleus hampir 600 kali lebih banyak daripada E. coli. Ketika membandingkan jumlah DNA per sel pada organisme eukariotik, sulit untuk membedakan korelasi antara tingkat kompleksitas organisme dan jumlah DNA per nukleus. Organisme berbeda seperti rami, bulu babi, hinggap (1,4-1,9 pg) atau arang dan ikan bullfish (6,4 dan 7 pg) memiliki jumlah DNA yang kira-kira sama.

Terdapat fluktuasi signifikan dalam jumlah DNA pada kelompok taksonomi besar. Di antara tumbuhan tingkat tinggi, jumlah DNA pada spesies yang berbeda dapat berbeda ratusan kali lipat, seperti halnya pada ikan, jumlah DNA pada amfibi berbeda puluhan kali lipat.

Beberapa amfibi memiliki DNA 10-30 kali lebih banyak di dalam intinya dibandingkan dengan inti manusia, meskipun susunan genetik manusia jauh lebih kompleks dibandingkan dengan katak. Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa jumlah “kelebihan” DNA pada organisme terorganisir rendah tidak terkait dengan pemenuhan peran genetik, atau jumlah gen berulang beberapa kali.

Tabel 4. Kandungan DNA dalam sel beberapa benda (hal, 10 -12 g)

Masalah ini ternyata dapat diselesaikan dengan mempelajari kinetika reaksi renaturasi atau hibridisasi DNA. Jika molekul DNA yang terfragmentasi dalam larutan mengalami denaturasi termal dan kemudian diinkubasi pada suhu yang sedikit lebih rendah dari suhu saat denaturasi terjadi, maka struktur untai ganda asli dari fragmen DNA dipulihkan karena penyatuan kembali rantai komplementer - renaturasi. Untuk virus DNA dan sel prokariotik, ditunjukkan bahwa laju renaturasi secara langsung bergantung pada ukuran genom; semakin besar genom, semakin besar jumlah DNA per partikel atau sel, semakin banyak waktu yang dibutuhkan untuk pendekatan acak rantai komplementer dan asosiasi ulang spesifik sejumlah besar fragmen DNA yang berbeda dalam urutan nukleotida (Gbr. 53). Sifat kurva reasosiasi DNA sel prokariotik menunjukkan tidak adanya urutan basa berulang dalam genom prokariotik; semua bagian DNA mereka membawa urutan unik, jumlah dan keragamannya mencerminkan tingkat kompleksitas komposisi genetik objek dan, akibatnya, organisasi biologis umum mereka.

Gambaran yang sangat berbeda tentang reassosiasi DNA diamati pada organisme eukariotik. Ternyata DNA mereka mengandung pecahan yang mengalami restrukturisasi pada tingkat yang jauh lebih tinggi daripada yang diperkirakan berdasarkan ukuran genom mereka, serta sebagian kecil DNA yang mengalami restrukturisasi secara perlahan, seperti rangkaian DNA unik pada prokariota. Namun, eukariota memerlukan waktu yang jauh lebih lama untuk merekondisi fraksi ini, hal ini disebabkan oleh besarnya ukuran genom mereka secara keseluruhan dan banyaknya gen unik yang berbeda.

Pada bagian DNA eukariotik yang dicirikan oleh tingkat renaturasi yang tinggi, dua subfraksi dibedakan: 1) fraksi dengan urutan yang sangat atau sering diulang, di mana bagian DNA yang serupa dapat diulang sebanyak 10 6 kali; 2) sebagian kecil dari urutan yang cukup berulang yang terjadi 10 2 -10 3 kali dalam genom. Jadi, pada tikus, fraksi DNA dengan urutan yang sering diulang mencakup 10% dari jumlah total DNA per genom dan 15% dicatat oleh fraksi dengan urutan yang cukup berulang. 75% sisanya dari seluruh DNA tikus diwakili oleh wilayah unik yang sesuai dengan sejumlah besar gen berbeda yang tidak berulang.

Fraksi dengan urutan yang sangat berulang mungkin mempunyai kepadatan apung yang berbeda dari sebagian besar DNA dan oleh karena itu dapat diisolasi dalam bentuk murni yang disebut fraksi. DNA satelit. Pada tikus, fraksi ini memiliki kepadatan 1,691 g/ml, dan bagian utama DNA adalah 1,700 g/ml. Perbedaan densitas ini ditentukan oleh perbedaan komposisi nukleotida. Misalnya, pada tikus terdapat 35% pasangan G dan C di fraksi ini, dan 42% di puncak DNA utama.

Ternyata, DNA satelit, atau fraksi DNA dengan urutan yang sering berulang, tidak terlibat dalam sintesis jenis RNA utama di dalam sel dan tidak terkait dengan proses sintesis protein. Kesimpulan ini dibuat berdasarkan fakta bahwa tidak ada jenis RNA sel (tRNA, mRNA, rRNA) yang berhibridisasi dengan DNA satelit. Akibatnya, DNA ini tidak mengandung urutan yang bertanggung jawab untuk sintesis RNA seluler, yaitu. DNA satelit bukan templat untuk sintesis RNA dan tidak terlibat dalam transkripsi.

Ada hipotesis bahwa rangkaian yang sangat berulang yang tidak terlibat langsung dalam sintesis protein dapat membawa informasi yang memainkan peran struktural penting dalam pemeliharaan dan fungsi kromosom. Ini mungkin mencakup banyak bagian DNA yang terkait dengan protein inti inti interfase (lihat di bawah), tempat asal replikasi atau transkripsi, serta bagian DNA yang mengatur proses ini.

Menggunakan metode hibridisasi asam nukleat langsung pada kromosom ( di situ) lokalisasi fraksi ini dipelajari. Untuk melakukan ini, RNA berlabel 3H-uridine disintesis pada DNA satelit terisolasi menggunakan enzim bakteri. Kemudian sediaan sitologi dengan kromosom mengalami perlakuan sedemikian rupa sehingga terjadi denaturasi DNA (suhu tinggi, lingkungan basa, dll.). Setelah ini, RNA berlabel 3H ditempatkan pada preparasi dan hibridisasi antara DNA dan RNA tercapai. Autoradiografi mengungkapkan bahwa sebagian besar label terlokalisasi di zona penyempitan primer kromosom, di zona daerah sentromeriknya. Tanda tersebut juga terdeteksi di bagian lain kromosom, tetapi sangat lemah (Gbr. 54).

Selama 10 tahun terakhir, kemajuan besar telah dicapai dalam pembelajaran DNA sentromerik, terutama pada sel ragi. Begitu juga S. cerevisiae DNA sentromerik terdiri dari daerah berulang 110 bp. Ini terdiri dari dua wilayah yang dilestarikan (I dan III) dan elemen pusat (II), diperkaya dengan pasangan basa AT. Kromosom Drosophila memiliki struktur DNA sentromer yang serupa. DNA sentromerik manusia (DNA satelit alfoid) terdiri dari tandem monomer 170 bp yang disusun menjadi kelompok dimer atau pentamer, yang kemudian membentuk rangkaian besar 1-6 x 10 3 bp. Satuan terbesar ini diulangi 100-1000 kali. Protein sentromer khusus dikomplekskan dengan DNA sentromer spesifik ini dan terlibat dalam pembentukannya kinetokor, struktur yang memastikan hubungan kromosom dengan mikrotubulus gelendong dan pergerakan kromosom dalam anafase (lihat di bawah).

DNA dengan urutan yang sangat berulang juga telah ditemukan daerah telomer kromosom banyak organisme eukariotik (dari ragi hingga manusia). Pengulangan paling sering ditemukan di sini, yang mencakup 3-4 nukleotida guanin. Pada manusia, telomer mengandung 500-3000 pengulangan TTAGGG. Bagian DNA ini melakukan peran khusus - untuk membatasi ujung kromosom dan mencegah pemendekannya selama proses replikasi berulang.

Baru-baru ini ditemukan bahwa rangkaian DNA yang sangat berulang dari kromosom interfase berikatan secara spesifik dengan protein lamin yang mendasari selubung inti dan berpartisipasi dalam penahan kromosom interfase dekondensasi yang diperpanjang, sehingga menentukan urutan lokalisasi kromosom dalam volume inti interfase.

Ada dugaan bahwa DNA satelit mungkin terlibat dalam pengenalan daerah homolog kromosom selama meiosis. Menurut asumsi lain, daerah dengan urutan yang sering berulang berperan sebagai pemisah (spacer) antara berbagai unit fungsional DNA kromosom, misalnya antar replika (lihat di bawah).

Ternyata, fraksi urutan yang cukup berulang (dari 10 2 hingga 10 5 kali) termasuk dalam kelas wilayah DNA beraneka ragam yang memainkan peran penting dalam proses pembuatan peralatan sintesis protein. Fraksi ini mencakup gen DNA ribosom, yang dapat diulang 100 hingga 1000 kali pada spesies berbeda. Fraksi ini mencakup daerah yang berulang kali untuk sintesis semua tRNA. Selain itu, beberapa gen struktural yang bertanggung jawab untuk sintesis protein tertentu juga dapat diulang berkali-kali, diwakili oleh banyak salinan. Ini adalah gen untuk protein kromatin - histon, yang diulang hingga 400 kali.

