Увеличивающая способность микроскопа. Качество изображения. Разрешающая способность прибора

Цель работы . Ознакомление с устройством микроскопа и определение его разрешающей способности.

Приборы и принадлежности : Микроскоп, металлическая пластинка с маленьким отверстием, осветительное зеркало, линейка со шкалой.

Введение

Микроскоп состоит из объектива и окуляра, которые представляют собой сложные системы линз. Ход лучей в микроскопе изображён на рис.1, на котором объектив и окуляр представлены одиночными линзами.

Рассматриваемый предмет АВ размещают немного дальше от главного фокуса объектива F об . Объектив микроскопа даёт действительное, обратное и увеличенное изображение предмета (AB на рис. 1), которое образуется за двойным фокусным расстоянием объектива. Увеличенное изображение рассматривается окуляром как лупой. Изображение предмета, рассматриваемое в окуляр, мнимое, обратное и увеличенное.

Расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра называется оптическим интервалом системы илиоптической длиной тубуса микроскопа.

Увеличение микроскопа можно определить по увеличению объектива и окуляра :

N = N об  N ок = ───── (1)

f об  f ок

где N об и N ок - увеличение объектива и окуляра соответственно; D - расстояние наилучшего зрения для нормального глаза (~25 см.) ;  - оптическая длина тубуса микроскопа; f об и f ок - главные фокусные расстояния объектива и окуляра.

При анализе формулы (1) можно сделать заключение, что в микроскопах с большим увеличением можно рассматривать любые мелкие предметы. Однако полезное увеличение, даваемое микроскопом, ограничивается дифракционными явлениями, которые становятся заметными при рассматривании предметов, размеры которых сравнимы с длинной световой волны.

Пределом разрешающей способности микроскопа называется наименьшее расстояние между точками, изображение которых в микроскопе получается раздельно.

Согласно теории Аббе предел разрешающей способности микроскопа определяет выражение:

d = ───── (2)

где d - линейный размер рассматриваемого предмета; - длина волны используемого света; n - показатель преломления среды между предметом и объективом;  - угол между главной оптической осью микроскопа и граничным лучом (рис. 2).

Величина A = nsin называется числовой апертурой объектива , а величина, обратная d, - разрешающей способностью микроскопа . Из выражения (2) следует что разрешающая способность микроскопа зависит от числовой апертуры объектива и длины волны света, которым освещается рассматриваемый предмет.

Если предмет находится в воздухе (n=1), то в микроскопе можно различить точки предмета, расстояние между которыми:

d = ─────

Для микроскопических предметов угол  близок к 90 градусам, тогда sin  1, откуда следует, что в микроскопе можно рассматривать предметы, находящиеся на расстоянии друг от друга ~ 0,61. В случае визуальных наблюдений (максимум чувствительности глаза приходится на зеленую область видимого спектра   550 нм) в микроскопе можно разглядеть предметы, находящиеся на расстоянии ~300 нм.

Как следует из выражения (2), разрешающую способность микроскопа можно увеличить путём уменьшения длины волны света, которым освещается предмет. Так, при фотографировании объектов в ультрафиолетовом свете (~ 250-300 нм) разрешающую способность микроскопа удаётся увеличить вдвое.

Предмет h помещают несколько дальше переднего фокуса объектива. Объектив дает действительное, обратное, увеличенное изображение H ’ , находящееся между передним фокусом окуляра и оптическим центром окуляра. Это промежуточное изображение рассматривается в окуляр как в лупу. Окуляр дает мнимое, прямое, увеличенное изображение H , которое расположено на расстоянии наилучшего зрения S ≈ 25 см от оптического центра глаза.

Это изображение мы рассматриваем глазом, на его сетчатке формируется действительное, обратное, уменьшенное изображение.

Увеличение микроскопа – отношение размеров мнимого изображения к размерам рассматриваемого через микроскоп предмета:
. Умножим числитель и знаменатель на размер промежуточного изображения H ’ :
. Таким образом, увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Увеличение объектива можно выразить через характеристики микроскопа, используя подобие прямоугольных треугольников
, где L  оптическая длина тубуса : расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра (считаем, что L >> F об). Увеличение окуляра
. Следовательно, увеличение микроскопа равно:
.

