Хроматин: определение, строение и роль в делении клеток. Три фракции днк эукариот, их локализация в хромосомах и функции Структурные и функциональные компоненты хроматина

Хроматин – основной компонент клеточного ядра – достаточно легко получить из выделенных интерфазных ядер и из выделенных митотических хромосом. Для этого используют его свойство переходить в растворенное состояние при экстракции водными растворами с низкой ионной силой или просто деионизованной водой. При этом участки хроматина набухают и переходят в гель. Чтобы такие препараты перевести в настоящие растворы, необходимы сильные механические воздействия: встряхивание, перемешивание, дополнительная гомогенизация. Это, конечно, приводит к частичному разрушению исходной структуры хроматина, дробит его на мелкие фрагменты, но практически не меняет его химического состава.

Фракции хроматина, полученные из разных объектов, обладают довольно однообразным набором компонентов. Было найдено, что суммарный химический состав хроматина из интерфазных ядер и митотических хромосом мало отличаются друг от друга. Главными компонентами хроматина являются ДНК и белки, среди которых основную массу составляют гистоны и негистоновые белки (см табл. 3).

Таблица 3. Химический состав хроматина. Содержание белков и РНК дано по отношению к ДНК

В среднем в хроматине около 40% приходится на ДНК и около 60 % на белки, среди которых специфические ядерные белки-гистоны , составляют от 40 до 80% от всех белков, входящих в состав выделенного хроматина. Кроме того в состав хроматиновой фракциии входят мембранные компоненты, РНК, углеводы, липиды, гликопротеиды. Вопрос о том, насколько эти минорные компоненты входят в структуру хроматина еще не решен. Так, например, РНК может представлять собой транскрибируемую РНК, которая еще не потеряла связь с матрицей ДНК. Другие же минорные компоненты могут представлять собой вещества соосажденных фрагментов ядерной оболочки.

В структурном отношении хроматин представляет собой нитчатые комплексные молекулы дезоксирибонуклеопротеида (ДНП), которые состоят из ДНК, ассоциированной с гистонами (см. рис. 57). Поэтому укоренилось другое название хроматина – нуклеогистон . Именно за счет ассоциации гистонов с ДНК образуются очень лабильные, изменчивые нуклеиново-гистоновые комплексы, где отношения ДНК: гистон равно примерно единице, т.е. они присутствуют в равных весовых количествах. Эти нитчатые фибриллы ДНП и есть элементарные хромосомные или хроматиновые нити, толщина которых в зависимости от степени упаковки ДНК может колебаться от 10 до 30 нм. Эти фибриллы ДНП могут в свою очередь дополнительно компактизоваться с образованием более высоких уровней структуризации ДНП, вплоть до митотической хромосомы. Роль некоторых негистоновых белков заключается именно в образовании высоких уровней компактизации хроматина.

ДНК хроматина

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу подобно чистой выделенной ДНК в водных растворах. Об этом говорят многие экспериментальные данные. Так, при нагревании растворов хроматина наблюдается повышение оптической плотности раствора, так называемый гиперхромный эффект, связанный с разрывом межнуклеотидных водородных связей между цепями ДНК, подобно тому, что происходит при нагревании (плавлении) чистой ДНК.

Вопрос о размере, длине молекул ДНК в составе хроматина имеет важное значение для понимания структуры хромосомы в целом. При стандартных методах выделения ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9 х 10 6 , что значительно меньше молекулярной массы ДНК из кишечной палочки (2,8 х 10 9). Такую сравнительно малую молекулярную массу ДНК из препаратов хроматина можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина. Если же выделять ДНК в условиях, исключающих встряхивание, гомогенизацию и другие воздействия, то удается из клеток получить молекулы ДНК очень большой длины. Длина молекул ДНК из ядер и хромосом эукариотических клеток может быть изучена с помощью метода светооптической радиоавтографии, подобно тому как это изучалось на прокариотических клетках.

Было обнаружено, что в составе хромосом длина индивидуальных линейных (в отличие от прокариотических хромосом) молекул ДНК может достигать сотен микрометров и даже нескольких сантиметров. Так, у разных объектов были получены молекулы ДНК от 0,5 мм до 2 см. Эти результаты показали, что есть близкое совпадение между расчетной длиной ДНК на хромосому и радиоавтографическим наблюдением.

После мягкого лизиса клеток эукариот можно прямо определять молекулярные массы ДНК физико-химическими методами. Было показано, что максимальная молекулярная масса молекулы ДНК дрозофилы равна 41 х 10 9 , что соответствует длине около 2 см. У некоторых дрожжей на хромосому приходится молекула ДНК с молекулярной массой 1 х 10 8 -10 9 , которая имеет размеры около 0,5 мм.

Такие длинные ДНК представляют собой одну молекулу, а не несколько более коротких, сшитых гуськом с помощью белковых связок, как считали некоторые исследователи. К этому заключению пришли после того, как оказалось, что длина молекул ДНК не изменяется после обработки препаратов протеолитическими ферментами.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду, хотя у микроорганизмов количество ДНК на клетку значительно ниже, чем у беспозвоночных, высших растений и животных. Так, у мыши на ядро приходится почти в 600 раз больше ДНК, чем у кишечной палочки. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют такие различные организмы как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг).

Значительны колебания количества ДНК в больших таксономических группах. Среди высших растений количество ДНК у разных видов может отличаться в сотни раз, так же, как и среди рыб, в десятки раз отличается количество ДНК у амфибий.

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что «избыточное» количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Таблица 4 . Содержание ДНК в клетках некоторых объектов (пг, 10 -12 г)

Разрешить эти вопросы оказалось возможным на основании изучения кинетики реакции ренатурации или гибридизации ДНК. Если фрагментированные молекулы ДНК в растворах подвергнуть тепловой денатурации, а затем инкубировать их при температуре несколько более низкой, чем та, при которой происходит денатурация, то идет восстановление исходной двуспиральной структуры фрагментов ДНК за счет воссоединения комплементарных цепей – ренатурация. Для ДНК вирусов и прокариотических клеток было показано, что скорость такой ренатурации прямо зависит от величины генома; чем больше геном, чем больше количество ДНК на частицу или клетку, тем больше нужно времени для случайного сближения комплементарных цепей и специфической реассоциации большего числа разных по нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (рис. 53). Характер кривой реассоциации ДНК прокариотических клеток указывает на отсутствие повторяющихся последовательностей оснований в геноме прокариот; все участки их ДНК несут уникальные последовательности, число и разнообразие которых отражает степень сложности генетической композиции объектов и, следовательно, их общей биологической организации.

Совсем другая картина реассоциации ДНК наблюдается у эукариотических организмов. Оказалось, что в состав их ДНК входят фракции, которые ренатурируют с гораздо более высокой скоростью, чем можно было бы предполагать на основании размера их генома, а также фракция ДНК, ренатурирующая медленно, подобно уникальным последовательностям ДНК прокариот. Однако для эукариот требуется значительно большее время для ренатурации этой фракции, что связано с общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных генов.

В той части ДНК эукариотов, которая отличается высокой скоростью ренатурации, различают две подфракции: 1) фракцию с высоко или часто повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК могут быть повторены 10 6 раз; 2) фракцию умеренно повторяющихся последовательностей, встречающихся в геноме 10 2 -10 3 раз. Так, у мыши во фракцию ДНК с часто повторяющимися последовательностями входит 10% от общего количества ДНК на геном и 15% приходится на фракцию с умеренно повторяющимися последовательностями. Остальные 75% от всей ДНК мыши представлены уникальными участками, соответствующими большому числу различных неповторяющихся генов.

Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и поэтому могут быть выделены в чистом виде, как так называемые фракции сателлитной ДНК . У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК - 1,700 г/мл. Эти различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. Например, у мыши в этой фракции имеется 35% Г и Ц пар, а в основном пике ДНК - 42%.

Как оказалось, сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе основных типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан был на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК, иРНК, рРНК) не гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК нет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК, т.е. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК, не участвуют в транскрипции.

Существует гипотеза о том, что высокоповторяющиеся последовательности, не участвующие непосредственно в синтезе белков, могут нести информацию, играющую важную структурную роль в сохранении и функционировании хромосом. К ним могут быть отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра (см. ниже), участки начала репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.

Методом гибридизации нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ ) была изучена локализация этой фракции. Для этого на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченую 3 Н-уридином РНК. Затем цитологический препарат с хромосомами подвергали такой обработке, при которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура, щелочная среда и др.). После этого на препарат помещали меченную 3 Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически было обнаружено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обнаруживалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).

За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК , особенно у дрожжевых клеток. Так у S. cerevisiae центромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она состоит из двух консервативных участков (I и III) и центрального элемента (II), обогащенного АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфоидная сателлитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.н., организованных в группы димеров или пентамеров, которые в свою очередь образуют большие последовательности по 1-6 х 10 3 п.н. Такая самая большая единица повторена 100-1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК комплексируются особые центромерные белки, участвующие в образовании кинетохора , структуры, обеспечивающей связь хромосом с микротрубочками веретена и в движении хромосом в анафазе (см. ниже).

ДНК с высокоповторяющимися последовательностями обнаружена также в теломерных участках хромосом многих эукариотических организмов (от дрожжей до человека). Здесь чаще всего встречаются повторы, в которые входят 3-4 гуаниновых нуклеотида. У человека теломеры содержат 500-3000 повторов TTAGGG. Эти участки ДНК выполняют особую роль - ограничивать хромосому с концов и предотвращать ее укорачивание в процессе многократной репликации.

Недавно было найдено, что высокоповторяющиеся последовательности ДНК интерфазных хромосом связываются специфически с белками - ламинами, подстилающими ядерную оболочку, и участвуют в заякоревании растянутых деконденсированных интерфазных хромосом, тем самым определяют порядок в локализации хромосом в объеме интерфазного ядра.

Сделано предположение, что сателлитная ДНК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК, например между репликонами (см. ниже).

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 10 2 до 10 5 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, которые могут быть повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями. Такими являются гены для белков хроматина - гистонов, повторяющихся до 400 раз.

Кроме того, в эту фракцию входят участки ДНК с разными последовательностями (по 100-400 нуклеотидных пар), также многократно повторенными, но рассеянными по всему геному. Их роль еще не до конца ясна. Высказывается предположение, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (> 10 6 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (10 2 -10 5), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

Исходя из этих представлений становятся понятными те различия в количестве ДНК, которые наблюдаются у разных организмов: они могут быть связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так, например, у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до 80% от всей ДНК, у луков - до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной, нефрагментированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно и часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную цепь ДНК.

Молекулы ДНК гетерогенны не только по участкам разной нуклеотидной последовательности, но и различны в отношении их синтетической активности.

Репликация эукариотических ДНК

Бактериальная хромосома реплицируется как одна структурная единица, имеющая одну стартовую точку репликации и одну точку терминации. Таким образом бактериальная циклическая ДНК является одним репликоном . От стартовой точки репликация идет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон репликационными вилками, что хорошо видн при электронномикроскопическом изучении вирусных и бактериальных реплицирующихся хромосом.

У эукариотических клеток организация репликации иного характера – полирепликоннная.. Как уже говорилось, при импульсном включении 3 НТ множественная метка появляется практически во всехмитотических хромосомах. Это означает, что одновременно в интерфазной хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радиоавтографии меченых молекул, выделенных ДНК (рис. 55).Если клетки были импульсно мечены 3 НТ, то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК, которые успели реплицироваться, а между ними расположены участки нереплицированной ДНК, которая не оставила радиоавтографа и поэтому остается невидимой. По мере увеличения времени контакта 3 НТ с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментв можно точно рассчитать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения репликационной вилки оказалась равной 1-3 т.п.н. в мин у млекопитающих, около 1 т.п.н. в мин у некоторых растений, что намного ниже скорости репликации ДНК у бактерий (50 т.п.н. в мин.). В этих же экспериментах была прямо доказана полирепликонная структура ДНК хромосом эукариот: по длине хромосомной ДНК, вдоль нее, располагается множество независимых участков репликации – репликонов. По расстоянию между средними точками смежных метящихся репликонов, т.е. по расстоянию между двумя соседними стартовыми точками репликации, можно узнать величину отдельных репликонов. В среднем величина репликонову высших животных составляет около 30 мкм или 100 т.п.н. Следовательно, в гаплоидном наборе млекопитающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше, около 40 т.п.н. Так у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей – 400. Как говорилось, синтез ДНК в репликоне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается радиоавтографически: если клеткам после импульсной метки дать продолжить синтезировать ДНК некоторое время в среде без 3 НТ, то произойдет падение включения его в ДНК, будет происходить как бы разбавление метки, и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстановленного серебра.

Реплицирующиеся концы или вилки в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терминальной точке, общей для соседних репликонов). В этом месте реплицированные участки соседних репликонов объединяются в единые ковалентные цепи двух новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное подразделение ДНК хромосом на репликоны совпадает со структурным подразделением ДНК на домены или петли, основания которых, как уже упоминалось, скреплены белковыми связками.

Таким образом весь синтез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счет независимого синтеза на множестве отдельных репликонов, с последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении синтеза ДНК у бактерий и эукариот. Так бактериальная монорепликонная хромосома длиной в 1600 мкм синтезируется со скоростью около получаса. Если бы сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитающих реплицировалась тоже как монорепликонная структура, то на это ушло бы около недели (6 суток). Но если в такой хромосоме расположено несколько сот репликонов, то для полной ее репликации понадобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов. Это связано с тем, что не все репликоны отдельной хромосомы включаются одновременно.

В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала репликации, что дает возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так известно, что при дроблении яиц шпорцевых лягушек Xenopus laevis синтез ДНК занимает всего 20 минут, тогда как в культуре соматических клеток этот процесс продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК в ядре занимает 3,5 минуты, а в клетках культуры ткани – 600 минут. При этом в клетках культуры величина репликонов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.

Синтез ДНК по длине отдельной хромосомы происходит неравномерно. Было обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные репликоны собраны в группы, репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Это следовало из анализа радиоавтографов ДНК, где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков или кластеров репликонов или репликационных единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина - 5’-бромдезоксиуридина (BrdU). Включение BrdU в интерфазный хроматин приводит к тому, что во время митоза, участки с BrdU конденсируются в меньшей степени (недостаточная конденсация), чем те участки, где включался тимидин. Поэтому те участки митотических хромосом в которые включился BrdU, будут слабо окрашиваться при дифференциальной окраске. Это позволяет на синхронизированных культурах клеток выяснить последовательность включения BrdU, т.е. последовательность синтеза ДНК по длине одной взятой хромосомы. Оказалось, что происходит включение предшественника в большие участки хромосомы. Включение разных участков происходит строго последовательно в течение S-периода. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации по своей длине, имеет свой специфический рисунок репликации.