Selain itu, fraksi ini mencakup bagian DNA dengan urutan berbeda (masing-masing 100-400 pasangan nukleotida), juga berulang berkali-kali, tetapi tersebar di seluruh genom. Peran mereka belum sepenuhnya jelas. Telah dikemukakan bahwa bagian DNA tersebut mungkin mewakili daerah akseptor atau pengatur gen yang berbeda.

Jadi, DNA sel eukariotik memiliki komposisi yang heterogen, mengandung beberapa kelas rangkaian nukleotida: rangkaian yang sering diulang (> 10 6 kali), termasuk dalam fraksi DNA satelit dan tidak ditranskripsi; sebagian kecil dari rangkaian yang cukup berulang (10 2 -10 5), mewakili blok gen sejati, serta rangkaian pendek yang tersebar di seluruh genom; sebagian kecil dari urutan unik yang membawa informasi untuk sebagian besar protein sel.

Berdasarkan gagasan ini, perbedaan jumlah DNA yang diamati pada organisme yang berbeda menjadi jelas: perbedaan tersebut mungkin disebabkan oleh proporsi kelas DNA tertentu yang tidak sama dalam genom organisme. Jadi, misalnya, pada amfibi Amfiuma(yang memiliki DNA 20 kali lebih banyak daripada manusia) urutan berulang menyumbang hingga 80% dari total DNA, pada bawang - hingga 70, pada salmon - hingga 60%, dll. Kekayaan informasi genetik yang sebenarnya harus tercermin dalam pecahan rangkaian unik. Kita tidak boleh lupa bahwa dalam molekul DNA kromosom asli yang tidak terfragmentasi, semua wilayah yang mencakup rangkaian unik, sedang, dan sering diulang dihubungkan ke dalam rantai DNA kovalen raksasa tunggal.

Molekul DNA bersifat heterogen tidak hanya di wilayah urutan nukleotida yang berbeda, tetapi juga berbeda dalam aktivitas sintetiknya.

Replikasi DNA eukariotik

Kromosom bakteri bereplikasi sebagai satu unit struktural, mempunyai satu titik awal replikasi dan satu titik terminasi. Jadi DNA sirkular bakteri adalah satu replika. Dari titik awal, replikasi berlangsung dalam dua arah yang berlawanan, sehingga ketika DNA disintesis, terbentuklah apa yang disebut mata replikasi, dibatasi di kedua sisinya oleh garpu replikasi, yang terlihat jelas selama pemeriksaan mikroskopis elektron pada kromosom yang bereplikasi virus dan bakteri. .

Dalam sel eukariotik, organisasi replikasi memiliki sifat yang berbeda - polireplikasi.Seperti yang telah disebutkan, dengan masuknya 3 HT secara berdenyut, label ganda muncul di hampir semua kromosom mitosis. Artinya secara bersamaan terdapat banyak tempat replikasi dan banyak asal replikasi otonom dalam kromosom interfase. Fenomena ini dipelajari lebih rinci dengan menggunakan autoradiografi molekul berlabel yang diisolasi dari DNA (Gbr. 55).Jika sel diberi label pulsa dengan 3 HT, maka dalam mikroskop cahaya pada tanda tangan DNA yang diisolasi, area perak tereduksi dapat dilihat. dalam bentuk garis putus-putus. Ini adalah bagian kecil DNA yang berhasil direplikasi, dan di antara keduanya terdapat bagian DNA yang tidak direplikasi yang tidak meninggalkan autoradiograf dan oleh karena itu tetap tidak terlihat. Dengan bertambahnya waktu kontak 3 NT dengan sel, ukuran segmen tersebut bertambah, dan jarak antara segmen tersebut berkurang. Dari percobaan tersebut, laju replikasi DNA pada organisme eukariotik dapat dihitung secara akurat. Kecepatan pergerakan garpu replikasi ternyata 1-3 kb. per menit pada mamalia, sekitar 1 kb. per menit pada beberapa tumbuhan, yang jauh lebih rendah dibandingkan laju replikasi DNA pada bakteri (50 kb per menit). Dalam percobaan yang sama, struktur polireplikasi DNA kromosom eukariotik dibuktikan secara langsung: sepanjang DNA kromosom, di sepanjang itu, terdapat banyak tempat replikasi independen - replika. Menurut jarak antara titik tengah replika penandaan yang berdekatan, mis. Berdasarkan jarak antara dua titik awal replikasi yang berdekatan, ukuran masing-masing replika dapat ditentukan. Rata-rata ukuran replika hewan tingkat tinggi adalah sekitar 30 µm atau 100 kb. Oleh karena itu, seharusnya terdapat 20.000-30.000 replika pada kelompok mamalia haploid. Pada eukariota tingkat rendah, replikanya lebih kecil, sekitar 40 kb. Jadi, di Drosophila terdapat 3500 replikan per genom, dan di ragi – 400. Seperti disebutkan, sintesis DNA dalam replika terjadi dalam dua arah yang berlawanan. Hal ini dapat dengan mudah dibuktikan dengan autoradiografi: jika sel, setelah label pulsa, dibiarkan terus mensintesis DNA selama beberapa waktu dalam media tanpa 3 HT, maka inklusi dalam DNA akan berkurang, akan terjadi pengenceran label, dan seterusnya. autoradiograf akan memungkinkan untuk melihat pola simetris di kedua sisi wilayah yang direplikasi, sehingga mengurangi jumlah butiran perak tereduksi.

Ujung atau garpu yang bereplikasi dalam sebuah replika berhenti bergerak ketika bertemu dengan garpu dari replika yang berdekatan (pada titik terminal yang sama dengan replika yang berdekatan). Pada titik ini, bagian replika dari replika tetangga digabungkan menjadi rantai kovalen tunggal dari dua molekul DNA yang baru disintesis. Pembagian fungsional DNA kromosom menjadi replika bertepatan dengan pembagian struktural DNA menjadi domain atau loop, yang basanya, sebagaimana telah disebutkan, disatukan oleh ikatan protein.

Jadi, semua sintesis DNA pada satu kromosom terjadi melalui sintesis independen pada banyak replika individu, diikuti dengan penggabungan ujung segmen DNA yang berdekatan. Arti biologis dari sifat ini menjadi jelas ketika membandingkan sintesis DNA pada bakteri dan eukariota. Jadi, kromosom monoreplikon bakteri dengan panjang 1600 mikron disintesis dengan kecepatan sekitar setengah jam. Jika molekul DNA kromosom mamalia sepanjang satu sentimeter juga direplikasi sebagai struktur monoreplikon, hal ini akan memakan waktu sekitar satu minggu (6 hari). Tetapi jika kromosom tersebut mengandung beberapa ratus replikan, maka replikasi lengkapnya hanya akan memakan waktu sekitar satu jam. Padahal, waktu replikasi DNA pada mamalia adalah 6-8 jam. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa tidak semua replika kromosom individu diaktifkan pada saat yang bersamaan.

Dalam beberapa kasus, penyertaan semua replika secara simultan atau munculnya asal replikasi tambahan diamati, yang memungkinkan penyelesaian sintesis semua kromosom dalam waktu yang sangat singkat. Fenomena ini terjadi pada awal embriogenesis beberapa hewan. Diketahui saat menghancurkan telur katak bercakar Xenopus laevis Sintesis DNA hanya membutuhkan waktu 20 menit, sedangkan pada kultur sel somatik proses ini memakan waktu sekitar satu hari. Gambaran serupa diamati pada Drosophila: pada tahap awal embrio, seluruh sintesis DNA di dalam nukleus membutuhkan waktu 3,5 menit, dan dalam sel kultur jaringan – 600 menit. Pada saat yang sama, ukuran replika dalam sel kultur ternyata hampir 5 kali lebih besar dibandingkan pada embrio.

Sintesis DNA terjadi secara tidak merata sepanjang kromosom individu. Ditemukan bahwa dalam kromosom individu, replika aktif dirangkai menjadi kelompok, unit replikasi, yang mencakup 20-80 asal replikasi. Ini mengikuti analisis tanda tangan DNA, di mana pemblokiran segmen replikasi seperti itu diamati. Dasar lain dari gagasan keberadaan blok atau kelompok replika atau unit replikasi adalah eksperimen dengan memasukkan analog timidin, 5'-bromodeoxyuridine (BrdU), ke dalam DNA. Dimasukkannya BrdU dalam kromatin interfase mengarah pada fakta bahwa selama mitosis, area dengan BrdU berkondensasi pada tingkat yang lebih rendah (kondensasi tidak mencukupi) dibandingkan area di mana timidin dimasukkan. Oleh karena itu, daerah kromosom mitosis yang mencakup BrdU akan mengalami pewarnaan yang lemah selama pewarnaan diferensial. Hal ini memungkinkan untuk menentukan urutan penggabungan BrdU menggunakan kultur sel yang disinkronkan, yaitu. urutan sintesis DNA sepanjang satu kromosom. Ternyata prekursor dimasukkan ke dalam sebagian besar kromosom. Dimasukkannya bagian-bagian yang berbeda terjadi secara berurutan selama periode S. Setiap kromosom dicirikan oleh stabilitas urutan replikasi yang tinggi sepanjang panjangnya dan memiliki pola replikasi spesifiknya sendiri.

