От каких величин зависит разрешающая способность микроскопа. Разрешающая способность и увеличение микроскопа. Оптическая система микроскопа
Разрешающая способность глаза ограничена. Разрешающая способность характеризуется разрешаемым расстоянием , т.е. минимальным расстоянием между двумя соседними частицами, при котором они еще видимы раздельно. Разрешаемое расстояние для невооруженного глаза составляет около 0,2 мм. Для увеличения разрешающей способности используют микроскоп. Для исследования строения металлов микроскоп был впервые применен в 1831 году Аносовым П.П., изучавшим булатную сталь, и позднее, в 1863 году англичанином Г. Сорби, изучавшим метеоритное железо.
Разрешаемое расстояние определяется соотношением:
где l - длина волны света, идущего от объекта исследования в объектив, n – показатель преломления среды, находящейся между объектом и объективом, и a - угловая апертура, равная половине угла раскрытия, входящего в объектив пучка лучей, дающих изображение. Эта важная характеристика объектива выгравирована на его оправе.
У хороших объективов максимальный апертурный угол a = 70° и sina » 0,94. В большинстве исследований применяют сухие объективы, работающие в воздушной среде (n = 1). Для уменьшения разрешаемого расстояния используют иммерсионные объективы. Пространство между объектом и объективом заполняют прозрачной жидкостью (иммерсией) с большим показателем преломления. Обычно используют каплю кедрового масла (n = 1,51).
Если для видимого белого света принять l = 0,55 мкм, то минимальное разрешаемое расстояние светового микроскопа:
Таким образом, разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной волны света. Объектив дает увеличение промежуточного изображения объекта, которое рассматривается в окуляр, как в лупу. Окуляр увеличивает промежуточное изображение объекта и не может повысить разрешающей способности микроскопа.
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра. На металлографических микроскопах производят исследования структуры металлов с увеличением от 20 до 2000 раз.
Начинающие делают обычную ошибку, стремясь рассматривать структуру сразу же при большом увеличении. Следует иметь в виду, что чем больше увеличение объекта, тем меньший участок виден в поле зрения микроскопа. Поэтому рекомендуется начинать исследование с использования слабого объектива, чтобы вначале оценить общий характер структуры металла на большой площади. Если же начинать микроанализ с использования сильного объектива, то многие важные особенности структуры металла могут быть не замечены.
После общего просмотра структуры при малых увеличениях микроскопа выбирают объектив с такой разрешающей способностью, чтобы увидеть все необходимые самые мелкие детали структуры.
Окуляр выбирают так, чтобы четко были видны детали структуры, увеличенные объективом. При недостаточном увеличении окуляра мелкие детали промежуточного изображения, созданного объективом, не будут увидены в микроскоп, и, таким образом, разрешающая способность объектива полностью не будет использована. При слишком большом увеличении окуляра новые детали структуры не выявляются, в то же время контуры уже выявленных деталей окажутся размытыми, а поле зрения станет более узким. Собственное увеличение окуляра выгравировано на его оправе (например, 7 х).
Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения. По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.
Увеличение микроскопа
Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением: V об =-Δ/F\" об * F\" об - фокусное расстояние микрообъектива * Δ - расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.
Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:
G ок =¼ F ок
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра: G=V об *G ок
Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:
Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.
Поле зрения микроскопа
Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра ω , в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества: 2y=500*tg(ω)/G * G - увеличение микроскопа
При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.
Диаметр выходного зрачка микроскопа
Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:
где A – передняя апертура микроскопа.
Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).
При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.
Разрешающая способность микроскопа
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:
Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа . Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное , то для средней длины волны можно вычислить разрешающую способность микроскопа:
Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: * Увеличивая апертуру объектива, * Уменьшая длину волны света.
Иммерсия
Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду , кедровое масло , раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины , тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит.
Применение ультрафиолетовых лучей
Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны разрешающая способность микроскопа составит.
Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.
Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа , т.е. минимальным расстоянием, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. разрешающая способность зависит от числовой апертуры объектива, конденсора и длины волны света, которым освещается препарат. Числовая апертура (раскрытие) зависит от угловой апертуры и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и конденсора и препаратом.
Угловая апертура объектива - это максимальный угол (AOB), под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через препарат. Числовая апертура объектива равна произведению синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды, находящейся между предметным стеклом и фронтальной линзой объектива. N.A. = n sinα где, N.A. - числовая апертура; n - показатель преломления среды между препаратом и объективом; sinα - синус угла α равного половине угла АОВ на схеме.