Кластеры репликонов, объединенные в репликационные единицы, связаны с белками ядерного матрикса (см. ниже), которые вместе с ферментами репликации образуют т.н. кластеросомы – зоны в интерфазном ядре, в которых идет синтез ДНК.

Порядок, в котором активируются репликационные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках. Так, например, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи центромеры) реплицируются обычно в конце S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (например, X-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с рисунком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к ранореплицирующимся, G-сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-сегменты (центромера) – места самой поздней репликации.

Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различно, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе не беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.

Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S-периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4-5).

Таким образом, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-периода. Но при этом происходит последовательное и асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также тем, что существует строгая последовательность появления в ходе S-периода пиков чувствительности определенных генов к мутагенам.

1. Виды хроматина

2. Гены, спейсеры

3. Последовательность нуклеотодов в ДНК

4. Пространственная организация ДНК

1. Во время покоя между актами деления определенные участки хромосом и целые хромосомы остаются компактными. Эти участки хроматина называют гетерохроматином. Он хорошо прокрашивается.

После деления ядра хроматин разрыхляется и в таком виде называется эухроматином. Гетерохроматин в отношении транскрипции неактивен, а в отношении репликации ДНК ведет себя иначе, чем эухроматин.

Факультативный гетерохроматин бывает гетерохроматичным только временами. Он информативен, т. е. содержит гены. Когда он переходит в эухроматическое состояние, эти гены могут становиться доступными для транскрипции. Из двух гомологичных хромосом одна может быть гетерохроматической. Эта факультативная гетерохроматизация тканеспецифична и в определенных тканях не происходит.

Конститутивный гетерохроматин всегда гетерохроматичен. Он состоит из многократно повторяющихся последовательностей оснований, неинформативен (не содержит генов) и поэтому всегда неактивен в отношении транскрипции. Его можно видеть и во время деления ядер. Он встречается :

Чаще всего у центромеры;

На концах хромосом (включая сателлиты);

Вблизи организатора ядрышка;

Вблизи гена 5S-PHK.

Гетерохроматин, прежде всего факультативный, во время интерфазы может объединяться в интенсивно окрашивающийся хромоцентр, который находится в большинстве случаев у края клеточного ядра или ядрышка.

2. Каждая хромосома - это непрерывная двойная спираль ДНК, которая у высших организмов состоит более чем из 10 8 пар оснований. В хромосомах высших растений и животных каждая двойная спираль ДНК (диаметром 2 нм) имеет длину от одного до нескольких сантиметров. В результате многократного закручивания она упакована в хроматиду длиной несколько микрометров.

Вдоль этой двойной спирали линейно распределены гены, которые составляют вместе до 25% ДНК.

Ген - это функциональная единица ДНК, содержащая информацию для синтеза полипептида или РНК. Средняя длина гена -около 1000 пар оснований. Последовательность оснований в каждом гене уникальна.

Между генами находятся спейсеры - неинформативные отрезки ДНК различной длины (иногда более 20 000 пар оснований), которые имеют значение для регулирования транскрипции соседнего гена.

Транскрипируемые спейсеры купируются при транскрипции вместе с геном, и их комплементарные копии появляются в пре-и-РНК по обе стороны от копии гена. Даже внутри самого гена имеются (только у эукариот и их вирусов) неинформативные последовательности, так называемые интроны, которые тоже транскрипируются. При процессинге все копии интронов и большинство копий спейсеров вырезаются с помощью ферментов.

Нетранскрипируемые спейсеры встречаются между генами для гистонов, а также между генами для р-РНК.

Избыточные гены представлены большим числом (до 10 4 и более) идентичных копий. Это гены :

Для т-РНК;

5S-PHK и гистонов;

Для продуктов, синтезируемых в больших количествах.

Копии расположены непосредственно друг за другом и разрешены идентичными спейсерами. У морского ежа гены для гистонов Н 4 , Н 2 ь, Н 2а и Hi лежат друг за другом, и эта генная последовательность повторяется в ДНК больше 100 раз.

3. Повторяющиеся последовательности - это последовательности нуклеотидов, многократно представленные в ДНК. Умеренно повторяющиеся последовательности - последовательности длиной в среднем 300 пар нуклеотидов с 10 2 -10 4 повторениями. К ним относятся избыточные гены, а также большинство спейсеров.

Высокоповторяющиеся последовательности с 10 5 -10 6 повторениями образуют конститутивный гетерохроматин. Они всегда неинформативны. Это в основном короткие последовательности, в них обнаруживается чаще всего 7-10 и лишь редко - только 2 (например, AT) или, наоборот, свыше 300 пар нуклеотидов. Они группируются вместе, одна повторяющаяся последовательность идет непосредственно за другой. ДНК высокоповторяющегося хроматина называют "сателлит-ными ДНК" по их поведению при аналитических процедурах фракционирования. Около 75% всего хроматина не участвует в транскрипции: это высокоповторяющиеся последовательности и нетраснкрипируемые спейсеры.

4. В изолированном хроматине участки двойной спирали ДНК обвиваются вокруг молекул гистонов, так что здесь возникает суперспираль первого порядка. Комплексы ДНК с гистоном называют нуклеосомами. Они имеют форму диска или линзы и размеры около 10 Ч 10 Ч 5 нм. В одну нуклеосому входят :

8 молекул гистонов:

Центральный тетрамер из двух молекул Нз и двух Н 4 ; и отдельно по два Н 2а и Н 2 ь;

Участок ДНК (около 140 пар оснований), который образует примерно 1,25 витка спирали и прочно связан с центральным тетрамером.

Между нуклеосомами лежат участки спирали из 30-100 пар оснований без суперспиральной структуры; здесь связывается гистон Hi

В нашивном хроматине ДНК еще больше укорочена в результате малоизученной дальнейшей спирализации (суперспирали высших порядков), которая, очевидно, фиксируется благодаря гистону Hi (и некоторым негистоновым белкам). При переходе к интерфазе эухроматин разрыхляется, так как некоторые из суперспиралей более высокого порядка раскручиваются. Это происходит, вероятно, в результате конформа-ционных изменений гистонов и ослабления взаимодействий между молекулами Hi Хроматиновые структуры толщиной 10- 25 нм (основные хроматиновые нити или спирали) видны и во время интерфазы.

1. Виды хроматина

2. Гены, спейсеры

3. Последовательность нуклеотодов в ДНК

4. Пространственная организация ДНК

Чаще всего у центромеры;

На концах хромосом (включая сателлиты);

Вблизи организатора ядрышка;

Вблизи гена 5S-PHK.

Вдоль этой двойной спирали линейно распределены гены, которые составляют вместе до 25% ДНК.

Нетранскрипируемые спейсеры встречаются между генами для гистонов, а также между генами для р-РНК.

Избыточные гены представлены большим числом (до 10 4 и более) идентичных копий. Это гены :

Для т-РНК;

5S-PHK и гистонов;

Для продуктов, синтезируемых в больших количествах.