4. Разрешающая способность и предел разрешения микроскопа. Дифракционные явления в микроскопе, понятие о теории Аббе.

Предел разрешения микроскопа z – это наименьшее расстояние между двумя точками рассматриваемого в микроскоп объекта, когда эти точки еще воспринимаются отдельно. Предел разрешения обычного биологического микроскопа лежит в диапазоне 34 мкм. Разрешающей способностью микроскопа называют способность давать раздельное изображение двух близко расположенных точек исследуемого объекта, то есть это величина, обратная пределу разрешения.

Дифракция света налагает предел на возможность различения деталей объектов при их наблюдении в микроскоп. Так как свет распространяется не прямолинейно, а огибает препятствия (в данном случае, рассматриваемые объекты), то изображения мелких деталей объектов получаются размытыми.

Э. Аббе предложил дифракционную теорию разрешающей способности микроскопа . Пусть предметом, который мы хотим рассмотреть в микроскоп, будет дифракционная решетка с периодом d . Тогда минимальная деталь предмета, которую мы должны различить, как раз и будет периодом решетки. На решетке происходит дифракция света, но диаметр объектива микроскопа ограничен, и при больших углах дифракции не весь свет, прошедший через решетку, попадает в объектив. Реально свет от предмета распространяется к объективу в некотором конусе. Получаемое изображение тем ближе к оригиналу, чем больше максимумов участвует в формировании изображения. Свет от предмета распространяется к объективу от конденсора в виде конуса, который характеризуется угловой апертурой u – угол, под которым виден объектив из центра рассматриваемого предмета, то есть угол между крайними лучами конического светового пучка, входящего в оптическую систему. Согласно Э. Аббе, для получения изображения решетки, даже самого нечеткого, в объектив должны попасть лучи любых двух порядков дифракционной картины, например, лучи, образующие центральный и, по крайней мере, первый дифракционный максимум. Вспомним, что для наклонного падения лучей на дифракционную решетку ее главная формула имеет вид: . Если свет падает под углом , а угол дифракции для первого максимума равен
, то формула приобретает вид
. За предел разрешения микроскопа следует принять постоянную дифракционной решетки, тогда
, где  - длина волны света.

Как видно из формулы, один из способов уменьшения предела разрешения микроскопа – использование света с меньшей длиной волны. В связи с этим применяют ультрафиолетовый микроскоп, в котором микрообъекты исследуются в ультрафиолетовых лучах. Принципиальная оптическая схема такого микроскопа аналогична схемам обычного микроскопа. Основное отличие заключается в использовании оптических устройств, прозрачных для УФ-света, и в особенностях регистрации изображения. Так как глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение (кроме того, оно обжигает глаза, т.е. является опасным для органа зрения), то употребляются фотопластинки, люминесцентные экраны или электронно-оптические преобразователи.

Если в пространство между объективом и покровным стеклом препарата поместить специальную жидкую среду, называемую иммерсией , то предел разрешения также уменьшается:
, где n – абсолютный показатель преломления иммерсии, A – числовая апертура объектива . В качестве иммерсии используют воду (n = 1,33), кедровое масло (n = 1,515), монобромнафталин (n = 1,66) и др. Для каждого вида иммерсии изготавливают специальный объектив, и его можно применять только с данным видом иммерсии.

Еще один способ уменьшения предела разрешения микроскопа – это увеличение апертурного угла. Этот угол зависит от размеров объектива и расстояния от предмета до объектива. Однако расстояние от предмета до линзы нельзя изменять произвольно, оно постоянно для каждого объектива и приближать предмет нельзя. В современных микроскопах апертурный угол достигает 140 о (соответственно, u /2 = 70 о). С таким углом получают максимальные числовые апертуры и минимальные пределы разрешения.

Данные приведены для наклонного падения света на объект и длины волны 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз человека.

Обратите внимание на то, что окуляр совершенно не влияет на разрешающую способность микроскопа, он только создает увеличенное изображение объектива.

где l – расстояние между верхним фокусом объектива и нижним фокусом окуляра; L – расстояние наилучшего видения; равное 25 см; F 1 и F 2 – фокусные расстояния объектива и окуляра.

Зная фокусные расстояния F 1 , F 2 и расстояние между ними l можно найти увеличение микроскопа.