Таким образом, апертура сухих систем (между фронтальной линзой объектива и препаратом-воздух) не может быть более 1 (обычно не более 0,95). Среда, помещаемая между препаратом и объективом, называется иммерсионной жидкостью или иммерсией, а объектив, рассчитанный для работы с иммерсионной жидкостью, называют иммерсионным. Благодаря иммерсии с более высоким показателем преломления чем у воздуха, можно повысить числовую апертуру объектива и, следовательно, разрешающую способность.
Числовая апертура объективов всегда гравируется на их оправах.
Разрешающая способность микроскопа зависит также от апертуры конденсора. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет вид R=λ/2NA, где R - предел разрешения; λ - длина волны; N.A - числовая апертура. Из этой формулы видно, что при наблюдении в видимом свете (зеленый участок спектра - λ=550нм), разрешающая способность (предел разрешения) не может быть > 0,2мкм
Влияние числовой апертуры объектива микроскопа на качество изображения
Пути повышения оптической разрешающей способности
Выбор большого угла светового конуса, как со стороны объектива, так и со стороны источника освещения. Благодаря этому, возможно, собрать в объективе более преломленные лучи света от очень тонких структур. Таким образом, первый путь повышения разрешения - это использование конденсора, числовая апертура которого соответствует числовой апертуре объектива.
Второй способ - использование иммерсионной жидкости между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом. Так мы воздействуем на показатель преломления среды n, описанный в первой формуле. Его оптимальное значение, рекомендуемое для иммерсионных жидкостей, составляет 1.51.
Иммерсионные жидкости
Иммерсионные жидкости необходимы для увеличения числовой апертуры и соответственно повышения разрешающей способности иммерсионных объективов, специально рассчитанных для работы с этими жидкостями и, соответствующим образом, маркированными. Иммерсионные жидкости, помещенные между объективом и препаратом, имеют более высокий показатель преломления, чем воздух. Поэтому, отклоненные мельчайшими деталями объекта лучи света, не рассеиваются, выходя из препарата, и попадают в объектив, что приводит к повышению разрешающей способности.
Существуют объективы водной иммерсии (маркированные белым кольцом), масляной иммерсии (черное кольцо), глицериновой иммерсии (желтое кольцо), монобромнафталиновой иммерсии (красное кольцо). В световой микроскопии биологических препаратов применяются объективы водной и масляной иммерсии. Специальные кварцевые объективы глицериновой иммерсии пропускают коротковолновое ультрафиолетовое излучение и предназначены для ультрафиолетовой (не путать с люминесцентной) микроскопии (то есть для изучения биологических объектов, избирательнопоглощающих ультрафиолетовые лучи). Объективы монобромнафталиновой иммерсии в микроскопии биологических объектов не используются.
В качестве иммерсионной жидкости для объектива водной иммерсии используется дистиллированная вода, масляной иммерсии - природное (кедровое) или синтетическое масло с определенным показателем преломления.
В отличие от других иммерсионных жидкостей масляная иммерсия является гомогенной, так как имеет показатель преломления равный или очень близкий показателю преломления стекла. Обычно этот показатель преломления (n) рассчитан для определенной спектральной линии и определенной температуры и указывается на флаконе с маслом. Так, например, показатель преломления иммерсионного масла для работы с покровным стеклом для спектральной линии D в спектре натрия при температуре =20°С равен 1,515 (nD 20 = 1,515), для работы без покровного стекла (nD 20 = 1,520).
Для работы с объективами-апохроматами нормируется также дисперсия, то есть разность показателей преломления для различных линий спектра.
Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива.
Учитывая вышесказанное, ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом. При некоторых способах микроскопии для увеличения апертуры конденсора, иммерсионная жидкость (чаще дистиллированная вода) помещается между конденсором и препаратом.
Предел разрешения – это такое наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором эти точки различимы, т.е. воспринимаются в микроскопе как две точки.
Разрешающая способность определяется как способность микроскопа давать раздельные изображение мелких деталей рассматриваемого предмета. Она задается формулой:
где А – числовая апертура, l – длина волны света; , где n – показатель преломления среды, в которой находится рассматриваемый объект, U – апертурный угол.
