"Švicarski nož" virusne vojske: otkrivena tajna reverzne transkriptaze. Reverzna transkriptaza Revertaza reverzna transkriptaza
Naziva se tako jer se većina transkripcijskih procesa u živim organizmima odvija u drugom smjeru, naime, iz molekule DNA sintetizira se RNA transkript.
Povijest
Reverznu transkriptazu otkrio je Howard Temin na Sveučilištu Wisconsin-Madison, a neovisno o tome David Baltimore 1970. godine. Oba istraživača su 1975. zajedno s Renatom Dulbeccom dobila Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu.
Točnost transkripcije
Reverzna transkripcija s RNA na DNA popraćena je visokom razinom translacijskih pogrešaka, što razlikuje reverznu transkriptazu od ostalih DNA polimeraza. Ove pogreške mogu dovesti do mutacija odgovornih za otpornost virusa na lijekove.
Značaj za viruse
Reverzna transkripcija je nužna, posebice, za životni ciklus retrovirusa, na primjer, virusa humane imunodeficijencije i humanog limfoma T-stanica tipa 1 i 2. Nakon što virusna RNA uđe u stanicu, reverzna transkriptaza sadržana u virusnim česticama sintetizira joj komplementarnu DNK, a zatim dovršava drugi lanac na ovoj DNK lancu, kao na šabloni.
Značaj za eukariote
Primjena
Antiretrovirusna terapija
Uloga u genetskom inženjeringu
U genetskom inženjeringu reverzna transkriptaza se koristi za proizvodnju cDNA, kopije eukariotskog gena koji ne sadrži introne. Za to se iz tijela izolira zrela mRNA (kodirajući odgovarajući genski produkt: protein, RNA) i s njom se kao predloškom provodi reverzna transkripcija. Rezultirajuća cDNA može se transformirati u bakterijske stanice kako bi se dobio transgeni proizvod.
vidi također
Napišite recenziju o "Reverzna transkriptaza"
Bilješke (uredi)
Izvod koji karakterizira reverznu transkriptazu
- O! O! O!- Pa, zbogom, Bolkonski! Zbogom, kneže; Dođite ranije na večeru - začuli su se glasovi. - Mi se brinemo o tebi.
"Pokušajte što više hvaliti red u isporuci namirnica i ruta kada razgovarate s carem", rekao je Bilibin, prateći Bolkonskog na frontu.
"I htio bih pohvaliti, ali ne mogu, dokle god znam", odgovorio je Bolkonski smiješeći se.
- Pa, općenito, pričajte što više. Njegova strast je publika; ali on sam ne voli govoriti i ne zna kako, kao što ćete vidjeti.
Na izlazu je car Franz samo pozorno gledao u lice princa Andrije, koji je stajao na dogovorenom mjestu između austrijskih časnika, i kimnuo mu svojom dugom glavom. Ali nakon što je napustio jučerašnje krilo, ađutant je ljubazno prenio Bolkonskome carevu želju da mu pruži audijenciju.
Car Franz ga je primio, stojeći nasred sobe. Prije nego što je započeo razgovor, princ Andrija je bio pogođen činjenicom da je car kao da je bio zbunjen, ne znajući što bi rekao, i pocrvenio.
- Reci mi, kada je bitka počela? žurno je upitao.
Odgovorio je princ Andrija. Nakon ovog pitanja slijedila su druga, jednako jednostavna pitanja: „Je li Kutuzov zdrav? prije koliko je vremena napustio Krems?" itd. Car je govorio takvim izrazom kao da se cijela njegova svrha sastoji samo u postavljanju određenog broja pitanja. Odgovori na ta pitanja, kako je bilo previše očito, nisu ga mogli zanimati.
- U koje vrijeme je bitka počela? upitao je car.
`` Ne mogu reći Vaše Veličanstvo u koje vrijeme je bitka počela s fronta, ali u Durensteinu, gdje sam ja bio, vojska je krenula u napad u 6 sati navečer'', rekao je Bolkonsky, oživjevši se i u ovaj slučaj pod pretpostavkom da će u svojoj glavi moći predstaviti gotovi opis svega što je znao i vidio.
Ali car se nasmiješio i prekinuo ga:
- Koliko milja?
- Kamo i kamo, Vaše Veličanstvo?
- Od Durensteina do Kremsa?
“Tri i pol milje, vaše veličanstvo.
- Jesu li Francuzi napustili lijevu obalu?