8 молекул гистонов:

Центральный тетрамер из двух молекул Нз и двух Н 4 ; и отдельно по два Н 2а и Н 2 ь;

Транскрипционно-активный хроматин - гены, передающие свою информацию путем синтеза РНК, в результате дальнейшей деспирализации еще больше разрыхляется. По некоторым данным, в соответствующих участках спирали ДНК гистон Hi или отсутствует, или химически изменен, например фосфори-лирован.

Структура нуклеосом также изменяется или полностью разрушается (в генах для р-РНК в ядрышке). Двойная спираль в отдельных местах раскручивается. В этих процессах, по-видимому, участвуют определенные негистоновые белки, скапливающиеся в транскрипируемых участках ДНК.

Вопрос 38. Набор хромосом

/. Геном. Плоидностъ клеток

2. Политенные хромосомы

1. Весь фонд генетической информации каждого клеточного ядра - геном - распределен между некоторым постоянным числом хромосом (п). Это число специфично для каждого вида или подвида. У лошадиной аскариды оно равно 1, у кукурузы - 10, у человека - 23, у водоросли Netrium digitus - около 600. Хромосомы одного набора различаются по следующим критериям :

Величине;

Картине хромомер;

Положению перетяжек;

В зависимости от кратности набора хромосом - плоидности - клетки делятся :

На гаплоидные;

Диплоидные;

Полиплоидные.

Гаплоидными называются клетки, которые содержат одинарный набор хромосом («), например половые клетки.

Если клетки содержат двойной набор хромосом (2 П), они диплоидные, так как генетическая информация в них представлена дважды. Диплоидны почти все соматические клетки высших растений и животных. Они содержат один отцовский и один материнский набор хромосом.

В полиплоидных клетках имеется несколько наборов хромосом (4 П, 8 П, 16 П и т. д.). Эти клетки часто особенно активны в метаболическом отношении, например многие клетки печени у млекопитающих.

Гаплоидные клетки образуются из диплоидных в результате мейоза, а диплоидные из гаплоидных - в результате оплодотворения.

Полиплоидные клетки возникают из диплоидных путем эндо-митоза - преждевременно прерванного деления ядра: после полной репликации и разделения хроматид дочерние хромосомы остаются в одном клеточном ядре, вместо того чтобы распределиться между двумя ядрами. Этот процесс может повторяться многократно.

Аномалии при образовании половых клеток могут приводить к полиплоидии всего организма. При неполной репликации некоторые части генома, например гетерохроматин, не реплицируются и остаются после эндомитоза диплоидными, в отличие от других частей, которые становятся полиплоидными.

Амплификация генов - это многократная сверхрепликация, когда реплицируются только определенные гены, которые становятся полиплоидными (гены для р-РНК в ядрышке).

Хромосомы диплоидного ядра могут быть сгруппированы попарно, по две гомологичные хромосомы. Большинство из них (так называемые аутосомы) попарно идентичны. Только две половые хромосомы, определяющие пол особи, у самцов неодинаковы - это хромосомы X и Y (гетерохромосомы). Большую часть Y-хромосомы занимает конститутивный гетерохроматин. У самок имеются две Х-хромосомы. Однако у бабочек, птиц и ряда других животных дело обстоит наоборот: самцы имеют набор XX, самки - XY.

2. Политенные хромосомы (гигантские хромосомы) содержат во много раз больше ДНК, чем обычные. Они не изменяют своей формы на протяжении цикла деления и достигают длины до 0,5 мм и толщины 25 мкм. Они встречаются, например, в слюнных железах двукрылых (мух и комаров), в макронуклеусе инфузорий и в тканях завязи бобов. Чаще всего они видны в гаплоидном числе, так как гомологичные хромосомы тесно спарены. Политения возникает в результате эндорепликации. По сравнению с эндомитозом это еще более редуцированный процесс деления - после репликации хроматиды не разделяются (процесс повторяется многократно). При этом разные отрезки ДНК умножаются в различной степени :

Участки центромер - незначительно;

Большинство информативных областей - приблизительно в 1000 раз;

Некоторые - более чем в 30 000 раз.

Поэтому политенные хромосомы представляют собой пучки из бесчисленных хроматид, разделенных не полностью. Хроматиды растянуты, гомологичные хромомеры образуют темные диски, тесно расположенные вдоль хромосомы. Эти диски разделены более светлыми полосами. Вероятно, на хроматиде один диск и одна промежуточная полоса образуют помимо спейсера один ген (реже несколько генов), который, по-видимому, находится в диске. Политенные хромосомы чрезвычайно бедны гетерохроматином.

На политенных хромосомах отдельные диски временами раздуваются в пуфы (кольца Бальбиани). Там гомологичные хроматиды отделяются друг от друга, гомологичные хромомеры раздвигаются и возникает разрыхленная структура транскрипци-онно-активного хроматина. В пуфах содержится меньше гис-тона Hi, чем в дисках, вместо него здесь находится фермент РНК-полимераза (что указывает на синтез РНК). В промежуточных полосах тоже мало гистона Hi, но есть РНК-полимераза и, возможно, происходит хотя бы незначительный синтез РНК.

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу. ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9*10 6 . Такую сравнительно малую массу ДНК из препаратов можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют различные организмы, как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг).

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека, в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что “избыточное” количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, эти участки играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК.

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 10 2 до 10 5 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в обменных процессах. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями (гены для белков хроматина - гистонов).

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов:

часто повторяющиеся последовательности (>10 6 раз), входящие во фракцию сателитной ДНК и не транскрибирующиеся;

фракция умеренно повторяющихся последовательностей (10 2 -10 5), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному;

фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

ДНК прокариотического организма представляет собой одну гигантскую циклическую молекулу. ДНК эукариотических хромосом представляет собой линейные молекулы, состоящие из тандемно (друг за другом) расположенных репликонов разного размера. Средний размер репликона около 30 мкм. Тем самым в составе генома человека должно встречаться более 50 000 репликонов, участков ДНК, которые синтезируются как независимые единицы. Эти репликоны имеют начальную и терминальную точки синтеза ДНК.

Представим себе, что у эукариотических клеток каждая из хромосомных ДНК, как и у бактерий, является одним репликоном. В этом случае при скорости синтеза 0,5 мкм в минуту (для человека) редупликация первой хромосомы с длиной ДНК около 7 см должна занять 140 000 минут, или около трех месяцев. На самом же деле благодаря полирепликонному строению молекул ДНК весь процесс занимает 7-12 ч.

Удаление гистона H1 из транскрипционно активного хроматина 1*2* . В ранних опытах Дж. Боннера (США) было показано, что ДНК в составе хроматина является гораздо худшей матрицей, чем свободная ДНК. На основании этих наблюдений было высказано предположение, что гистоны являются репрессорами транскрипции.

Л. Н. Ананьева и Ю. В. Козлов в нашей лаборатории поставили задачей выяснить, обладают ли ингибирующим действием все гистоны или только некоторые из них. Для этого из хроматина клеток асцитного рака Эрлиха мышей удаляли гистоны экстракцией растворами NaCl с постепенно повышающейся концентрацией. Полученные препараты служили матрицей для синтеза РНК. Транскрипцию вели в присутствии РНК-полимеразы из кишечной палочки, E. coli, которую брали в избытке, и смеси нуклеозидтрифосфатов. В интервале 0,4-0,6 М NaCl происходила резкая деконденсация материала, выражающаяся в набухании ядерного геля и даже растворении ДНП (если далее вести механическую обработку). При этом, как было показано, избирательно удалялся гистон HI. Одновременно с деконденсацией хроматина происходило резкое усиление его матричной активности (рис. 26). Дальнейшее увеличение концентрации солей в экстрагирующем растворе вело к удалению других гистонов и некоторому, но не слишком выраженному дополнительному увеличению матричной активности.