Для изучения структуры мельчайших живых существ необходимы микроскопы с большим увеличением и хорошей разрешающей способностью. Оптический микроскоп ограничен увеличением в 2000 раз и имеет разрешающую способность не лучше 250 нм. Эти значения не годятся для исследования мелких деталей клеток.
118. Ультрафиолетовый микроскоп. Один из способов уменьшения
предела разрешения микроскопа - использование света с меньшей длиной волны. В связи с этим применяют ультрафиолетовый микроскоп, в котором микрообъекты исследуются в ультрафиолетовых лучах. Так как глаз непосредственно не воспринимает этого излучения, то употребляются фотопластинки, люминесцентные экраны или электронно-оптические преобразователи. Другим способом уменьшения предела разрешения микроскопа является увеличение показателя преломления среды, в которой находится микроскоп. Для этого его помещают в иммерсионную жидкость , например, кедровое масло.
119. Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом.
Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.
Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией, то прибегают к их окрашиванию растворами флюоресцирующих красителей. Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некоторых инфекций: туберкулеза (ауромин), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами и др. Этот же способ может применяться для цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов. В реакции иммуннофлюоресценции с помощью антител, меченных флюорохромами, выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных
120. Фазово-контрастная микроскопия. При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз этих изменений заметить не может и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении невидимых фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне или светлыми на темном фоне.
Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п.
121. Темнопольная микроскопия. Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами.
Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света.
При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру.
122. Тепловое излучение является самым распространенным в природе видом электромагнитного излучения. Оно совершается за счет энергии теплового движения атомов и молекул вещества. Тепловое излучение присуще всем телам при любой температуре, отличной от абсолютного нуля.
Полная лучеиспускательная способность тела Е(её еще называют энергетической светимостью) - это величина энергии, испускаемой с единицы площади поверхности тела за 1с. Измеряется в Дж/м 2 с.
Полная лучепоглощательная способность тела А(коэффициент поглощения) – это отношение лучистой энергии, поглощенной телом, ко всей падающей на него лучистой энергии; А – безразмерная величина.
123. Абсолютно черное тело. Воображаемое тело, поглощающее при любой температуре всю падающую на него лучистую энергию, называется абсолютно черным.
Закон Кирхгофа. Для всех тел при данной температуре отношение лучеиспускательной способности E к лучепоглощательной способности A есть постоянная величина, равная лучеиспускательной способности абсолютно черного тела e при той же температуре:
e.
Закон Стефана-Больцмана. Полная лучеиспускательная способность абсолютно черного тела прямо пропорциональна четвертой степени его абсолютной температуры:
e=sT 4 ,
где s– постоянная Стефана-Больцмана.
Закон Вина. Длина волны, соответствующая максимуму излучения абсолютно черного тела, обратно пропорциональна его абсолютной температуре:
l т ×T= в,
где в – постоянная Вина.
На законе Вина основана оптическая пирометрия – метод определения температуры раскаленных тел (металла – в плавильной печи, газа – в облаке атомного взрыва, поверхности звезд и т. п.) по спектру их излучения. Именно этим методом была впервые определена температура поверхности Солнца.
124 . Инфракрасное излучение. Электромагнитное излучение, занимающее спектральную область между красной границей видимого света (λ= 0,76 мкм) и коротковолновым радиоизлучением (λ = 1 - 2 мм) называют инфракрасным (ИК). Нагретые твердые и жидкие тела испускают непрерывный инфракрасный спектр.
Лечебное применение инфракрасного излучения основано на его тепловом воздействии. Для лечения используют специальные лампы.
Инфракрасное излучение проникает в тело на глубину около 20 мм, поэтому в большей степени прогреваются поверхностные слои. Терапевтический эффект обусловлен возникающим температурным градиентом, что активизирует деятельность терморегулирующей системы. Усиление кровоснабжения облученного места приводит к благоприятным лечебным последствиям.
125. Ультрафиолетовое излучение. Электромагнитное излучение,
занимающее спектральную область между фиолетовой границей видимого света (λ = 400 нм) и длинноволновой частью рентгеновского излучения (λ = 10 нм), называют ультрафиолетовым(УФ).