- Kako su javili izviđači, posljednji su noću prešli splavi.
- Ima li dovoljno krme u Kremsu?
- Krma nije isporučena u toj količini...
Car ga je prekinuo.
- U koje vrijeme je general Schmitt ubijen?
- U sedam sati, mislim.
- U 7:00. Jako tužno! Jako tužno!
Car je rekao da je zahvalan i naklonio se. Knez Andrija je izašao i odmah su ga sa svih strana okružili dvorjani. Umiljate su ga oči gledale sa svih strana i čule su se nježne riječi. Jučerašnji pomoćnik pomoćne zgrade predbacio mu je što nije ostao u palači i ponudio mu svoju kuću. Prišao je ministar vojni čestitajući mu orden Marije Terezije 3. stupnja, kojim ga je car odlikovao. Caričin ga je komornik pozvao k njezinom veličanstvu. Nadvojvotkinja ga je također htjela vidjeti. Nije znao kome da odgovori i nekoliko je sekundi sabrao misli. Ruski ga je poslanik uhvatio za rame, odveo do prozora i počeo s njim razgovarati.
Suprotno Bilibinovim riječima, vijest koju je donio dočekana je s radošću. Određena je služba zahvale. Kutuzova je Marije Terezije dodijelila Veliki križ, a priznanja je dobila cijela vojska. Bolkonski je primao pozive sa svih strana i morao je cijelo jutro posjećivati glavne dostojanstvenike Austrije. Završivši svoje posjete u pet sati navečer, mentalno sastavljajući pismo ocu o bitci i o svom putovanju u Brunn, princ Andrej se vratio kući u Bilibin. Na trijemu kuće koju je zauzeo Bilibin stajala je ležaljka napola krcata stvarima, a Franz, Bilibin sluga, s mukom vukući kovčeg, izašao je kroz vrata.
Revertaza je enzim koji sintetizira cDNA na RNA predlošku.
Kod nekih virusa genom nije DNK, kao i obično, već RNA. Takvi virusi nazivali su se retrovirusi (retro - reverse). Godine 1970. D. Baltimore i H.M. Temin otkrili su mehanizam za prijenos informacija s virusne RNK na DNK, t.j. nasuprot onome što se događa u stanicama viših organizama. Taj se proces naziva reverzna transkripcija, a enzim koji ga obavlja zvao se reverzna transkriptaza, odnosno revertaza (revertaza).
Reverzna transkriptaza, ili reverzna transkriptaza, [lat. transscriptio- rewriting) - enzim RNA-ovisna DNA polimeraza, uz pomoć koje se provodi reverzna transkripcija - sinteza DNA na RNA matrici; kodirani genomima nekih virusa koji sadrže RNA i pokretnim genetskim elementima genoma viših organizama, važnog "alata" za genetski inženjering. Reverzna transkriptaza ima najmanje tri enzimske aktivnosti:
1) DNA polimeraza, koristeći i RNA i DNA kao šablonu;
2) aktivnost RNaze H, koja hidrolizira RNA kao dio RNA-DNA hibrida, ali ne jednolančane ili dvolančane RNA, i
3) Aktivnost DNA endonukleaze.
Neovisno jedan o drugome otkrili D. Baltimore i H. Temin 1970. u virusima koji nose tumore koji sadrže RNA (Nobelova nagrada za 1975. zajedno s R. Dulbeccom).
Dakle, reverzne transkriptaze mogu sintetizirati DNA na RNA šablonu polimerizacijom četiri deoksiribonukleozid trifosfata. I baš kao i DNA polimeraze, one funkcioniraju samo kada su napunjene.
Reverzne transkriptaze se koriste u sintezi dvolančane DNA, komplementarne RNA (osobito mRNA), za njezino naknadno kloniranje u plazmidnim vektorima pri dobivanju cDNA biblioteka (klonova). Reverzne transkriptaze, poput DNA polimeraze, mogu se koristiti za uvođenje radioaktivnih ili fluorescentnih oznaka u DNA sonde u prikladno obilježenim deoksiribonukleozid trifosfatima.
Sposobnost sintetiziranja DNA na RNA šabloni pod određenim uvjetima dokazana je za termostabilnu DNA polimerazu Thermus thermophilus. To mu omogućuje da se koristi za izravnu detekciju specifičnih RNA u biološkim uzorcima PCR-om. Moderne modifikacije ovog pristupa omogućuju u jednoj reakcijskoj smjesi (i epruveti) da se u reakciji reverzne transkripcije sintetizira mali broj kopija umnoženog fragmenta DNA na RNA predlošku, koje isti enzim odmah koristi kao predložak. u konvencionalnom PCR-u (PCR u jednoj epruveti).