Kelompok replika, digabungkan menjadi unit replikasi, berhubungan dengan protein matriks inti (lihat di bawah), yang, bersama dengan enzim replikasi, membentuk apa yang disebut. clusterosomes adalah zona dalam inti interfase di mana sintesis DNA terjadi.

Urutan aktivasi unit replikasi kemungkinan besar ditentukan oleh struktur kromatin di wilayah ini. Misalnya, zona heterokromatin konstitutif (dekat sentromer) biasanya direplikasi pada akhir periode S; juga, pada akhir periode S, bagian dari heterokromatin fakultatif berlipat ganda (misalnya, kromosom X pada wanita). mamalia). Urutan replikasi bagian kromosom berkorelasi sangat jelas pada waktunya dengan pola pewarnaan diferensial kromosom: segmen R termasuk dalam segmen yang bereplikasi awal, segmen G berhubungan dengan bagian kromosom dengan replikasi terlambat. Segmen C (sentromer) adalah tempat replikasi terkini.

Karena dalam kromosom yang berbeda ukuran dan jumlah kelompok segmen yang berbeda warnanya berbeda, hal ini menciptakan gambaran awal dan akhir replikasi yang tidak sinkron dari kromosom yang berbeda secara keseluruhan. Bagaimanapun, urutan awal dan akhir replikasi kromosom individu dalam suatu himpunan tidaklah acak. Ada urutan reproduksi kromosom yang ketat relatif terhadap kromosom lain dalam himpunan.

Durasi proses replikasi masing-masing kromosom tidak secara langsung bergantung pada ukurannya. Jadi, kromosom manusia yang besar dari kelompok A (1-3) diberi label di seluruh periode S, serta kromosom yang lebih pendek dari kelompok B (4-5).

Dengan demikian, sintesis DNA dalam genom eukariotik dimulai hampir bersamaan pada semua kromosom nukleus pada awal periode S. Tetapi pada saat yang sama, penyertaan replika yang berbeda secara berurutan dan asinkron terjadi baik di bagian kromosom yang berbeda maupun di kromosom yang berbeda. Urutan replikasi wilayah genom tertentu ditentukan secara genetik. Pernyataan terakhir ini dibuktikan tidak hanya dengan pola pencantuman label pada segmen periode S yang berbeda, tetapi juga oleh fakta bahwa terdapat urutan ketat kemunculan puncak sensitivitas gen tertentu terhadap mutagen selama periode S. -periode.

1. Jenis kromatin

2. Gen, pengatur jarak

3. Urutan nukleotida dalam DNA

4. Organisasi spasial DNA

1. Selama istirahat antara tindakan pembelahan, bagian tertentu dari kromosom dan seluruh kromosom tetap kompak. Daerah kromatin ini disebut heterokromatin. Itu melukis dengan baik.

Setelah pembelahan inti, kromatin mengendur dan dalam bentuk ini disebut eukromatin. Heterokromatin tidak aktif dalam kaitannya dengan transkripsi, dan dalam kaitannya dengan replikasi DNA, ia berperilaku berbeda dari eukromatin.

Heterokromatin fakultatif hanya kadang-kadang heterokromatik. Ini informatif, yaitu mengandung gen. Ketika memasuki keadaan eukromatik, gen-gen ini mungkin tersedia untuk transkripsi. Dari dua kromosom homolog, salah satunya mungkin heterokromatik. Heterokromatisasi fakultatif ini bersifat spesifik jaringan dan tidak terjadi pada jaringan tertentu.

Heterokromatin konstitutif selalu heterokromatik. Ini terdiri dari rangkaian basa yang berulang-ulang, tidak informatif (tidak mengandung gen) dan oleh karena itu selalu tidak aktif dalam kaitannya dengan transkripsi. Anda bisa melihatnya Dan selama fisi nuklir. Dia berkencan:

Paling sering di sentromer;

Di ujung kromosom (termasuk satelit);

Dekat penyelenggara nukleolus;

Dekat gen 5S-RNA.

Heterokromatin, terutama fakultatif, selama interfase dapat bersatu menjadi kromosenter yang sangat berwarna, yang dalam banyak kasus terletak di tepi inti sel atau nukleolus.

2. Setiap kromosom adalah heliks ganda DNA yang berkesinambungan, yang pada organisme tingkat tinggi terdiri dari lebih dari 10 8 pasangan basa. Pada kromosom tumbuhan dan hewan tingkat tinggi, setiap heliks ganda DNA (diameter 2 nm) memiliki panjang satu hingga beberapa sentimeter. Sebagai hasil dari puntiran yang berulang-ulang, ia dikemas menjadi kromatid yang panjangnya beberapa mikrometer.

Gen didistribusikan secara linier di sepanjang heliks ganda ini, yang bersama-sama membentuk 25% DNA.

Genadalah unit fungsional DNA, berisi informasi untuk sintesis polipeptida atau RNA. Panjang gen rata-rata adalah sekitar 1000 pasangan basa. Urutan basa pada setiap gen bersifat unik.

Di antara gen-gen tersebut terdapat pengatur jarak- bentangan DNA yang tidak informatif dengan panjang yang bervariasi (terkadang lebih dari 20.000 pasangan basa), yang penting untuk mengatur transkripsi gen tetangga.

Spacer yang ditranskripsi dihentikan selama transkripsi bersama dengan gen, dan salinan pelengkapnya muncul di pra-i-RNA di kedua sisi salinan gen. Bahkan di dalam gen itu sendiri terdapat (hanya pada eukariota dan virusnya) urutan non-informatif, yang disebut intron, yang juga ditranskripsi. Selama pemrosesan, semua salinan intron dan sebagian besar salinan spacer dikeluarkan oleh enzim.

Spacer yang tidak dapat ditranskripsi terjadi antara gen untuk histon, serta antara gen untuk rRNA.

Gen yang berlebihan diwakili oleh sejumlah besar (hingga 10 4 atau lebih) salinan identik. Ini adalah gen:

Untuk tRNA;

5S-RNA dan histon;

Untuk produk yang disintesis dalam jumlah banyak.

Salinannya terletak tepat di samping satu sama lain dan diselesaikan dengan spacer yang identik. Pada bulu babi, gen histon H4, H2b, H2a, dan Hi terletak satu demi satu, dan rangkaian gen ini diulangi dalam DNA lebih dari 100 kali.

3. Urutan berulang - Ini adalah urutan nukleotida yang muncul berkali-kali dalam DNA. Cukup berulang barisan – barisan dengan panjang rata-rata 300 pasangan basa dengan 10 2 -10 4 pengulangan. Ini termasuk gen yang berlebihan, serta sebagian besar spacer.

Sangat berulang barisan dengan pengulangan 10 5 -10 6 membentuk heterokromatin konstitutif. Mereka selalu tidak informatif. Ini sebagian besar adalah urutan pendek, paling sering 7-10 ditemukan di dalamnya dan jarang - hanya 2 (misalnya, AT) atau, sebaliknya, lebih dari 300 pasangan nukleotida. Mereka berkumpul bersama, dengan satu rangkaian berulang yang mengikuti rangkaian lainnya. DNA kromatin yang sangat berulang disebut “DNA satelit” karena perilakunya selama prosedur fraksinasi analitik. Sekitar 75% dari seluruh kromatin tidak terlibat dalam transkripsi: ini adalah urutan yang sangat berulang dan pengatur jarak yang tidak dapat ditranskripsi.

4. Dalam kromatin terisolasi bagian heliks ganda DNA membungkus molekul histon, sehingga superheliks orde pertama muncul di sini. Kompleks DNA dengan histon disebut nukleosom. Mereka berbentuk cakram atau lensa dan dimensinya sekitar 10 x 10 x 5 nm. Satu nukleosom termasuk:

8 molekul histon:

Tetramer pusat dari dua molekul H3 dan dua H4; dan secara terpisah dua H 2a dan H 2 b;

Bagian DNA (sekitar 140 pasangan basa) yang membentuk sekitar 1,25 putaran heliks dan terikat erat pada tetramer pusat.

Di antara nukleosom terdapat bagian heliks yang terdiri dari 30-100 pasangan basa tanpa struktur superheliks; Histon mengikat di sini Hai

Dalam kromatin yang dijahit DNA selanjutnya diperpendek melalui penggulungan lebih lanjut yang kurang dipahami (superkoil tingkat tinggi) yang tampaknya difiksasi oleh histon Hi (dan beberapa protein non-histon). Selama transisi ke interfase, eukromatin mengendur karena beberapa superkoil tingkat tinggi terlepas. Hal ini mungkin terjadi sebagai akibat dari perubahan konformasi histon dan melemahnya interaksi antar molekul Hi.Struktur kromatin setebal 10-25 nm (benang atau heliks kromatin utama) juga terlihat selama interfase.

1. Jenis kromatin

2. Gen, pengatur jarak

3. Urutan nukleotida dalam DNA

4. Organisasi spasial DNA

1. Selama istirahat antara tindakan pembelahan, bagian tertentu dari kromosom dan seluruh kromosom tetap kompak. Daerah kromatin ini disebut heterokromatin. Itu melukis dengan baik.

Paling sering di sentromer;

Di ujung kromosom (termasuk satelit);

Dekat penyelenggara nukleolus;

Dekat gen 5S-RNA.