Накаленные твердые тела при высокой температуре излучают
заметную долю ультрафиолетового излучения. Однако максимум
спектральной плотности энергетической светимости в соответствии с законом Вина приходится на 7000 К. Практически это означает, что в обычных условиях тепловое излучение серых тел не может служить эффективным источником УФ излучения. Наиболее мощным источником УФ излучения является Солнце, 9 % излучения которого на границе земной атмосферы составляет ультрафиолетовое.
УФ излучение необходимо для работы УФ микроскопов, люминесцентных микроскопов, для люминесцентного анализа. Главное применение УФ излучения в медицине связано с его специфическим биологическим воздействием, которое обусловлено фотохимическими процессами.
126. Термография – это регистрация излучения различных участков
поверхности тела с целью диагностической интерпретации. Определение температуры осуществляется двумя способами. В одном случае используются жидкокристаллические индикаторы, оптические свойства которых очень чувствительны к небольшим изменениям температуры.
Помещая эти индикаторы на тело больного, можно визуально по изменению их цвета определить местное различие температуры.
Другой метод основан на использовании тепловизоров , в которых используются чувствительные приемники инфракрасного излучения, например, фотосопротивления.
127. Физиологические основы термографии . Физиологические процессы, происходящие в организме человека, сопровождаются выделением теплоты, которая переносится циркулирующей кровью и лимфой. Источник тепла - биохимические процессы, происходящие в живом организме. Выделяемое тепло разносится кровью по всему организму. Обладая высокой теплоемкостью и теплопроводностью, циркулирующая кровь способна осуществлять интенсивный теплообмен между центральными и периферическими областями организма. Температура крови, проходящей по кожным сосудам, снижается на 2-3°.
В основе термографии лежит явление увеличения интенсивности инфракрасного излучения над патологическими очагами (в связи с усилением в них кровоснабжения и метаболических процессов) или уменьшение его интенсивности в областях с уменьшенным региональным кровотоком и сопутствующими изменениями в тканях и органах. Обычно это выражается появлением "горячей зоны". Выделяют два основных вида термографии: телетермография и контактная холестерическая термография.
128. Телетермография основана на преобразовании инфракрасного излучения тела человека в электрический сигнал, который визуализируется на экране тепловизора. В качестве приемных устройств инфракрасного излучения в тепловизорах используют чувствительные фотосопротивления.
Тепловизор работает следующим образом. Инфракрасное излучение фокусируется системой линз, после чего попадает на фотоприемник, работающий при охлаждении его до –196°С. Сигнал с фотоприемника усиливается и подвергается цифровой обработке с последующей передачей полученной информации на экран цветного монитора.
129. Контактная жидкокристаллическая термография опирается на оптические свойства анизотропных холестерических жидких кристаллов, которые проявляются изменением окраски в радужные цвета при нанесении их на термоизлучающие поверхности. Наиболее холодным участкам соответствует красный цвет, наиболее горячим - синий.
Жидкокристаллическая контактная пластинчатая термография в настоящее время широко и успешно применяется в различных областях медицины, однако значительно большее применение нашли дистанционные методы регистрации инфракрасного излучения тела человека.
130. Клинические применения термографии. Термографическая диагностика не оказывает никакого внешнего воздействия или неудобства для пациента и позволяет "увидеть" аномалии тепловой картины на поверхности кожи пациента, которые характерные для многих заболеваний и физических расстройств.
Термография, являясь физиологичным, безвредным, неинвазивным методом диагностики, находит свое применение в практической медицине для диагностики широкого круга патологий: заболеваний молочных желез, позвоночника, суставов, щитовидной железы, ЛОР органов, сосудов, печени, желчного пузыря, кишечника, желудка, поджелудочной железы, почек, мочевого пузыря, предстательной железы. Термография позволяет зафиксировать изменения в самом начале развития патологического процесса, до появления структурных изменений в тканях.
131. Резерфордовская (планетарная) модель атома. Согласно этой модели весь положительный заряд и почти вся масса (более 99,94%) атома сосредоточены в атомном ядре, размер которого ничтожно мал (порядка 10 -13 см) по сравнению с размером атома (10 -8 см). Вокруг ядра по замкнутым (эллиптическим) орбитам движутся электроны, образуя электронную оболочку атома. Заряд ядра равен по абсолютной величине суммарному заряду электронов.
Недостатки резерфордовской модели.
а) в резерфордовской модели атом является неустойчивым
образованием, тогда как опыт свидетельствует об обратном;
б) спектр излучения атома по Резерфорду является непрерывным, тогда как опыт говорит о дискретном характере излучения.