Proučavanjem retrovirusa, čiji genom predstavljaju jednolančane RNA molekule, ustanovljeno je da u procesu unutarstaničnog razvoja prolaze kroz fazu integracije svog genoma u obliku dvolančane DNA u kromosome stanica domaćina. H. Temin je 1964. iznio hipotezu o postojanju enzima specifičnog za virus sposobnog sintetizirati komplementarnu DNK na RNA šabloni. Godine 1970. X. Temin i S. Mizutani, kao i neovisno o njima D. Baltimore, otkrili su takav enzim u pripravku ekstracelularnih viriona virusa Rous sarkoma. Ova RNA-ovisna DNA polimeraza naziva se reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza).
Najdetaljnija studija je revertaza ptičjih retrovirusa. Svaki virion sadrži oko 50 molekula ovog enzima. Reverzna transkriptaza se sastoji od dvije podjedinice - ά (65 kDa) i β (95 kDa), koje su prisutne u ekvimolarnim količinama. ά -podjedinica je N-terminalni dio (dvije trećine) β-podjedinice.
Reverzna transkriptaza ima najmanje tri enzimske aktivnosti:
· DNA polimeraza, koristeći i RNA i DNA kao šablonu;
· Aktivnost RNaze H, koja hidrolizira RNA u RNA-DNA hibridu, ali ne jednolančanu ili dvolančanu RNA;
· DNA endonukleaza.
Prve dvije aktivnosti potrebne su za sintezu virusne DNA, a čini se da je endonukleaza važna za integraciju virusne DNA u genom stanice domaćina. β-podjedinica revertaze ima sve tri aktivnosti, dok podjedinica ima samo polimerazu i RNazu H.
Pročišćena reverzna transkriptaza sintetizira DNK i na RNA i na DNK šablonima. Za početak sinteze, revertazi, kao i drugim polimerazama, potrebna je kratka dvolančana regija - primer. Primer može biti jednolančani segment i RNA i DNA, za koje se tijekom reakcije ispostavi da su kovalentno povezani s novosintetiziranim lancem DNA.
Reverzna transkriptaza se pretežno koristi za transkripciju glasničke RNA u komplementarnu DNA (cDNA). Reakcija reverzne transkripcije provodi se u prisutnosti snažnih inhibitora aktivnosti RNKaze. U tom slučaju moguće je dobiti DNK kopije cijele duljine ciljne RNA molekule. Oligo (dT) se koristi kao početnica za reverznu transkripciju mRNA koja sadrži poli (A) (slika), a za molekule RNA bez 3 "poli (A) kraja, kemijski sintetizirani oligonukleotidi komplementarni 3" kraju proučavanog RNA. Osim toga, potonji tip RNA molekula može se pretvoriti u poli(A)-sadrže pomoću E. coli poli(A)-polimeraze.
Nakon sinteze komplementarnog lanca DNA na mRNA i uništenja RNA (obično se koristi alkalna obrada), sintetizira se drugi lanac DNA. U ovom slučaju koristi se sposobnost revertaze da formira samokomplementarne ukosnice na 3'-krajevima jednolančanih cDNA, koje mogu djelovati kao početni lanac. Predložak je prvi lanac cDNA. Ova reakcija se može katalizirati i revertazom i DNA polimerazom I. Kombinacija ova dva enzima omogućuje povećanje prinosa punopravnih dvolančanih cDNA molekula.
Na kraju sinteze, prvi i drugi lanac cDNA ostaju kovalentno povezani petljom ukosnice, koja je služila kao početni lanac u sintezi drugog lanca. Ova petlja se cijepa s endonukleazom S1, koja specifično uništava jednolančane regije nukleinskih kiselina. Rezultirajući krajevi nisu uvijek tupi, a kako bi se povećala učinkovitost naknadnog kloniranja, oni se popravljaju na tupe pomoću Klenowovog fragmenta E. coli DNA polimeraze I. Rezultirajuća dvolančana cDNA može se zatim umetnuti u vektore za kloniranje, proširiti unutar hibridnih molekula DNA i koristiti za daljnja istraživanja.