Heterokromatin, terutama fakultatif, selama interfase dapat bersatu menjadi kromosenter yang sangat berwarna, yang dalam banyak kasus terletak di tepi inti sel atau nukleolus.

Gen didistribusikan secara linier di sepanjang heliks ganda ini, yang bersama-sama membentuk 25% DNA.

Genadalah unit fungsional DNA, berisi informasi untuk sintesis polipeptida atau RNA. Panjang gen rata-rata adalah sekitar 1000 pasangan basa. Urutan basa pada setiap gen bersifat unik.

Spacer yang tidak dapat ditranskripsi terjadi antara gen untuk histon, serta antara gen untuk rRNA.

Gen yang berlebihan diwakili oleh sejumlah besar (hingga 10 4 atau lebih) salinan identik. Ini adalah gen:

Untuk tRNA;

5S-RNA dan histon;

Untuk produk yang disintesis dalam jumlah banyak.

8 molekul histon:

Tetramer pusat dari dua molekul H3 dan dua H4; dan secara terpisah dua H 2a dan H 2 b;

Bagian DNA (sekitar 140 pasangan basa) yang membentuk sekitar 1,25 putaran heliks dan terikat erat pada tetramer pusat.

Di antara nukleosom terdapat bagian heliks yang terdiri dari 30-100 pasangan basa tanpa struktur superheliks; Histon mengikat di sini Hai

Aktif secara transkripsi kromatin - gen yang mengirimkan informasinya melalui sintesis RNA, sebagai akibat dari despiralisasi lebih lanjut, ia semakin mengendur. Menurut beberapa data, di bagian heliks DNA yang sesuai, histon Hi tidak ada atau diubah secara kimia, misalnya terfosforilasi.

Struktur nukleosom juga berubah atau hancur total (pada gen r-RNA di nukleolus). Heliks ganda berputar di tempat-tempat tertentu. Proses-proses ini rupanya melibatkan protein non-histon tertentu yang terakumulasi di daerah transkripsi DNA.

Pertanyaan 38. Himpunan kromosom

/. genom. Ploidi sel

2. Kromosom politen

1. Seluruh dana informasi genetik setiap inti sel - genom- didistribusikan di antara sejumlah kromosom (n) yang konstan. Jumlah ini khusus untuk setiap spesies atau subspesies. Pada cacing gelang kuda jumlahnya 1, pada cacing jagung - 10, pada manusia - 23, pada alga Netrium digitus - sekitar 600. Kromosom dari set yang sama berbeda sesuai dengan kriteria berikut:

ukuran;

Gambar kromometer;

Posisi penyempitan;

Tergantung pada multiplisitas set kromosom - ploidi- sel membelah:

Menjadi haploid;

Diploid;

Poliploid.

Haploid disebut sel yang mengandung satu set kromosom (“), misalnya sel kelamin.

Jika sel mengandung satu set kromosom ganda (2 P), mereka diploid, karena informasi genetik disajikan dua kali di dalamnya. Hampir semua sel somatik tumbuhan dan hewan tingkat tinggi bersifat diploid. Mereka mengandung satu set kromosom ayah dan satu set kromosom ibu.

DI DALAM poliploid sel memiliki beberapa set kromosom (4 P, 8 P, 16 P, dst). Sel-sel ini seringkali aktif secara metabolik, seperti banyak sel hati pada mamalia.

Sel haploid terbentuk dari sel diploid melalui meiosis, dan sel diploid terbentuk dari sel haploid melalui pembuahan.

Sel poliploid muncul dari sel diploid melalui endomitosis - pembelahan inti yang terputus sebelum waktunya: setelah replikasi lengkap dan pemisahan kromatid, kromosom anak tetap berada dalam satu inti sel, bukannya didistribusikan di antara dua inti. Proses ini dapat diulang berkali-kali.

Anomali selama pembentukan sel germinal dapat menyebabkan poliploidi seluruh organisme. Pada replikasi yang tidak lengkap Beberapa bagian genom, seperti heterokromatin, tidak bereplikasi dan tetap diploid setelah endomitosis, berbeda dengan bagian lain yang menjadi poliploid.

Amplifikasi gen - ini adalah replikasi super ganda ketika hanya gen tertentu yang direplikasi dan menjadi poliploid (gen untuk rRNA dalam nukleolus).

Kromosom inti diploid dapat dikelompokkan berpasangan, dua kromosom homolog. Kebanyakan dari mereka (yang disebut autosom) identik berpasangan. Hanya dua kromosom seks yang menentukan jenis kelamin seseorang yang tidak sama pada laki-laki - ini adalah kromosom X dan Y (heterokromosom). Sebagian besar kromosom Y ditempati oleh heterokromatin konstitutif. Wanita memiliki dua kromosom X. Namun, pada kupu-kupu, burung, dan sejumlah hewan lainnya, situasinya sebaliknya: jantan memiliki himpunan XX, betina memiliki himpunan XY.

2. Kromosom politen(kromosom raksasa) mengandung DNA berkali-kali lebih banyak daripada DNA normal. Mereka tidak mengubah bentuknya sepanjang siklus pembelahan dan mencapai panjang hingga 0,5 mm dan ketebalan 25 mikron. Mereka ditemukan, misalnya, di kelenjar ludah dipteran (lalat dan nyamuk), di makronukleus ciliata, dan di jaringan ovarium kacang-kacangan. Paling sering mereka terlihat dalam bilangan haploid, karena kromosom homolog berpasangan erat. Politenia terjadi sebagai akibat dari endoreplikasi. Dibandingkan dengan endomitosis, ini adalah proses pembelahan yang lebih berkurang - setelah replikasi, kromatid tidak dipisahkan (proses ini diulangi berkali-kali). Di mana bentangan DNA yang berbeda dikalikan untuk berbagai tingkat:

Daerah sentromer - tidak signifikan;

Area paling informatif kira-kira 1000 kali;

Beberapa - lebih dari 30.000 kali.

Itu sebabnya kromosom politen Mereka adalah kumpulan kromatid yang tak terhitung jumlahnya yang tidak terpisah sepenuhnya. Kromatid diregangkan, kromomer homolog membentuk cakram gelap yang letaknya berdekatan di sepanjang kromosom. Cakram-cakram ini dipisahkan oleh garis-garis yang lebih terang. Mungkin, pada kromatid, satu cakram dan satu garis perantara terbentuk, selain pengatur jarak, satu gen (lebih jarang beberapa gen), yang tampaknya terletak di dalam cakram. Kromosom politen sangat miskin heterokromatin.

Pada kromosom politen disk terpisah terkadang membengkak pouf(Balbiani berdering). Di sana, kromatid homolog terpisah satu sama lain, kromomer homolog menjauh, dan struktur longgar kromatin yang aktif secara transkripsi muncul. Puff mengandung lebih sedikit histon Hi dibandingkan cakram dan malah mengandung enzim RNA polimerase (yang menunjukkan sintesis RNA). Ada juga sedikit histon Hi di pita perantara, tetapi ada RNA polimerase dan, mungkin, setidaknya terjadi sintesis kecil RNA.

Dalam persiapan kromatin, DNA biasanya menyumbang 30-40%. DNA ini adalah molekul heliks beruntai ganda. DNA kromatin memiliki berat molekul 7-9*10 6 . Massa DNA yang relatif kecil dari sediaan dapat dijelaskan oleh kerusakan mekanis pada DNA selama proses isolasi kromatin.

Jumlah total DNA yang termasuk dalam struktur inti sel, dalam genom organisme, bervariasi dari satu spesies ke spesies lainnya. Ketika membandingkan jumlah DNA per sel pada organisme eukariotik, sulit untuk membedakan korelasi antara tingkat kompleksitas organisme dan jumlah DNA per nukleus. Organisme yang berbeda, seperti rami, bulu babi, hinggap (1,4-1,9 pg) atau arang dan ikan bullfish (6,4 dan 7 pg), memiliki jumlah DNA yang kira-kira sama.

DNA satelit, atau fraksi DNA dengan urutan yang sering diulang, mungkin terlibat dalam pengenalan daerah homolog kromosom selama meiosis. Menurut asumsi lain, daerah tersebut berperan sebagai pemisah (spacer) antara berbagai unit fungsional DNA kromosom.

Ternyata, sebagian kecil dari rangkaian yang cukup berulang (dari 10 2 hingga 10 5 kali) termasuk dalam kelas wilayah DNA beraneka ragam yang memainkan peran penting dalam proses metabolisme. Fraksi ini mencakup gen DNA ribosom, bagian yang berulang berulang kali untuk sintesis semua tRNA. Selain itu, beberapa gen struktural yang bertanggung jawab untuk sintesis protein tertentu juga dapat diulang berkali-kali, diwakili oleh banyak salinan (gen untuk protein kromatin - histon).

Jadi, DNA sel eukariotik memiliki komposisi yang heterogen dan mengandung beberapa kelas urutan nukleotida:

urutan yang sering diulang (>10 6 kali), termasuk dalam fraksi DNA satelit dan tidak ditranskripsi;

sebagian kecil dari rangkaian yang cukup berulang (10 2 -10 5), mewakili blok gen sejati, serta rangkaian pendek yang tersebar di seluruh genom;

sebagian kecil dari urutan unik yang membawa informasi untuk sebagian besar protein sel.