132. Квантовая теория строения атома по Бору. Исходя из представлений о дискретности энергетических состояний атома, Бор усовершенствовал атомную модель Резерфорда, создав квантовую теорию строения атома. В ее основе лежат три постулата.
Электроны в атоме могут двигаться не по любым орбитам, а только по орбитам вполне определенного радиуса. На этих орбитах, называемых стационарными, момент количества движения электрона определяется выражением:
где m – масса электрона, v – его скорость, r – радиус электронной орбиты, n – целое число, называемое квантовым (n=1,2,3, …).
Движение электронов по стационарным орбитам не сопровождается излучением (поглощением) энергии.
Переход электрона с одной стационарной орбиты на другую
сопровождается излучением (или поглощением) кванта энергии.
Величина hn этого кванта равна разности энергий W 1 – W 2 стационарных состояний атома до и после излучения (поглощения):
hn=W 1 – W 2 .
Это соотношение называют условием частот.
133. Виды спектров. Различают три основных вида спектров: сплошные, линейчатые и полосатые.
Линейчатые спектры
атомами. Излучение обусловлено переходами связанных электронов на более низкие энергетические уровни.
Полосатые спектры излучаются отдельными возбужденными
молекулами. Излучение вызвано как электронными переходами в атомах, так и колебательными движениями самих атомов в молекуле.
Сплошные спектры излучаются совокупностями многих взаимодействующих между собой молекулярных и атомных ионов.
Основную роль в излучении играет хаотическое движение этих частиц, обусловленное высокой температурой.
134. Понятие о спектральном анализе . Каждый химический элемент
испускает (и поглощает) свет с вполне определенными, присущими только этому элементу длинами волн. Линейчатые спектры элементов получают путем фотографирования в спектрографах, в которых разложение света осуществляется с помощью дифракционной решетки. Линейчатый спектр элемента – это его своеобразный “отпечаток пальца”, который позволяет безошибочно идентифицировать этот элемент на основе длин волн излучаемого (или поглощаемого света). Спектрографические исследования являются одним из наиболее мощных имеющихся в нашем распоряжении методов химического анализа.
Качественный спектральный анализ – это сравнение полученных спектров с табличными для определения состава вещества.
Количественный спектральный анализ проводится путем фотометрирования (определения интенсивности) спектральных линий: яркость линий пропорциональна количеству данного элемента.
Градуировка спектроскопа . Для того чтобы с помощью спектроскопа можно было определять длины волн исследуемого спектра, спектроскоп необходимо проградуировать, т.е. установить зависимость между длинами волн спектральных линий и делениями шкалы спектроскопа, на которых они видны.
135. Основные характеристики и области применения спектрального анализа. С помощью спектрального анализа можно определять как атомный, так и молекулярный состав вещества. Спектральный анализ позволяет проводить качественное открытие отдельных компонентов анализируемой пробы и количественное определение их концентрации. Вещества с очень близкими химическими свойствами, которые трудно или даже невозможно анализировать химическими методами, легко определяются спектрально.
Чувствительность спектрального анализа, как правило, очень высока. Прямым анализом достигается чувствительность 10 -3 - 10 -6 %. Скорость спектрального анализа обычно значительно превышает скорость выполнения анализа другими методами.
136. Спектральный анализ в биологии. Спектроскопический метод измерения оптической активности веществ широко применяется для определения структуры биологических объектов. При изучении биологических молекул измеряются их спектры поглощения и флуоресценция. Флуоресцирующие при лазерном возбуждении красители используются для определения водородного показателя и ионных сил в клетках, а также для исследования специфических участков в белках. С помощью резонансного комбинационного рассеяния зондируется структура клеток и определяется конформация молекул белков и ДНК. Важную роль сыграла спектроскопия при изучении фотосинтеза и биохимии зрения.
137. Спектральный анализ в медицине. В организме человека присутствует более восьмидесяти химических элементов. Их взаимодействие и взаимовлияние обеспечивает процессы роста, развития, пищеварения, дыхания, иммунитета, кроветворения, памяти, оплодотворения и т.д.