Reverzna transkriptaza (revertaza ili RNA-ovisna DNA polimeraza) je enzim koji katalizira sintezu DNK na RNA predlošku u procesu zvanom “ obrnuta transkripcija"... Naziv procesa odražava suprotnost procesu transkripcije provodi se u drugom smjeru: iz molekule DNA šablona sintetizira se RNA transkript.
Ovi enzimi su izolirani iz RNA virusa ( retrovirusi). Reverznu transkriptazu koriste tumorigeni virusi za transkripciju mRNA u komplementarni lanac DNA. Proučavanjem retrovirusa, čiji genom predstavljaju jednolančane RNA molekule, ustanovljeno je da u procesu unutarstaničnog razvoja retrovirus prolazi kroz fazu integracije svog genoma u obliku dvolančane DNA u kromosome. stanice domaćina. Temin je 1964. iznio hipotezu o postojanju enzima specifičnog za virus koji je sposoban sintetizirati komplementarnu DNK na RNA šabloni. Napori usmjereni na izolaciju takvog enzima okrunjeni su uspjehom, te su 1970. Temin i Mizutani, i neovisno o njima Baltimore, otkrili željeni enzim u pripravku ekstracelularnih viriona virusa Rous sarkoma. Ova RNA-ovisna DNA polimeraza naziva se reverzna transkriptaza ili reverzna transkriptaza.
Najdetaljnija studija je revertaza ptičjih retrovirusa. Svaki virion sadrži oko 50 molekula ovog enzima. Reverzna transkriptaza se sastoji od dvije podjedinice, a (65 kDa) i b (95 kDa), prisutne u ekvimolarnim količinama. Reverzna transkriptaza ima najmanje tri enzimske aktivnosti:
1) DNA polimeraza, koristeći i RNA i DNA kao šablonu;
2) aktivnost RNaze H, koja hidrolizira RNA u RNA-DNA hibridu;
3) Aktivnost DNA endonukleaze.
Prve dvije aktivnosti potrebne su za sintezu virusne DNA, a čini se da je endonukleaza važna za integraciju virusne DNA u genom stanice domaćina. Pročišćena reverzna transkriptaza sintetizira DNA i na RNA i na DNA predlošcima (slika 11).
Riža. 11. Shema za sintezu dvolančanih DNA kopija RNA molekula
Za početak sinteze, revertazi, kao i drugim polimerazama, potrebna je kratka dvolančana regija (primer). Primer može biti jednolančani segment i RNA i DNA, za koje se tijekom reakcije ispostavi da su kovalentno povezani s novosintetiziranim lancem DNA. U genetskom inženjeringu koriste se oba oligo- (dT) primera koji su komplementarni 3'-polyA krajevima mRNA i skup heksanukleotida "slučajnih" po sastavu i sekvenci (slučajni primeri). poli (A) krajevi, kemijski sintetizirani oligonukleotidi komplementarni do 3 "kraja se koriste
Reverzna transkriptaza se pretežno koristi za transkripciju glasničke RNA u komplementarnu DNA (cDNA). Reakcija reverzne transkripcije provodi se pod posebno odabranim uvjetima korištenjem jakih inhibitora aktivnosti RNKaze. U tom slučaju moguće je dobiti DNK kopije cijele duljine ciljne RNA molekule. Nakon sinteze komplementarnog lanca DNA na mRNA i uništenja RNA (obično se koristi alkalna obrada), sintetizira se drugi lanac DNA. U ovom slučaju koristi se sposobnost reverzne transkriptaze da formira samokomplementarne ukosnice na 3'-krajevima jednolančanih cDNA, koje mogu djelovati kao početnica.
Predložak je prvi lanac cDNA. Ovu reakciju mogu katalizirati i revertaza i E. coli DNA polimeraza I. Pokazalo se da kombinacija ova dva enzima povećava prinos punopravnih dvolančanih cDNA molekula. Na kraju sinteze, prvi i drugi lanac cDNA ostaju kovalentno povezani petljom ukosnice, koja je služila kao početni lanac u sintezi drugog lanca. Ova petlja se cijepa s endonukleazom S1, koja specifično uništava jednolančane regije nukleinskih kiselina. Rezultirajući krajevi nisu uvijek tupi, a kako bi se povećala učinkovitost naknadnog kloniranja, oni se popravljaju na tupe pomoću Klenowovog fragmenta E. coli DNA polimeraze I. Rezultirajuća dvolančana cDNA može se zatim umetnuti u vektore za kloniranje, proširiti unutar hibridnih molekula DNA i koristiti za daljnja istraživanja.