DNA organisme prokariotik adalah satu molekul siklik raksasa. DNA kromosom eukariotik merupakan molekul linier yang terdiri dari replika-replikasi dengan ukuran berbeda-beda yang disusun secara tandem (satu demi satu). Ukuran replika rata-rata adalah sekitar 30 mikron. Dengan demikian, genom manusia harus mengandung lebih dari 50.000 replika, bagian DNA yang disintesis sebagai unit independen. Replikon ini memiliki titik awal dan titik akhir untuk sintesis DNA.

Mari kita bayangkan bahwa dalam sel eukariotik, setiap DNA kromosom, seperti pada bakteri, merupakan satu replika. Dalam hal ini, pada kecepatan sintesis 0,5 mikron per menit (untuk manusia), penggandaan ulang kromosom pertama dengan panjang DNA sekitar 7 cm akan memakan waktu 140.000 menit, atau sekitar tiga bulan. Faktanya, karena struktur polireplikasi molekul DNA, seluruh proses memakan waktu 7-12 jam.

Penghapusan histon H1 dari kromatin yang aktif secara transkripsi 1*2* . Eksperimen awal oleh J. Bonner (AS) menunjukkan bahwa DNA dalam kromatin merupakan matriks yang jauh lebih buruk daripada DNA bebas. Berdasarkan pengamatan ini, diusulkan bahwa histon adalah penekan transkripsional.

L. N. Ananyeva dan Yu.V. Kozlov Laboratorium kami berupaya mencari tahu apakah semua histon memiliki efek penghambatan atau hanya sebagian saja. Untuk melakukan ini, histon dihilangkan dari kromatin sel kanker asites Ehrlich tikus dengan ekstraksi dengan larutan NaCl dengan konsentrasi yang meningkat secara bertahap. Persiapan yang dihasilkan berfungsi sebagai cetakan untuk sintesis RNA. Transkripsi dilakukan dengan adanya RNA polimerase dari Escherichia coli, E. coli yang diambil secara berlebihan, dan campuran nukleosida trifosfat. Dalam kisaran NaCl 0,4-0,6 M, terjadi dekondensasi bahan yang tajam, yang diwujudkan dalam pembengkakan gel nuklir dan bahkan pembubaran DNP (jika pemrosesan mekanis lebih lanjut dilakukan). Ini terbukti menghilangkan histone HI secara selektif. Bersamaan dengan dekondensasi kromatin, terjadi peningkatan tajam dalam aktivitas matriksnya (Gbr. 26). Peningkatan lebih lanjut dalam konsentrasi garam dalam larutan ekstraksi menyebabkan hilangnya histon lain dan sedikit, namun tidak terlalu terasa, peningkatan tambahan aktivitas matriks.

0 ton. Dengan demikian, kemampuan hibridisasi mengungkapkan persentase pengulangan urutan dalam RNA yang disintesis (menurut hasil yang diperoleh L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov dan penulis); b - parameter utama sintesis RNA pada matriks yang berbeda: DNA bebas, kromatin asli (DNP 0) dan kromatin yang histon H1 telah dihilangkan dengan ekstraksi dengan NaCl 0,6 M (DNP 0,6). Sintesis RNA dilakukan menggunakan Escherichia coli RNA polimerase dengan adanya nukleosida trifosfat berlabel: [14 C]-ATP dan [γ- 32 P]-ATP atau [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP disertakan di seluruh RNA, dan [γ- 32 P] - hanya di awal rantai (pp x A- atau pp x G). Dengan kata lain, penyertaan [ 32 P] memberikan informasi tentang inisiasi sintesis, dan [ 14 C] - tentang sintesis RNA itu sendiri. Dalam beberapa percobaan, 3-4 menit setelah dimulainya inkubasi, rifampisin, suatu antibiotik, ditambahkan ke media, yang mencegah inisiasi rantai RNA baru, tetapi tidak mempengaruhi sintesis yang sudah dimulai, yaitu pemanjangan. 1 - penyertaan [14 C] - UMP, 2 - sama setelah penambahan rifampisin; 3 - penyertaan [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - sama setelah menambahkan rifampisin. Berdasarkan kurva inklusi ini, dimungkinkan untuk menghitung parameter utama reaksi RNA polimerase (berdasarkan hasil yang diperoleh Yu.V. Kozlov dan penulis)">
Beras. 26. Pengaruh histon H1 terhadap aktivitas cetakan DNA dalam kromatin. a - efek penghilangan protein dari kromatin (1) pada aktivitas matriks (2) kromatin dengan adanya RNA polimerase eksogen dari Escherichia coli, serta pada kemampuan hibridisasi RNA yang disintesis (3). Protein histon dan non-histon diekstraksi dengan peningkatan konsentrasi larutan NaCl. Dalam kisaran NaCl 0,4 M - NaCl 0,6 M, histon H1 dihilangkan secara selektif. RNA yang disintesis dihibridisasi dengan kelebihan DNA pada nilai C0 t menengah. Dengan demikian, kemampuan hibridisasi mengungkapkan persentase pengulangan urutan dalam RNA yang disintesis (menurut hasil yang diperoleh L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov dan penulis); b - parameter utama sintesis RNA pada matriks yang berbeda: DNA bebas, kromatin asli (DNP 0) dan kromatin yang histon H1 telah dihilangkan dengan ekstraksi dengan NaCl 0,6 M (DNP 0,6). Sintesis RNA dilakukan menggunakan Escherichia coli RNA polimerase dengan adanya nukleosida trifosfat berlabel: [14 C]-UTP dan [γ- 32 P]-ATP atau [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP disertakan di seluruh RNA, dan [γ- 32 P] - hanya di awal rantai (pp x A- atau pp x G). Dengan kata lain, penyertaan [ 32 P] memberikan informasi tentang inisiasi sintesis, dan [ 14 C] - tentang sintesis RNA itu sendiri. Dalam beberapa percobaan, 3-4 menit setelah dimulainya inkubasi, rifampisin, suatu antibiotik, ditambahkan ke media, yang mencegah inisiasi rantai RNA baru, tetapi tidak mempengaruhi sintesis yang sudah dimulai, yaitu pemanjangan. 1 - penyertaan [14 C] - UMP, 2 - sama setelah penambahan rifampisin; 3 - penyertaan [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - sama setelah menambahkan rifampisin. Berdasarkan kurva inklusi ini, parameter utama reaksi RNA polimerase dapat dihitung (berdasarkan hasil yang diperoleh Yu.V. Kozlov dan penulis)

Sifat-sifat yang disintesis secara in vitro RNA melalui hibridisasi dengan DNA tikus total. Dalam hal ini, sebagian kecil RNA yang disintesis pada rangkaian DNA berulang terdeteksi. Ternyata dalam kromatin transkripsi rangkaian DNA berulang terbatas. Namun, setelah ekstraksi kromatin dengan NaCl 0,6 M, ketika histon H1 dihilangkan, sifat hibridisasi RNA yang disintesis pada matriks kromatin tersebut dan pada matriks DNA bebas menjadi tidak dapat dibedakan. Kami berhipotesis bahwa histon H2a, H2b, H3 dan H4 (kemudian disebut berbeda - histon cukup kaya lisin dan kaya arginin) tidak terlibat dalam penekanan transkripsi, tetapi memainkan peran struktural murni dalam organisasi kromatin, sedangkan histon H1 (di masa lalu) terminologi histone , kaya lisin) adalah penghambat sintesis RNA. Pada saat yang sama, ini juga merupakan faktor penyebab kondensasi kromatin (lihat di atas).

Kemudian, Yu.V. Kozlov mempelajari mekanisme penghambatan transkripsi oleh histon H1, sekali lagi pada sistem bebas sel dengan RNA polimerase yang diisolasi dari E, coli. Pengaruh histone H1 pada proses inisiasi dan elongasi dipelajari (lihat Gambar 26, Tabel 4). Ternyata hal ini beberapa kali mengurangi jumlah rantai RNA yang diinisiasi pada matriks kromatin asli. Pemanjangan sangat terhambat: RNA polimerase membaca tidak lebih dari 100-150 bp. DNA dan kemudian berhenti. Sementara itu, pada kromatin yang histon H1nya telah dihilangkan, RNA polimerase membaca beberapa ribu pasangan nukleotida sekaligus, dan panjang rantai tidak berbeda dengan panjang rantai yang disintesis pada cetakan DNA bebas. Benar, pada DNA bebas, dibandingkan dengan kromatin yang histon H1 telah dihilangkan, proses inisiasi sintesis RNA terjadi lebih efisien. Disimpulkan bahwa histon H1, dengan mengkondensasi kromatin, menciptakan hambatan pada jalur RNA polimerase dan dengan demikian menghentikan sintesis RNA.

* (DNPM adalah DNP yang diisolasi dengan perlakuan urea yang larut sepenuhnya tetapi mempertahankan histon H1.)

Mengingat data modern tentang struktur solenoid fibril 300 A-DNP, yang bergantung pada keberadaan histone H1, hasil ini mudah dijelaskan. Memang benar, RNA polimerase jelas tidak dapat membaca lebih dari 100 bp di solenoid. karena pembatasan topologi murni.