Для диагностики микро- и макроэлементов, а также их количественного дисбаланса волосы и ногти являются наиболее благодатным материалом. Каждый волос хранит интегральную информацию о минеральном обмене всего организма за весь период времени своего роста. Спектральный анализ дает полные сведения о минеральном балансе за продолжительный период времени. Некоторые токсичные вещества можно обнаружить только этим способом. Для сравнения: обычные методики позволяют определять по анализу крови соотношение менее десяти микроэлементов на момент тестирования.
Результаты спектрального анализа помогают врачу в диагностике и поисках причины заболеваний, выявлении скрытых заболеваний и предрасположенности к ним; позволяют более точно назначать лекарственные препараты и разрабатывать индивидуальные схемы восстановления минерального баланса.
Трудно переоценить значение спектроскопических методов в фармакологии и токсикологии. В частности, они позволяют проводить анализ проб фармакологических препаратов при их валидации, а также определении фальсифицированных лекарственных средств. В токсикологии ультрафиолетовая и инфракрасная спектроскопии позволили проводить идентификацию многих алкалоидов из экстрактов Стаса.
138. Люминесценцией называется избыточное над тепловым излучение тела при данной температуре, имеющее длительность, значительно превышающую период излучаемых световых волн.
Фотолюминесценция. Люминесценция под воздействием фотонов называется фотолюминесценцией.
Хемилюминесценция. Люминесценция, сопровождающая химические реакции, называется хемилюминесценцией.
139. Люминесцентный анализ основан на наблюдении люминесценции объектов с целью их исследования; используется для обнаружения начальной стадии порчи продуктов, сортировки фармакологических препаратов и диагностики некоторых заболеваний.
140. Фотоэлектрическим эффектом называется явление вырывания
электронов из вещества под действием падающего на него света.
Привнешнем фотоэффекте электрон покидает поверхность вещества.
При внутреннем фотоэффекте электрон освобождается от связей с атомом, но остается внутри вещества.
Уравнение Эйнштейна:
где hn – энергия фотона, n – его частота, А – работа выхода электрона, – кинетическая энергия вылетевшего электрона, v – его скорость.
Законы фотоэффекта:
Число фотоэлектронов, вырываемых с поверхности металла за единицу времени, пропорционально световому потоку, падающему на металл.
Максимальная начальная кинетическая энергия фотоэлектронов
определяется частотой падающего света и не зависит от его интенсивности.
Для каждого металла существует красная граница фотоэффекта, т.е. максимальная длина волны l 0 , при которой еще возможен фотоэффект.
Внешний фотоэффект находит применение в фотоэлектронных умножителях (ФЭУ) и электронно-оптических преобразователях (ЭОП). ФЭУ применяются для измерения световых потоков малой интенсивности. С их помощью можно определить слабую биолюминесценцию. ЭОП применяют в медицине для усиления яркости рентгеновского изображения; в термографии – для преобразования инфракрасного излучения организма в видимое. Кроме того, фотоэлементы применяются в метро при прохождении турникета, в современных гостиницах, аэропортах и т.д. для автоматического открывания и закрывания дверей, для автоматического включения и выключения освещения улиц, для определения освещенности (люксметр) и пр.
141. Рентгеновское излучение –это электромагнитное излучение с длиной волны от 0,01 до 0,000001 мкм. Оно вызывает свечение экрана, покрытого люминофором, и почернение фотоэмульсии, благодаря чему его можно использовать для фотографирования.
Рентгеновские лучи возникают при резкой остановке электронов при их ударе об анод в рентгеновской трубке. Предварительно электроны, эмиттируемые катодом, разгоняются ускоряющей разностью потенциалов до скоростей порядка 100000 км/с. Это излучение, называемое тормозным, имеет сплошной спектр.
Интенсивность рентгеновского излучения определяется эмпирической формулой:
где I – сила тока в трубке, U – напряжение, Z – порядковый номер атома вещества антикатода, k – const.
Рентгеновское излучение, возникающее в результате торможения электронов, называется «тормозным».
Коротковолновое рентгеновское излучение обычно обладает большей проникающей способностью, чем длинноволновое, и называется жестким , а длинноволновое – мягким .
При больших напряжениях в рентгеновской трубке наряду с
рентгеновским излучением, имеющим сплошной спектр, возникает рентгеновское излучение, имеющее линейчатый спектр; последний налагается на сплошной спектр. Это излучение называется характеристическим, так как каждое вещество имеет собственный, характерный для него линейчатый рентгеновский спектр (сплошной спектр от вещества анода и определяется только напряжением на рентгеновской трубке).