0 t. Тем самым гибридизуемость выявляет процентное содержание в синтезированной РНК повторяющихся последовательностей (по результатам, полученным Л. Н. Ананьевой, Ю. В. Козловым и автором); б - основные параметры синтеза РНК на разных матрицах: свободной ДНК, исходном хроматине (ДНП 0) и хроматине, из которого удален гистон H1 экстракцией 0,6 М NaCl (ДНП 0,6). Синтез РНК вели с помощью РНК-полимеразы кишечной палочки в присутствии меченых нуклеозидтрифосфатов: [ 14 C]-ATP и либо [γ- 32 P]-ATP, либо [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP включалась во всю РНК, a [γ- 32 P] - только в начало цепи (pp x A- или pp x G). Иными словами, включение [ 32 Р] давало информацию об инициации синтеза, а [ 14 С] - о самом синтезе РНК. В части опытов через 3-4 мин после начала инкубации в среду добавляли рифампицин-антибиотик, препятствующий инициации новых цепей РНК, но не влияющий на уже начатый синтез, т. е. на элонгацию. 1 - включение [ 14 С] - UMP, 2 - то же после добавления рифампицина; 3 - включение [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - то же после добавления рифампицина. На основании этих кривых включения можно рассчитать основные параметры РНК-полимеразной реакции (по результатам, полученным Ю. В. Козловым и автором)">
Рис. 26. Влияние гистона H1 на матричную активность ДНК в составе хроматина. а - влияние удаления белков из хроматина (1) на матричную активность (2) последнего в присутствии экзогенной РНК-полимеразы кишечной палочки, а также на гибридизуемость синтезирующейся РНК (3). Гистоны и негистоновые белки экстрагировали растворами NaCl повышающейся концентрации. В интервале 0,4 М NaCl - 0,6 М NaCl избирательно удалялся гистон H1. Синтезированную РНК гибридизовали с избытком ДНК при промежуточных величинах С 0 t. Тем самым гибридизуемость выявляет процентное содержание в синтезированной РНК повторяющихся последовательностей (по результатам, полученным Л. Н. Ананьевой, Ю. В. Козловым и автором); б - основные параметры синтеза РНК на разных матрицах: свободной ДНК, исходном хроматине (ДНП 0) и хроматине, из которого удален гистон H1 экстракцией 0,6 М NaCl (ДНП 0,6). Синтез РНК вели с помощью РНК-полимеразы кишечной палочки в присутствии меченых нуклеозидтрифосфатов: [ 14 C]-UTP и либо [γ- 32 P]-ATP, либо [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP включалась во всю РНК, a [γ- 32 P] - только в начало цепи (pp x A- или pp x G). Иными словами, включение [ 32 Р] давало информацию об инициации синтеза, а [ 14 С] - о самом синтезе РНК. В части опытов через 3-4 мин после начала инкубации в среду добавляли рифампицин-антибиотик, препятствующий инициации новых цепей РНК, но не влияющий на уже начатый синтез, т. е. на элонгацию. 1 - включение [ 14 С] - UMP, 2 - то же после добавления рифампицина; 3 - включение [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 - то же после добавления рифампицина. На основании этих кривых включения можно рассчитать основные параметры РНК-полимеразной реакции (по результатам, полученным Ю. В. Козловым и автором)

Исследовались также и свойства синтезированной in vitro РНК с помощью гибридизации с тотальной ДНК мышей. При этом выявлялась фракция РНК, синтезированная на повторяющихся последовательностях ДНК. Оказалось, что в хроматине транскрипция повторяющихся последовательностей ДНК ограничена. Однако уже после экстракции хроматина 0,6 М NaCl, когда удалялся гистон H1, гибридизационные свойства РНК, синтезированной на матрице такого хроматина и на матрице свободной ДНК, становились неразличимыми. Мы предположили, что гистоны H2a, H2b, H3 и H4 (тогда их называли иначе - умеренно богатые лизином и богатые аргинином гистоны) не участвуют в подавлении транскрипции, а играют чисто структурную роль в организации хроматина, тогда как гистон H1 (в старой терминологии гистон, богатый лизином) является ингибитором синтеза РНК. Одновременно он же является фактором, обусловливающим конденсацию хроматина (см. выше).

Позднее Ю. В. Козлов изучил механизм ингибирования транскрипции гистоном H1, опять-таки на бесклеточной системе с РНК-полимеразой, выделенной из Е, coli. Было изучено влияние гистона H1 на процессы инициации и элонгации (см. рис. 26, табл. 4). Оказалось, что он в несколько раз снижает число цепей РНК, инициируемых на матрице нативного хроматина. Особенно резко ингибируется элонгация: РНК-полимераза прочитывает не более 100-150 п. н. ДНК, после чего останавливается. Между тем на хроматине, из которого гистон H1 удален, РНК-полимераза прочитывает по несколько тысяч пар нуклеотидов, причем длина цепей не отличается от длины цепей, синтезируемых на матрице свободной ДНК. Правда, на свободной ДНК по сравнению с хроматином, из которого удален гистон H1, более эффективно идут процессы инициации синтеза РНК. Был сделан вывод, что гистон H1, конденсируя хроматин, создает препятствия на пути РНК-полимеразы и останавливает тем самым синтез РНК.

* (ДНПМ - ДНП, изолированный с помощью обработки мочевиной, который полностью солюбилизирован, но при этом сохраняет гистон H1. )

В свете современных данных о соленоидном строении 300 А-ДНП фибриллы, которое зависит от присутствия гистона H1, этот результат легко объясним. Действительно, в соленоиде РНК-полимераза, очевидно, не может прочитать более 100 п. н. из-за чисто топологических запретов.

Согласно нашей гипотезе, при активации гена должно было происходить удаление гистона H1. Однако проверить ее в то время не удалось. Лишь сравнительно недавно появились данные об утрате гистона H1 из хроматина при активации генов. Так, при выделении активно транскрибируемых областей хроматина, например мини-ядрышек из ряда организмов, в них не был обнаружен гистон H1. Нет его и у дрожжей, где все гены потенциально активны.

Убедительные результаты были получены в лаборатории А. Д. Мирзабекова В. Л. Карповым и О. В. Преображенской . Они разработали метод "гибридизации с тенями гистонов". Для этого ДНК сшивали с гистонами с помощью диметилсульфата в условиях, когда пришивается в среднем одна молекула гистона на отрезок ДНК длиной около 200-300 п. н. Затем ДНК фрагментировали и проводили двумерный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После прогона в первом направлении разрушали пришитые к ДНК гистоны протеиназой и вели разгонку во втором направлении уже свободной ДНК. Так как при первом раунде электрофореза разные гистоны по-разному замедляли движение фрагментов ДНК, то после второго прогона выявлялось несколько диагоналей (рис. 27). Обычно хорошо видны три: одна, соответствующая исходно свободной ДНК, другая - исходным комплексам ДНК с сердцевинными гистонами и третья (нижняя) - исходному комплексу ДНК с гистоном H1. Полученные ДНК переносятся на фильтр и гибридизуются с той или иной пробой. Если для гибридизации брали неактивный участок генома, например спейсер рибосомного гена дрозофилы, то метка связывалась со всеми диагоналями. Если, однако, как пробу использовали ген теплового шока, который транскрибировался в клетках, из которых выделяли хроматин, то гибридизация с диагональю, соответствующей комплексам ДНК с гистоном H1, была резко ослаблена или вообще отсутствовала. Иными словами, в ядрах перед пришивкой ДНК транскрибируемого гена не имела контактов с гистоном H1.