На практике не используются микроскопы с увеличением свыше 1500–2000, т.к. возможность различения мелких деталей объекта в микроскопе ограничена. Это ограничение обусловливается влиянием дифракции света, в проходящей структуре данного объекта. В связи с этим пользуются понятиями предела разрешения и разрешающей способности микроскопа.

Определение предела разрешения микроскопа

Пределом разрешения микроскопа называется то наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они видимы в микроскопе раздельно. Это расстояние определяется по формуле:

где λ – длина волны света; n – показатель преломления среды между объективом и объектом; u – апертурный угол объектива, равный углу между крайними лучами конического светового пучка, входящего в объектив микроскопа.

Реально свет от предмета распространяется к объективу микроскопа в некотором конусе (рис. 2 а), который характеризуется угловой апертурой – углом u между крайними лучами конического светового пучка, входящего в оптическую систему. В предельном случае, согласно Аббе, крайними лучами конического светового пучка будут лучи, соответствующие центральному (нулевому) и 1-му главному максимумам (рис. 2 б).

Величина 2nsin U называется числовой апертурой микроскопа. Числовая апертура может быть увеличена с помощью специальной жидкой среды – иммерсии – в пространстве между объективом и покровным стеклом микроскопа.

В иммерсионных системах по сравнению с тождественными "сухими" системами получают больший апертурный угол (рис. 3).

Рис.3. Схема иммерсионной системы

В качестве иммерсии используют воду (n = 1,33), кедровое масло (n = 1,514) и др. Для каждой иммерсии специально рассчитывают объектив, и его можно применять только с данной иммерсией.

Из формулы видно, что предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света и числовой апертуры микроскопа. Чем меньше длина волны света и чем больше величина апертуры, тем меньше Z, а, следовательно, больше предел разрешения микроскопа. Для белого (дневного) света можно принять среднее значение длины волны λ = 0,55мкм. Показатель преломления для воздуха равен n = 1.

Микроскоп мбс-1

МБС-1 – cтереоскопический микроскоп, дающий прямое объемное изображение рассматриваемого предмета как в проходящем, так и в отраженном свете.

Микроскоп состоит из 4 основных частей:

– cтолик;

– штатив;

– оптическая головка с механизмом грубой подачи;

– окулярная насадка.

Столик микроскопа состоит из круглого корпуса, внутри которого вмонтирован поворотный отражатель с зеркальной и матовой поверхностями. Для работы с дневным освещением в корпусе предусмотрен вырез, через который свободно проходит свет. С задней стороны корпуса столика имеется резьбовое отверстие для работы с электрическим осветителем. На штативе микроскопа крепится оптическая головка – основная часть прибора, в которую вмонтированы наиболее ответственные оптические узлы.

В корпусе оптической головки помещен барабан с с установленными в нем галилеевыми системами. Вращением оси барабана с помощью рукояток с нанесенными цифрами 0,6; 1; 2; 4; 7 добиваются различного увеличения объективов. Каждое положение барабана четко фиксируется специальным пружинным фиксатором. С помощью рукоятки на штативе микроскопа, перемещающей оптическую головку, добиваются наиболее резкого изображения рассматриваемого объекта.

Вся оптическая головка может перемещаться по стержню штатива и закрепляться в любом положении с помощью винта. Окулярная насадка состоит из направляющей, представляющей прямоугольную деталь с двумя отверстиями для оправ объективов.

Наблюдая в окуляры нужно разворотом окулярных трубок найти такое положение, при котором два изображения сводятся в одно. Далее произвести фокусировку микроскопа на исследуемый предмет, а вращением отражателя добиться равномерного освещения поля. При настройке освещенности патрон с лампой перемещается в сторону коллектора до получения наилучшей освещенности наблюдаемого объекта.

В основном МБС-1 предназначен для препарировальных работ, для наблюдения объектов, а также для проведения линейных измерений или измерений площадей участков препарата. Оптическая схема микроскопа представлена на рис. 4.

Оптическая схема микроскопа МБС-1 представлена на рис. 4.

При работе в проходящем свете источник света (1) с помощью отражателя (2) и коллектора (3) освещает прозрачный препарат, установленный на предметный столик (4).