Menurut hipotesis kami, ketika gen diaktifkan, histone H1 harus dihilangkan. Namun, verifikasinya tidak dapat dilakukan pada saat itu. Baru-baru ini muncul bukti hilangnya histon H1 dari kromatin selama aktivasi gen. Jadi, ketika daerah kromatin yang ditranskripsi secara aktif, misalnya mini-nukleolus, diisolasi dari sejumlah organisme, histon H1 tidak terdeteksi di dalamnya. Hal ini juga tidak ditemukan pada ragi, dimana semua gen berpotensi aktif.

Hasil yang meyakinkan diperoleh di laboratorium A. D. Mirzabekova V. L. Karpov dan O. V. Preobrazhenskaya. Mereka mengembangkan metode yang disebut “histone shadow hybridization.” Untuk melakukan hal ini, DNA diikat silang dengan histon menggunakan dimetil sulfat dalam kondisi di mana, rata-rata, satu molekul histon diikat silang per segmen DNA yang panjangnya sekitar 200-300 bp. DNA kemudian difragmentasi dan dilakukan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida dua dimensi. Setelah berjalan ke arah pertama, histon yang menempel pada DNA dihancurkan oleh proteinase dan DNA yang sudah bebas dipercepat ke arah kedua. Karena selama putaran pertama elektroforesis histone yang berbeda memperlambat pergerakan fragmen DNA dengan cara yang berbeda, setelah putaran kedua beberapa diagonal terungkap (Gbr. 27). Biasanya ada tiga yang terlihat jelas: satu berhubungan dengan DNA awalnya bebas, yang lain dengan kompleks DNA asli dengan histon inti, dan yang ketiga (bawah) dengan kompleks DNA asli dengan histon H1. DNA yang dihasilkan ditransfer ke filter dan dihibridisasi dengan sampel tertentu. Jika bagian genom yang tidak aktif diambil untuk hibridisasi, misalnya spacer gen ribosom Drosophila, maka label tersebut dikaitkan dengan semua diagonal. Namun, jika gen kejutan panas, yang ditranskripsi dalam sel tempat kromatin diisolasi, digunakan sebagai sampel, maka hibridisasi dengan diagonal yang sesuai dengan kompleks DNA dengan histon H1 melemah tajam atau tidak ada sama sekali. Dengan kata lain, di dalam inti, sebelum perlekatan, DNA dari gen yang ditranskripsi tidak memiliki kontak dengan histon H1.

Beras. 27. Hilangnya histone H1 dan histone inti pada saat aktivasi transkripsi. Percobaan dilakukan pada sel kultur D. melanogaster (a, b) dalam kondisi budidaya pada suhu 25° (a) dan kejutan panas (b). Dalam kasus a, tidak ada ekspresi gen kejutan panas; dalam kasus b, gen ini sangat aktif. Selain itu, percobaan dilakukan pada embrio yang mengalami dekorionisasi (c), di mana ekspresi gen kejutan panas berada pada tingkat rata-rata. Setelah pembentukan kompleks DNA-protein, isolasi fragmen DNA, pemisahan dua dimensi (dalam arah vertikal setelah penghilangan protein) dan transfer ke filter, filter yang sama digabungkan dengan sampel yang berbeda: dengan wilayah pengatur gen kejutan panas p70 (HS-5") ; dengan wilayah pengkodean gen yang sama (kode TS); dengan sampel penyisipan yang tidak aktif secara transkripsi ke dalam gen rDNA (tidak aktif). Tiga diagonal terlihat pada gen yang tidak aktif ; 1 - DNA bebas, 2 - Kompleks DNA dengan histon oktamer; 3 - Kompleks DNA Dengan histon H1 Terlihat melemahnya atau hilangnya kompleks DNA-histon ketika kromatin diaktifkan (menurut hasil yang diperoleh A.D. Mirzabekov dkk.)

Meskipun semua data yang tersedia saat ini, diambil secara individual, memungkinkan interpretasi lain, namun jika digabungkan, data tersebut memberikan bukti kuat yang mendukung penghilangan histon H1 dari kromatin aktif. Namun mekanisme proses ini masih belum jelas.

Nasib nukleosom selama aktivasi kromatin 2* [ 154-157]. Yang kurang jelas adalah pertanyaan tentang nasib histon H2a, H2b, H3 dan H4, yang membentuk inti nukleosom. Pada percobaan di atas Yu.V.Kozlova kehadiran mereka hampir tidak berpengaruh pada transkripsi DNA oleh RNA polimerase E.coli. Ketika mempelajari produk hidrolisis kromatin eukariotik, banyak penulis menemukan bahwa nukleosom mengandung DNA gen aktif, yaitu DNA gen aktif juga disusun menjadi nukleosom. Data diperoleh dari bahan percobaan yang besar A.D.Mirzabekova dkk. menunjukkan bahwa nukleosom yang mengandung DNA yang ditranskripsi secara aktif pada dasarnya dibangun dengan cara yang sama seperti nukleosom yang mengandung DNA tidak aktif, meskipun beberapa kontak DNA-histon di dalamnya diubah.

Eksperimen juga dilakukan pada hibridisasi dengan bayangan histon, yang telah dibahas pada bagian sebelumnya (lihat Gambar 27). Persiapan dengan diagonal dibuat dari sel Drosophila di mana gen kejutan panas tidak bekerja sama sekali, yaitu dimatikan, atau bekerja pada tingkat rendah, atau, akhirnya, distimulasi oleh kejutan panas untuk transkripsi aktif. Dalam semua kasus, sampel kontrol adalah DNA pengatur jarak gen ribosom, yang dihibridisasi di ketiga diagonal, termasuk diagonal yang berasal dari kompleks DNA dengan histon inti.

Gen kejutan panas juga berhibridisasi secara normal dengan diagonal sel yang tidak ditranskripsi. Namun, dengan bahan yang diperoleh dari sel dengan transkripsi gen kejutan panas yang moderat, hibridisasi diagonal kedua berkurang secara signifikan. Akhirnya, jika diagonal diperoleh dari sel dengan sintesis mRNA kejutan panas yang sangat aktif, maka diagonal kedua tidak terlihat sama sekali selama hibridisasi (seperti yang ketiga), dan hanya diagonal yang berhubungan dengan DNA yang tidak berikatan silang yang terungkap. dengan histon Kesimpulan umum yang diambil dari penelitian menggunakan metode ikatan silang DNA-protein adalah bahwa selama transkripsi, RNA polimerase yang bergerak sepanjang rantai DNA secara reversibel bertabrakan dengan nukleosom dengan DNA dan mentranskripsi DNA yang hampir telanjang. Jika tingkat transkripsi rendah dan hanya ada sedikit RNA polimerase yang merayap di sepanjang DNA, maka nukleosom memiliki waktu untuk terbentuk kembali di area yang telah dilewati RNA polimerase. Jika transkripsi aktif, maka struktur nukleosom DNA tidak punya waktu untuk pulih, dan DNA umumnya tidak memiliki histon. Pada saat yang sama, didalilkan bahwa organisasi nukleosom dalam kromatin aktif praktis tidak berbeda dengan kromatin tidak aktif. Baru-baru ini, A.D. Mirzabekov dkk. mereproduksi eksperimen tentang pelekatan histon ke DNA menggunakan metode yang berbeda, dengan memperlakukan inti yang diisolasi dengan preparat platinum. Metode ini lebih ringan dibandingkan dimetil sulfat. Pada dasarnya hasil yang sama diperoleh.

Seiring dengan kumpulan data ini, terdapat penelitian yang penulisnya sampai pada kesimpulan yang agak berbeda. W. Garrard dan A. Worsel(AS), mempelajari keadaan gen aktif dalam kromatin menggunakan hidrolisis nuklease dan mikroskop elektron, sampai pada kesimpulan bahwa nukleosom tetap berada dalam kromatin aktif, tetapi mengalami perubahan struktural seperti berbalik, berubah menjadi setengah nukleosom. Akibatnya, periodisitas elektroferogram hidrolisat dengan nuklease mikrokokus adalah ~200 bp. digantikan dengan periodisitas ~100 bp. Dengan mikroskop elektron, jumlah manik menjadi dua kali lipat dan ukurannya mengecil. Diasumsikan bahwa RNA polimerase dapat melewati nukleosom yang tidak terlipat tersebut.

Kemungkinan ini juga didukung oleh data yang diperoleh T.Koller(Swiss). Dia mengembangkan metode orisinal untuk mempelajari nukleosom. Sel-sel tersebut diberi psoralen, suatu zat yang mengikat DNA dan kemudian menghubungkan dua untai DNA bersama-sama dengan sinar UV. Namun, jika DNA merupakan bagian dari nukleosom, reaksinya dengan psoralen tidak terjadi. Oleh karena itu, jika DNA yang diisolasi dari sel yang diberi perlakuan didenaturasi dengan adanya formaldehida (mencegah renaturasi DNA), maka pada mikroskop elektron, gelembung-gelembung bergantian (dua untai DNA yang terdenaturasi) sesuai dengan nukleosom yang dihubungkan satu sama lain oleh untaian tunggal (silang -terkait, tidak mampu melakukan denaturasi) terlihat pada DNA.DNA) sesuai dengan penghubung antarnukleosom. Pertama, gen RNA ribosom yang ditranskripsi secara aktif, yang merupakan bagian dari struktur ekstrakromosom dan oleh karena itu mudah dianalisis menggunakan mikroskop elektron, dipelajari. Di dalamnya, vesikel yang berhubungan dengan nukleosom tidak terlihat, yaitu, kemungkinan besar, histon dihilangkan seluruhnya dari daerah yang ditranskripsi. Menariknya, di daerah yang tidak ditranskripsi, spacer, gelembung DNA (nukleosom) terlihat jelas.