Рис. 27. Утрата гистона H1 и сердцевинных гистонов при активации транскрипции. Опыты велись на клетках культуры D. melanogaster (а, б) в условиях культивирования при 25° (а) и теплового шока (б). В случае а экспрессия генов теплового шока отсутствует, в случае б - идет весьма активно. Кроме того, опыты велись на дехорионизованных эмбрионах (в), где экспрессия генов теплового шока находится на среднем уровне. После образования ДНК-белковых комплексов, выделения фрагментов ДНК, их двумерного разделения (в вертикальном направлении после удаления белка) и переноса на фильтр вели гибридизацию одних и тех же фильтров с разными пробами: с регуляторной областью гена р70 теплового шока (ТШ-5"); с кодирующей областью того же гена (ТШ-код); с пробой транскрипционно неактивной инсерции в ген рДНК (неакт.). В неактивном гене видны три диагонали; 1 - свободная ДНК, 2 - комплексы ДНК с гистонами октамера; 3 - комплексы ДНК С гистоном H1. Видно ослабление или исчезновение ДНК-гистоновых комплексов при активации хроматина (по результатам, полученным А. Д. Мирзабековым и соавт.)

Хотя все имеющиеся сейчас данные, взятые по отдельности позволяют и другие интерпретации, в совокупности они служат серьезным свидетельством в пользу удаления гистона H1 из активного хроматина. Однако механизм этого процесса пока совершенно неясен.

Судьба нуклеосом при активации хроматина 2* [ 154-157]. Менее однозначным является вопрос о судьбе гистонов H2a, H2b, H3 и H4, формирующих сердцевину нуклеосомы. В вышеупомянутых опытах Ю. В. Козлова их присутствие практически не влияло на транскрипцию ДНК РНК-полимеразой из E. coli. При изучении продуктов гидролиза хроматина эукариот многие авторы нашли, что нуклеосомы содержат ДНК активных генов, т. е. последние тоже организованы в нуклеосомы. Полученные на большом экспериментальном материале данные А. Д. Мирзабекова и сотр. показывают, что нуклеосомы, содержащие активно транскрибируемую ДНК, принципиально устроены так же, как и нуклеосомы, содержащие неактивную ДНК, хотя некоторые ДНК-гистоновые контакты в них изменяются.

Были также проведены опыты по гибридизации с тенями гистонов, о которых шла речь в предыдущем разделе (см. рис. 27). Препараты с диагоналями готовили из клеток дрозофилы, в которых гены теплового шока либо вообще не работали, т. е. были выключены, либо они работали на низком уровне, или, наконец, они были стимулированы тепловым шоком к активной транскрипции. Во всех случаях контрольной пробой служила ДНК спейсера рибосомного гена, которая гибридизовалась во всеми тремя диагоналями, в том числе с диагональю, произошедшей из комплексов ДНК с сердцевинными гистонами.

Ген теплового шока тоже нормально гибридизовался с этой диагональю из клеток, где он не транскрибировался. Однако с материалом, полученным из клеток с умеренной транскрипцией гена теплового шока, гибридизация второй диагонали была существенно понижена. Наконец, если диагонали получали из клеток с очень активным синтезом мРНК теплового шока, то вторая диагональ при гибридизации вообще была не видна (как и третья), и выявлялась лишь диагональ, соответствовавшая не сшитой с гистонами ДНК- Общий вывод, сделанный из работ с использованием метода ДНК-белковых сшивок, состоял в том, что при транскрипции движущаяся вдоль цепи ДНК РНК-полимераза обратимо сталкивает нуклеосомы с ДНК и транскрибирует фактически голую ДНК. Если уровень транскрипции невысок и РНК-полимераз, ползущих вдоль ДНК, немного, то нуклеосомы успевают образоваться вновь на участке, через который РНК-полимераза уже прошла. Если же транскрипция идет активно, то нуклеосомная структура ДНК не успевает восстановиться, и ДНК вообще лишена гистонов. В то же время постулируется, что организация нуклеосом в активном хроматине практически не отличается от таковой в неактивном. Недавно А. Д. Мирзабеков и сотр. воспроизвели опыты по пришивке гистонов к ДНК с помощью другого метода, путем обработки изолированных ядер препаратами платины. Этот метод мягче диметилсульфатного. Были получены принципиально те же результаты.

Наряду с этой группой данных имеются исследования, в которых авторы приходят к несколько отличным выводам. В. Гаррард и А. Ворсел (США), изучая состояние активных генов в хроматине с помощью нуклеазного гидролиза и с помощью электронной микроскопии, пришли к выводу о том, что нуклеосомы в активном хроматине остаются, но претерпевают структурные изменения типа разворота, превращаясь в полунуклеосомы. В результате на электрофореграммах гидролизатов микрококковой нуклеазой периодичность ~ 200 п. н. заменяется периодичностью ~ 100 п. н. При электронной микроскопии число бусин удваивается, а их размеры уменьшаются. Предполагается, что РНК-полимераза может проходить через такие развернутые нуклеосомы.

В пользу этой возможности говорят и данные, полученные Т. Коллером (Швейцария). Им разработан оригинальный метод изучения нуклеосом. Клетки обрабатывают псораленом, веществом, которое связывается с ДНК, и затем при УФ облучении сшивает между собою две цепи ДНК. Однако если ДНК входит в состав нуклеосом, реакции ее с псораленом не происходит. Поэтому, если выделенную из обработанных клеток ДНК проденатурировать в присутствии формальдегида (он препятствует ренатурации ДНК), то при электронной микроскопии на ДНК видны чередующиеся пузырьки (две цепи денатурировавшей ДНК), соответствующие нуклеосомам, связанные между собою ординарными нитями (сшитая, не способная к денатурации ДНК), соответствующими межнуклеосомным линкерам. Вначале изучали активно транскрибируемые гены рибосомной РНК, входящие в состав экстрахромосомных структур и поэтому легко анализируемые с помощью электронной микроскопии. В них пузырьки, соответствующие нуклеосомам, не видны, т. е. по всей вероятности, гистоны полностью удаляются из транскрибируемых областей. Интересно, что в нетранскрибируемых областях, спейсерах, пузырьки в ДНК (нуклеосомы) хорошо видны.

Однако на мини-хромосомах SV40, которые транскрибируются РНК-полимеразой II, а не РНК-полимеразой I, как гены рибосомной РНК, были получены другие результаты (рис. 28). Транкскрипционно активные мини-хромосомы выявляются благодаря наличию на них растущих цепей РНК (обычно одной или двух). Такие мини-хромосомы составляют 1-2 % от всех мини-хромосом, выделенных из клетки. Они, однако, содержат то же самое число пузырьков, что и неактивные мини-хромосомы, причем их размеры одинаковы в обоих случаях. Наиболее интересным является то, что цепи РНК отходят как от линкеров, так и непосредственно от пузырьков, т. е. РНК-полимераза, очевидно, транскрибирует нуклеосомы. Эти данные свидетельствуют в пользу разворота нуклеосом и транскрипции их РНК-полимеразой.