В качестве объектива применена специальная система, состоящая из 4-х линз (5) с фокусным расстоянием = 80 мм и 2-х пар галилеевых систем (6) и (7), за которыми находятся объективы (8) с фокусным расстоянием 160 мм, которые образуют изображение объекта в фокальных плоскостях окуляров.

Общее линейное увеличение оптической системы, состоящей из объектива (5), галилеевых систем (6) и (7) и объективов (8) составляет: 0,6; 1; 2; 4; 7. За объективами (8) установлены 2 призмы Шмидта (9), которые позволяют разворачивать окулярные трубки по глазу наблюдателя без разворота изображения объектива.

1 – источник света;

2 – отражатель;

3 – коллектор;

4 – предметный столик;

5 – объектив (F = 80 мм);

6, 7 – галилеевы системы;

8 – объективы (F = 160 мм);

9 – призмы Шмидта;

10 – окуляры.

Рис. 4. Оптическая схема микроскопа МБС-1

К микроскопу МБС-1 прилагаются 3 пары окуляров (10) с увеличением 6; 8; 12,5 и один окулярный микрометр 8-кратного увеличения с сеткой. Они позволяют варьировать общее увеличение микроскопа от 3,6 до 88 (табл. 1). Общее увеличение микроскопа – произведение увеличения окуляра на увеличение объектива.

Таблица 1.

Оптическая характеристика микроскопа МБС-1

Увеличение	Увеличение объектива
Увеличение

Разрешающая способность глаза ограничена. Разрешающая способность характеризуется разрешаемым расстоянием , т.е. минимальным расстоянием между двумя соседними частицами, при котором они еще видимы раздельно. Разрешаемое расстояние для невооруженного глаза составляет около 0,2 мм. Для увеличения разрешающей способности используют микроскоп. Для исследования строения металлов микроскоп был впервые применен в 1831 году Аносовым П.П., изучавшим булатную сталь, и позднее, в 1863 году англичанином Г. Сорби, изучавшим метеоритное железо.

Разрешаемое расстояние определяется соотношением:

где l - длина волны света, идущего от объекта исследования в объектив, n – показатель преломления среды, находящейся между объектом и объективом, и a - угловая апертура, равная половине угла раскрытия, входящего в объектив пучка лучей, дающих изображение. Эта важная характеристика объектива выгравирована на его оправе.

У хороших объективов максимальный апертурный угол a = 70° и sina » 0,94. В большинстве исследований применяют сухие объективы, работающие в воздушной среде (n = 1). Для уменьшения разрешаемого расстояния используют иммерсионные объективы. Пространство между объектом и объективом заполняют прозрачной жидкостью (иммерсией) с большим показателем преломления. Обычно используют каплю кедрового масла (n = 1,51).

Если для видимого белого света принять l = 0,55 мкм, то минимальное разрешаемое расстояние светового микроскопа:

Таким образом, разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной волны света. Объектив дает увеличение промежуточного изображения объекта, которое рассматривается в окуляр, как в лупу. Окуляр увеличивает промежуточное изображение объекта и не может повысить разрешающей способности микроскопа.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра. На металлографических микроскопах производят исследования структуры металлов с увеличением от 20 до 2000 раз.

Начинающие делают обычную ошибку, стремясь рассматривать структуру сразу же при большом увеличении. Следует иметь в виду, что чем больше увеличение объекта, тем меньший участок виден в поле зрения микроскопа. Поэтому рекомендуется начинать исследование с использования слабого объектива, чтобы вначале оценить общий характер структуры металла на большой площади. Если же начинать микроанализ с использования сильного объектива, то многие важные особенности структуры металла могут быть не замечены.

После общего просмотра структуры при малых увеличениях микроскопа выбирают объектив с такой разрешающей способностью, чтобы увидеть все необходимые самые мелкие детали структуры.

Окуляр выбирают так, чтобы четко были видны детали структуры, увеличенные объективом. При недостаточном увеличении окуляра мелкие детали промежуточного изображения, созданного объективом, не будут увидены в микроскоп, и, таким образом, разрешающая способность объектива полностью не будет использована. При слишком большом увеличении окуляра новые детали структуры не выявляются, в то же время контуры уже выявленных деталей окажутся размытыми, а поле зрения станет более узким. Собственное увеличение окуляра выгравировано на его оправе (например, 7 х).