Namun, hasil berbeda diperoleh pada minikromosom SV40, yang ditranskripsi oleh RNA polimerase II daripada RNA polimerase I seperti gen RNA ribosom (Gbr. 28). Kromosom mini yang aktif secara transkripsi diidentifikasi karena adanya rantai RNA yang tumbuh (biasanya satu atau dua) pada kromosom tersebut. Kromosom mini tersebut membentuk 1-2% dari semua kromosom mini yang diisolasi dari sel. Namun, mereka mengandung jumlah vesikel yang sama dengan minikromosom yang tidak aktif, dan ukurannya sama pada kedua kasus. Hal yang paling menarik adalah bahwa rantai RNA berasal dari penghubung dan langsung dari vesikel, yaitu RNA polimerase tampaknya mentranskripsi nukleosom. Data ini mendukung pembukaan nukleosom dan transkripsinya oleh RNA polimerase.

Semua hasil di atas tidak langsung, dan oleh karena itu percobaan di masa depan harus memberikan solusi akhir terhadap pertanyaan tentang nasib nukleosom selama transkripsi.

Modifikasi histon dan varian histon: hubungan dengan kromatin aktif. Pada awal tahun 60an, Allfrey (AS) menunjukkan bahwa histon dapat mengalami berbagai modifikasi. Jadi, histon HI difosforilasi pada gugus ε-amino lisin. Histon H3 dan H4 diasetilasi pada gugus yang sama. Ada sejumlah modifikasi lain (metilasi, ADP - ribosilasi, ubiquitinasi, dll.).

Segera diasumsikan bahwa modifikasi enzimatik histon dapat mempengaruhi struktur kromatin dan aktivitasnya. Memang, ketika lisin difosforilasi, satu muatan positif dalam histon digantikan oleh muatan negatif, ketika menarik, muatan positif hilang, dll. Berkat perubahan muatan inilah histon yang dimodifikasi dapat dipisahkan dari histon yang tidak dimodifikasi ketika melakukan elektroforesis gel dalam buffer asetat dengan urea. Jadi, dalam elektroforesis resolusi tinggi, histone H4 menghasilkan bukan hanya satu, tetapi empat pita, sesuai dengan molekul yang tidak diasetilasi dan diasetilasi pada satu, dua, dan tiga residu lisin. Di jaringan yang berbeda, rasio antar fraksi berubah. Histon H3, H2a, H2b dan H1 dibagi menjadi beberapa fraksi (derajat asetilasi dan fosforilasi berbeda).

Sayangnya, masih belum ada metode yang baik untuk memisahkan kromatin aktif dan tidak aktif secara transkripsi dan oleh karena itu sulit untuk menghubungkan bentuk histon yang berubah ke keadaan kromatin tertentu. Data yang paling menarik dalam arah ini diperoleh dengan cara yang sama W.Alfrey(AMERIKA SERIKAT). Selama hidrolisis kromatin aktif, ia mengisolasi partikel yang tidak biasa yang mengendap dalam gradien sukrosa lebih lambat daripada nukleosom biasa dan, menurut pendapat penulis, berhubungan dengan nukleosom yang tidak terlipat. Partikel-partikel ini, disebut partikel A, mengandung semua histon inti. Tidak seperti nukleosom normal, gugus SH histon H3 dalam partikel A dapat diakses oleh sejumlah reagen kimia, dan karena itu, partikel A dapat dipisahkan dari nukleosom melalui fraksinasi pada kolom kloromerkubenzoat (reagen pengikat gugus SH). Partikel A mengandung peningkatan kandungan bentuk histon asetat. Penulis berpendapat bahwa asetilasi histon selama aktivasi kromatin menyebabkan terbukanya partikel nukleosom, dan ini, pada gilirannya, meningkatkan ketersediaan gugus SH dari histon H3.

Beberapa histon dikodekan oleh lebih dari satu jenis gen. Akibatnya, terdapat beberapa varian histon yang sedikit berbeda dalam urutan asam aminonya. Terkadang dalam proses entogenesis terjadi penggantian alami satu subkelas histon dengan subkelas histon lainnya. Namun masih belum jelas apakah hal ini memiliki signifikansi regulasi. Masalahnya, tentu saja, juga dapat diselesaikan setelah pengembangan metode yang memadai untuk mengisolasi kromatin yang aktif secara transkripsi.

Posisi khusus ditempati oleh histone H1. Ada varian yang sangat berbeda dalam organisasi strukturalnya. Pilihan ini, misalnya, histone H5, yang menggantikan sebagian besar histone H1 dalam inti eritrosit unggas. Kemungkinan besar, substitusi ini merupakan faktor penting dalam penghentian total transkripsi dalam inti eritrosit. Pada sel normal terdapat varian histone H1 – histone H1 0. Kandungannya merupakan sebagian kecil dari total histon H1. Ada sejumlah data yang kontradiktif bahwa H1 0 dikaitkan dengan gen aktif atau, sebaliknya, dengan gen yang dimatikan secara stabil. Pertanyaannya tetap terbuka.

Protein HMG mungkin terlibat dalam pengorganisasian kromatin aktif 1* . Selain histon, kromatin mengandung banyak protein non-histon yang fungsinya tidak diketahui. Di antara mereka, tentu saja, harus ada protein struktural, enzim yang menjamin proses replikasi, transkripsi, dll., dan protein pengatur. E.Jones(Inggris Raya) berusaha mengisolasi komponen protein yang ada dalam jumlah yang cukup besar untuk memungkinkan analisis dan identifikasi. Dia sebenarnya berhasil mengisolasi kelas protein nuklir baru, yang dia sebut sebagai “kelompok protein dengan mobilitas tinggi” ( kelompok mobilitas tinggi), atau protein HMG. Namanya bergantung pada mobilitas tinggi protein ini selama elektroforesis gel. Fraksi protein HMG dipecah menjadi beberapa komponen individual. Diantaranya, yang paling representatif dan berkarakteristik baik adalah HMG-1, HMG-2, HMG-14 dan HMG-17.

Protein HMG memiliki berat molekul rendah. Mereka diperkaya dengan asam amino basa dan dikarboksilat. Kandungan protein HMG kurang lebih 7% dari kandungan histon. Ini dapat bervariasi dalam inti dari berbagai jenis sel. Dalam konteks ini, kami paling tertarik pada protein HMG-14 dan HMG-17, yang buktinya telah diperoleh mengenai kemungkinan perannya dalam aktivasi transkripsi. H.Weintraub(AS) menunjukkan bahwa ekstraksi inti dengan NaCl 0,35 M, yang mengekstraksi protein HMG, mengubah beberapa sifat kromatin aktif, yang dipulihkan ketika HMG-14 dan HMG-17 ditambahkan ke kromatin. G.Dixon(Kanada) menemukan protein ini dalam komposisi nukleosom yang dilepaskan dari kromatin pada tahap awal hidrolisis oleh nuklease, yang menurut datanya, diperkaya dengan DNA gen yang aktif secara traksi.

berakhir [32 P] dan kemudian dihibridisasi dengan hnRNA dari sel L. Hibrida dideteksi dengan filtrasi gel. 1 - DNA CH-2; 2 - DNA CH-3; 3 - total DNA sel (menurut hasil yang diperoleh V.V. Bakaev et al.)">
Beras. 29. Kemungkinan hubungan protein HMG (14 dan 17) dengan kromatin aktif. a - deteksi subnukleosom dalam hidrolisat kromatin menggunakan nuklease mikrokokal. Pada berbagai tahap hidrolisis, fraksi subnukleosom tertentu muncul. Elektroforesis dilakukan dalam gel poliakrilamida dalam kondisi nondenaturasi. Pewarnaan dengan etidium bromida, fluorografi pada kolom kanan; b - penggunaan elektroforesis dua dimensi untuk menentukan komposisi protein subnukleosom CH2 dan CH3. Kromatin berlabel protein [14 C] dihidrolisis dengan nuklease mikrokokus dan dipisahkan dengan elektroforesis dua dimensi (arah pertama - media non-disosiasi, arah ke-2 - larutan natrium dodesil sulfat), setelah itu autoradiografi dilakukan untuk mengidentifikasi protein. Huruf-huruf tersebut menunjukkan protein HMG yang pada saat percobaan belum teridentifikasi dengan protein yang diketahui. Sekarang kita tahu bahwa A adalah HMG-1, B adalah HMG-2, E adalah HMG-14, G adalah HMG-17, protein HMG F dan H tidak teridentifikasi dengan jelas, mungkin H juga berhubungan dengan HMG-17. Terlihat bahwa protein HMG merupakan bagian dari mononukleosom (MH-2 dan MH-3) dan subnukleosom CH-2 (HMG-17) dan CH-3 (HMG-14); c - demonstrasi pengayaan DNA dari urutan transkripsi CH-2 dan CH-3. DNA yang diisolasi dari pita CH-2 dan CH-3 sel L diberi label pada ujung 5" [32 P] dan kemudian dihibridisasi dengan hnRNA dari sel L. Hibrida dideteksi dengan filtrasi gel. 1 - DNA CH-2; 2 - DNA CH-3; 3 - DNA total sel (menurut hasil yang diperoleh V.V. Bakaev dkk.)