Все перечисленные выше результаты не являются прямыми, и поэтому окончательное решение вопроса о судьбе нуклеосом при транскрипции должны дать будущие эксперименты.

Модификация гистонов и гистоновые варианты: связь с активным хроматином . Еще в начале 60-х годов Олфри (США) показал, что гистоны могут подвергаться различным модификациям. Так, гистон HI фосфорилируется по ε-аминогруппам лизинов. Гистоны H3 и H4 ацетилируются по тем же группам. Имеется и ряд других модификаций (метилирование, ADP - рибозилирование, убикитинирование и др.).

Сразу возникло предположение, что энзиматические модификации гистонов могут влиять на структуру хроматина и на его активность. Действительно, при фосфорилировании лизина происходит замена одного положительного заряда в гистоне на отрицательный, при апеллировании - утрата положительного заряда и т. д. Именно благодаря таким изменениям в заряде модифицированные гистоны можно отделить от немодифицированных при проведении гель-электрофореза в ацетатном буфере с мочевиной. Так, в высокоразрешающем электрофорезе гистон H4 дает не одну, а четыре полосы, соответствующие молекулам, не ацетилированным и ацетилированным по одному, двум и трем остаткам лизина. В разных тканях соотношение между фракциями меняется. Разделяются на несколько фракций гистоны H3, H2a, H2b и H1 (разная степень ацетилирования и фосфорилирования).

К сожалению, до настоящего времени отсутствуют хорошие методы разделения транскрипционно активного и неактивного хроматина и поэтому трудно приписать измененные формы гистонов тому или иному состоянию хроматина. Наиболее интересные данные в этом направлении были получены тем же В. Олфри (США). При гидролизе активного хроматина он выделил необычные частицы, которые седиментировали в сахарозном градиенте медленнее, чем обычные нуклеосомы, и, по мнению автора, соответствовали развернутым нуклеосомам. В этих частицах, названных А-частицами, присутствовали все сердцевинные гистоны. В отличие от нормальных нуклеосом SH-группы гистона H3 в А-частицах были доступны для ряда химических реагентов, и благодаря этому А-частицы можно отделить от нуклеосом с помощью фракционирования на колонках с хлормеркурибензоатом (реагент, связывающий SH-группы). В А-частицах повышено содержание ацетилированных форм гистонов. Автор предполагает, что ацетилирование гистонов при активации хроматина ведет к развороту нуклеосомных частиц, а это, в свою очередь, повышает доступность SH-групп гистона H3.

Некоторые из гистонов кодируются более чем одним типом генов. В результате для этих гистонов существует несколько вариантов, немного различающихся по своей аминокислотной последовательности. Иногда в процессе онтогенеза происходит закономерная замена одного подкласса гистона на другой. Остается, однако, неясным, имеет ли это какое-либо регуляторное значение. Вопрос, очевидно, может быть также решен после разработки адекватных методов выделения транскрипционно активного хроматина.

Особое положение занимает гистон H1. Для него существуют варианты, резко отличающиеся по своей структурной организации. Таким вариантом является, например, гистон Н5, который замещает значительную часть гистона H1 в ядрах эритроцитов птиц. По всей вероятности, это замещение является важным фактором полного выключения транскрипции в ядрах эритроцитов. В обычных клетках существует вариант гистона H1 - гистон H1 0 . Его содержание составляет малую долю от всего гистона H1. Есть ряд противоречащих друг другу данных о том, что H1 0 связан с активными генами или, наоборот, с устойчиво выключенными генами. Вопрос остается открытым.

Белки HMG могут участвовать в организации активного хроматина 1* . Помимо гистонов, хроматин содержит множество негистоновых белков, функция которых не известна. Среди них, очевидно, должны быть структурные белки, ферменты, обеспечивающие протекание процессов репликации, транскрипции и др., и регуляторные белки. Э. Джонс (Великобритания) попытался выделить белковые компоненты, присутствующие в достаточно большом количестве, что позволило бы провести их анализ и идентификацию. Ему действительно удалось изолировать новый класс ядерных белков, названный им "группой белков с высокой подвижностью" (high mobility group ), или HMG-белки. Название зависело от высокой подвижности этих белков при электрофорезе в геле. Фракция HMG-белков распадается на ряд индивидуальных компонентов. Среди них наиболее представительны и хорошо охарактеризованы HMG-1, HMG-2, HMG-14 и HMG-17.

HMG-белки имеют невысокую молекулярную массу. Они обогащены как основными, так и дикарбоновыми аминокислотами. Содержание HMG-белков составляет примерно 7ю от содержания гистонов. В ядрах из разных типов клеток оно может варьировать. В данном контексте нас больше всего интересуют белки HMG-14 и HMG-17, для которых были получены данные о возможной роли в активации транскрипции. Х. Вайнтрауб (США) показал, что экстракция ядер 0,35 М NaCl, которая извлекает HMG-белки, меняет некоторые свойства активного хроматина, которые восстанавливаются при добавлении к хроматину HMG-14 и HMG-17. Г. Диксон (Канада) обнаружил эти белки в составе нуклеосом, освобождавшихся из хроматина на ранних этапах гидролиза нуклеазой, которые, по его данным, были обогащены ДНК тракстипционно активных генов.

Концам [ 32 Р] и затем гибридизовали с гяРНК из L-клеток. Гибриды выявляли путем гельфильтрации. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - тотальная ДНК клетки (по результатам, полученным В. В. Бакаевым и соавт.)">
Рис. 29. Возможная связь HMG-белков (14 и 17) с активным хроматином. а - выявление субнуклеосом в гидролизатах хроматина микрококковой нуклеазой. На разных этапах гидролиза появляются те или иные фракции субнуклеосом. Электрофорез велся в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. Окраска этидийбромидом, на правом столбике - флюорография; б - использование двумерного электрофореза для выяснения белкового состава субнуклеосом CH2 и CH3. Хроматин, меченный [ 14 С] по белку, гидролизовали микрококковой нуклеазой и разделяли двумерным электрофорезом (1-е направление - недиссоциирующая среда, 2-е направление - раствор додецилсульфата натрия), после чего вели авторадиографию для выявления белков. Буквами указаны HMG-белки, которые в момент проведения опыта еще не были идентифицированы с известными. Сейчас мы знаем, что А - это HMG-1, В - HMG-2, E - HMG-14, G - HMG-17, HMG-белки F и H идентифицированы неточно, вероятно, H тоже соответствует HMG-17. Видно, что HMG-белки входят в состав мононуклеосом (МН-2 и МН-3) и субнуклеосом CH-2 (HMG-17) и CH-3 (HMG-14); в - демонстрация обогащения ДНК CH-2 и CH-3 транскрибирующимися последовательностями. ДНК, выделенную из полос CH-2 и CH-3 L-клеток, метили по 5"-концам [ 32 Р] и затем гибридизовали с гяРНК из L-клеток. Гибриды выявляли путем гельфильтрации. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - тотальная ДНК клетки (по результатам, полученным В. В. Бакаевым и соавт.)