V.V.Bakaev di laboratorium kami sampai pada kesimpulan tentang peran protein HMG dalam transkripsi menggunakan pendekatan eksperimental yang berbeda. Selama analisis elektroforesis hidrolisat kromatin, ia mengungkapkan, selain nukleosom dan oligonukleosom, komponen kecil dengan mobilitas lebih besar. Mereka disebut subnukleosom dan, jelas, merupakan produk pemecahan nukleosom lebih lanjut (Gbr. 29, Tabel 5). Subnukleosom CH-7 berhubungan dengan nukleosom yang telah kehilangan masing-masing satu molekul H2a dan H2b dan mengandung DNA yang diperpendek sebesar 40 bp; CH-6 berhubungan dengan kompleks DNA yang panjangnya 30-40 bp. dengan histon H1, yang dibelah dari MH-2 selama transformasi menjadi MH-1. CH-4 mengandung segmen DNA dan sepasang histon H2a dan H2b (produk reaksi MH-1→CH-7→CH-4). Dua subnukleosom, CH-3 dan CH-2, terdiri dari DNA pendek dan protein HMG (HMG-14 dan HMG-17). Dapat diasumsikan bahwa mereka adalah daerah penghubung yang terkait dengan protein HMG-14 dan HMG-17, yang masuk ke dalam larutan setelah pencernaan nukleosom yang sesuai. CH-2 dan CH-3 dikumpulkan, DNA diisolasi darinya, diberi label akhir, dan hibridisasinya dengan RNA nuklir dipelajari. Ternyata DNA dari CH-2 dan CH-3 berhibridisasi jauh lebih efisien dengan RNA inti dibandingkan DNA sel total yang terfragmentasi ke ukuran yang sama.

Oleh karena itu disimpulkan bahwa DNA yang terkait dengan protein HMG-14 dan HMG-17 kemungkinan besar berasal dari kromatin yang aktif secara transkripsi.

Semua data ini, diperoleh secara independen, menunjukkan bahwa HMG-14 dan HMG-17 terkait dengan aktivasi gen. Namun mekanisme aktivasinya masih belum jelas. HMG-14 dan HMG-17 tidak dapat menjadi faktor utama yang mengaktifkan gen tersebut, karena keduanya kurang spesifik. Orang mungkin berpikir bahwa mereka terlibat dalam mempertahankan “konformasi terbuka” kromatin aktif.

Pada tahun-tahun berikutnya, muncul skeptisisme mengenai peran HMG-14 dan HMG-17 dalam aktivasi kromatin. Khususnya, baru-baru ini A.D.Mirzabekov dkk. menggunakan metode hibridisasi dengan jaringan protein, kami memperoleh data penipisan kromatin aktif HMG-14 dan HMG-17. Namun karena semua data di atas bersifat tidak langsung, secara umum pertanyaan tentang peran protein HMG tetap terbuka dan memerlukan penelitian lebih lanjut.

Topoisomerase I dan protein yang terikat erat pada DNA adalah bagian dari kromatin yang aktif secara transkripsi 1* . S. Elgin (AS), diikuti oleh sejumlah penulis lain, menunjukkan bahwa kromatin yang aktif secara transkripsi mengandung topoisomerase I, suatu enzim yang melemaskan DNA superkoil. Hal ini pertama kali ditunjukkan pada sediaan sitologi kromosom Drosophila polytene menggunakan antibodi fluoresen terhadap topoisomerase I. Enzim ini memasukkan pemutusan untai tunggal ke dalam DNA dan secara kovalen berikatan dengan ujung 5" DNA yang dihasilkan. Hal ini memungkinkan DNA berputar bebas di lokasi pemutusan. Kemudian fragmen dibelah, dan ikatan fosfodiester dalam DNA dipulihkan. Dalam hal berat molekul, topoisomerase I, atau disingkat topo I, bersifat heterogen. Komponen terberat memiliki berat molekul 135 kDa, dan yang paling banyak terwakili - 80 kDa. Ketika dibelah oleh proteinase, polipeptida yang lebih pendek terbentuk, yang tetap mempertahankan aktivitas enzimatik.

Antibiotik captothecin adalah penghambat topo I, dan ketika sel diobati dengannya, enzim tersebut membentuk ikatan silang kovalen dengan DNA di tempat ia berada pada saat kontak dengan antibiotik. Lokasi tautan silang tersebut dapat dengan mudah ditentukan dengan memetakan menggunakan tag hibridisasi. Dengan cara ini, ditemukan bahwa topo I hadir secara eksklusif di wilayah transkripsi genom, yaitu, kemungkinan besar, ia bekerja sama dengan RNA polimerase II, menghilangkan putaran DNA lokal yang terjadi selama transkripsi.

Komponen protein lain yang terdeteksi di daerah transkripsi genom adalah sekumpulan protein yang terikat erat pada DNA (DBP), yang sesuai dengan DNA sel yang ditranskripsi (lihat Bagian 3.4).

S.V. Razin dan V.V. Chernokhvostov Upaya telah dilakukan untuk mengkarakterisasi kompleks DNA dengan PBP secara rinci. Fragmen DNA sepanjang 1-2 kb yang terkait dengan PBP dimurnikan dan dilakukan ultrasentrifugasi kesetimbangan dalam gradien kepadatan CsCl. Kepadatan apungnya ternyata sama 1,7 gram/cm3, yaitu, ini berhubungan dengan kepadatan apung dari DNA bebas yang tidak mengandung protein. Dalam percobaan yang dirancang untuk menjelaskan paradoks ini, ditemukan bahwa pengobatan dengan DRNase menyebabkan penurunan kepadatan apung kompleks menjadi 1,62-1,65 gram/cm3. Perkiraan perhitungan berdasarkan kepadatan protein ( ~ 1,3 gram/cm3) dan RNA ( ~ 1,9 gram/cm3), (tunjukkan bahwa untuk setiap molekul DNA ada sekitar 150 kDa protein dan sekitar 200 nukleotida RNA. Sifat RNA ini tidak jelas, tetapi bukti telah diperoleh mengenai homogenitas dan urutan nukleotida yang unik.

Oleh karena itu, banyak hal mengenai kompleks DNA-PBP yang masih misterius, namun kemungkinan besar mereka memainkan peran penting dalam pengorganisasian mesin transkripsi. Penelitian mereka saat ini sedang berlangsung.

Demetilasi DNA pada gen yang ditranskripsi 2*. Ciri penting lainnya dari kromatin aktif adalah demetilasi bagian DNA tertentu. Pada gen yang tidak aktif, sebagian besar residu sitidil dalam rangkaian CG dimetilasi. Pertama B.V.Vanyushin di laboratorium A.N.Belozersky telah ditunjukkan bahwa DNA dalam jaringan berbeda dari hewan yang sama berbeda dalam tingkat metilasi C. Berdasarkan hal ini, disarankan bahwa metilasi mungkin memiliki peran pengaturan dalam diferensiasi. Belakangan, banyak penulis menunjukkan bahwa beberapa daerah pada DNA yang ditranskripsi mengalami undermetilasi. Metode analisis yang paling banyak digunakan adalah perbandingan peta restriksi yang diperoleh dengan enzim restriksi yang mengenali sekuens yang sama, seperti CGCG atau CCGG, namun memiliki sensitivitas metilasi yang berbeda. Salah satu enzim restriksi memotong rangkaian yang termetilasi dan tidak termetilasi, dan enzim lainnya hanya memotong rangkaian yang tidak termetilasi. Biasanya, sekuens yang tidak termetilasi terlokalisasi di wilayah regulasi gen. Wilayah gen itu sendiri, bagian pengkodenya, dan intronnya dimetilasi secara merata baik pada gen yang bekerja maupun yang diam.

Ketika DNA yang termetilasi dimasukkan ke dalam sel, ekspresinya di dalam sel berkurang secara signifikan dibandingkan dengan DNA yang tidak termetilasi. Data telah diperoleh yang menurutnya, selama replikasi DNA, keadaan metilasi DNA direproduksi: jika salah satu rantai dimetilasi, maka rantai yang baru terbentuk juga dimetilasi di tempat yang sama.

Pada suatu waktu tampaknya metilasi-demetilasi sitidin dalam sekuens CG di wilayah regulasi adalah mekanisme utama inaktivasi-aktivasi gen. Namun belakangan muncul sejumlah data yang bertentangan dengan hipotesis tersebut. Dengan demikian, DNA SV40 yang termetilasi sepenuhnya CG diekspresikan secara aktif. Pada saat yang sama, metilsitosin tidak terdeteksi sama sekali pada DNA Drosophila. Ada kemungkinan bahwa demetilasi C merupakan konsekuensi dari aktivasi gen dan hanya melanggengkan aktivitas transkripsional. Di sini, seperti di bidang lain dalam mempelajari aktivasi gen, diperlukan eksperimen baru.