В. В. Бакаев в нашей лаборатории пришел к выводу о роли HMG-белков в транскрипции с помощью другого экспериментального подхода. При электрофоретическом анализе гидролизатов хроматина он выявил, помимо нуклеосом и олигонуклеосом, минорные компоненты, обладающие большей подвижностью. Они были названы субнуклеосомами и, очевидно, являлись продуктами дальнейшего распада нуклеосомы (рис. 29, табл. 5). Субнуклеосома СН-7 соответствовала нуклеосоме, утратившей по одной молекуле Н2а и Н2Ь и содержавшей ДНК, укороченную на 40 п. н., СН-6 соответствовала комплексу ДНК длиной 30-40 п. н. с гистоном H1, отщепляющемуся от МН-2 при ее превращении в МН-1. СН-4 содержала отрезок ДНК и пару гистонов H2a и H2b (продукт реакции МН-1→СН-7→СН-4). Две субнуклеосомы, СН-3 и СН-2, состояли из короткой ДНК и HMG-белков (HMG-14 и HMG-17). Можно было предположить, что они являются участками линкера, связанными с белками HMG-14 и HMG-17, переходящими в раствор при переваривании соответствующих нук-леосом. СН-2 и СН-3 были собраны, из них выделена ДНК, которую метили по концам и изучали ее гибридизацию с ядерной РНК. Оказалось, что ДНК из СН-2 и СН-3 гораздо эффективнее гибридизуется с ядерной РНК, чем тотальная, фрагментированная до тех же размеров ДНК клетки.

Отсюда был сделан вывод, что ДНК, связанная с белками HMG-14 и HMG-17, вероятно, происходит из транскрипционно активного хроматина.

Все эти данные, полученные независимо, позволили предположить, что HMG-14 и HMG-17 каким-то образом связаны с активацией генов. Механизм активации был, однако, совершенно непонятным. HMG-14 и HMG-17 не могли быть первичными факторами, включающими ген, так как они лишены специфичности. Можно было думать, что они участвуют в поддержании "открытой конформации" активного хроматина.

В последующие годы появился скептицизм относительно роли HMG-14 и HMG-17 в активации хроматина. В частности, недавно А. Д. Мирзабеков и сотр. с помощью метода гибридизации с белковыми тканями получили данные об обеднении активного хроматина HMG-14 и HMG-17. Поскольку, однако, все вышеперечисленные данные являются косвенными, в целом вопрос о роли HMG-белков остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Топоизомераза I и белки, прочно связанные с ДНК, входят в состав транскрипционно активного хроматина 1* . С. Элгин (США), а за нею ряд других авторов показали, что транскрипционно активный хроматин содержит топоизомеразу I, фермент, релаксирующий суперспирализованную ДНК. Впервые это было продемонстрировано на цитологических препаратах политенных хромосом дрозофилы с помощью флюоресцирующих антител к топоизомеразе I. Этот фермент вносит в ДНК одноцепочечный разрыв и ковалентно связывается с образовавшимся 5"-концом ДНК. Это позволяет ДНК свободно вращаться в месте разрыва. Затем фрагмент отщепляется, а фосфодиэфирная связь в ДНК восстанавливается. По молекулярной массе топоизомераза I, или сокращенно топо I, гетерогенна. Наиболее тяжелый компонент имеет молекулярную массу 135 кДа , а наиболее богато представленный - 80 кДа. При ее расщеплении протеиназами образуются более короткие полипептиды, сохраняющие тем не менее ферментативную активность.

Антибиотик каптотецин является ингибитором топо I, причем при обработке им клеток фермент образует ковалентные сшивки с ДНК в том месте, где он находился в момент контакта с антибиотиком. Место таких сшивок легко определить методом картирования с помощью гибридизационной метки. Этим путем было обнаружено, что топо I присутствует исключительно в транскрибируемых областях генома, т. е., вероятнее всего, она работает в кооперации с РНК-полимеразой II, снимая возникающие при транскрипции местные перекручивания ДНК.

Другим белковым компонентом, выявляемым в транскрибируемых областях генома, является набор белков, прочно связанных с ДНК (ПСБ), которая соответствует транскрибируемой ДНК клетки (см. разд. 3.4).

С. В. Разиным и В. В. Чернохвостовым была сделана попытка детально охарактеризовать комплексы ДНК с ПСБ. Фрагменты ДНК длиной в 1-2 т. п. н., связанные с ПСБ, очищали и подвергали равновесному ультрацентрифугированию в градиенте плотности CsCl. Их плавучая плотность оказалась равной 1,7 г / см 3 , т. е. она соответствовала плавучей плотности свободной ДНК, не содержащей белка. В ходе опытов, поставленных для объяснения этого парадокса, было обнаружено, что обработка ДРНКазой ведет к уменьшению плавучей плотности комплексов до 1,62-1,65 г / см 3 . Приблизительные расчеты, основанные на плотности белка (~ 1,3 г / см 3 ) и РНК (~ 1,9 г / см 3 ), (показывают, что на каждую молекулу ДНК приходится около 150 кДа белка и около 200 нуклеотидов РНК. Природа этой РНК неясна, но получены данные о ее гомогенности и уникальной нуклеотидной последовательности.

Таким образом, многое в отношении комплексов ДНК с ПСБ остается загадочным, но, по всей вероятности, им принадлежит существенная роль в организации транскрипционной машины. Их исследование продолжается в настоящее время.

Деметилирование ДНК в транскрибирующихся генах 2* . Еще одной важной особенностью активного хроматина является деметилирование определенных участков ДНК. В неактивных генах большая часть цитидиловых остатков в составе CG-последовательностей метилируется. Впервые Б. В. Ванюшиным в лаборатории А. Н. Белозерского было продемонстрировано, что ДНК в разных тканях одного животного различаются по уровню метилирования С. На основании этого было высказано предположение о возможной регуляторной роли метилирования в дифференцировке. Позднее многими авторами было показано, что в транскрибирующейся ДНК некоторые области оказываются недометилированными. Наиболее широко используемый метод анализа - сравнение рестриктных карт, полученных с рестриктазами, узнающими одну и ту же последовательность, например CGCG или CCGG, но обладающими разной чувствительностью к метилированию. Одна из рестриктаз расщепляет и метилированную и неметилированную последовательности, а другая - только неметилированную. Обычно неметилированные последовательности локализованы в регуляторной области гена. Область собственно гена, его кодирующей части и интронов одинаково метилирована как в работающих, так и в молчащих генах.

При введении в клетки метилированной ДНК ее экспрессия в клетке оказывается значительно сниженной по сравнению с неметилированной ДНК. Получены данные, согласно которым при репликации ДНК состояние метилирования ДНК воспроизводится: если одна из цепей метилирована, то новообразованная цепь также метилируется в том же самом месте.

Одно время складывалось впечатление, что метилирование-деметилирование цитидина в CG-последовательностях регуляторной области - это главный механизм инактивации-активации гена. Однако в последнее время появился ряд данных, противоречащих этой гипотезе. Так, полностью метилированная по CG ДНК SV40 активно экспрессируется. В то же время в ДНК дрозофиллы вообще не выявляется метилцитозин. Возможно, что деметилирование С является следствием активации гена и лишь закрепляет состояние транскрипционной активности. Здесь, как и в других областях изучения активации гена, нужны новые эксперименты.