142. Свойства рентгеновского излучения. Рентгеновские лучи обладают всеми свойствами, которые характеризуют световые лучи:
1) не отклоняются в электрическом и магнитном полях и, следовательно, не несут электрического заряда;
2) обладают фотографическим действием;
3) вызывают ионизацию газа;
4) способны вызывать люминесценцию;
5) могут преломляться, отражаться, обладают поляризацией и дают явление интерференции и дифракции.
143. Закон Мозли. Так как атомы различных веществ имеют различные энергетические уровни в зависимости от их строения, то и спектры характеристического излучения зависят от строения атомов вещества анода. Характеристические спектры сдвигаются в сторону больших частот с увеличением заряда ядра. Такая закономерность известна как закон Мозли:
где n – частота спектральной линии, Z – порядковый номер испускающего элемента, А и В – постоянные.
144. Взаимодействие рентгеновского излучения с веществом. В зависимости от соотношение энергии фотона e и энергии ионизации А имеют место три главных процесса.
Когерентное (классическое) рассеяние . Рассеяние длинноволнового рентгеновского излучения происходит в основном без изменения длины волны, и его называют когерентным. Оно возникает, если энергия фотона меньше энергии ионизации: hn<А. Так как в этом случае энергия фотона рентгеновского излучения и атома не изменяются, то когерентное рассеяние само по себе не вызывает биологического действия.
Некогерентное рассеяние (эффект Комптона) . В 1922 году А.Х. Комптон, наблюдая рассеяние жестких рентгеновских лучей, обнаружил уменьшение проникающей способности рассеянного пучка по сравнению с падающим. Это означало, что длина волны рассеянного рентгеновского излучения больше, чем падающего. Рассеяние рентгеновского излучения с изменением длины волны называют некогерентным, а само явление – эффектом Комптона.
Фотоэффект . При фотоэффекте рентгеновское излучение поглощается атомом, в результате чего вылетает электрон, а атом ионизируется (фотоионизация). Если энергия фотона недостаточна для ионизации, то фотоэффект может проявляться в возбуждении атомов без вылета электронов.
Ионизирующее действие рентгеновского излучения проявляется в увеличении электропроводимости под воздействием рентгеновских лучей. Это свойство используют в дозиметрии для количественной оценки действия этого вида излучения.
145. Рентгенолюминесценцией называют свечение ряда веществ при рентгеновском облучении. Такое свечение платиносинеродистого бария позволило Рентгену открыть лучи. Это явление используют для создания специальных светящихся экранов с целью визуального наблюдения рентгеновского излучения, иногда для усиления действия рентгеновских лучей на фотопластинку, что позволяет фиксировать эти лучи.
146. Поглощение рентгеновского излучения описывается законом Бугера:
F = F 0 е - m x ,
где m - линейный коэффициент ослабления,
x – толщина слоя вещества,
F 0 – интенсивность падающего излучения,
F - интенсивность прошедшего излучения.
147. Воздействие рентгеновского излучения на организм . Хотя лучевые нагрузки при рентгенологических исследованиях невелики, они могут приводить к изменениям в хромосомном аппарате клеток – радиационным мутациям. Поэтому рентгеновские исследования должны регламентироваться.
148. Рентгеновская диагностика. Рентгеновская диагностика основана на избирательном поглощении тканями и органами рентгеновского излучения.
149. Рентгеноскопия. При рентгеноскопии изображение просвечиваемого объекта получают на флюороскопическом экране. Методика проста и экономична, позволяет наблюдать за движением органов и за перемещением в них контрастного вещества. Однако она обладает и недостатками: после неё не остается документа, который мог бы обсуждаться или рассматриваться в дальнейшем. На экране плохо различимы мелкие детали изображения. Рентгеноскопия сопряжена с гораздо большей лучевой нагрузкой на больного и врача, чем рентгенография.
150. Рентгенография. При рентгенографии пучок рентгеновских лучей направляется на исследуемую часть тела. Излучение, прошедшее через тело человека, попадает на пленку, на которой после её обработки получается изображение.
151. Электрорентгенография. В ней пучок рентгеновского излучения, прошедший через больного, попадает на заряженную статическим электричеством селеновую пластинку. При этом пластина изменяет свой электрический потенциал, на ней возникает скрытое изображение из электрических зарядов.
Главное достоинство метода – возможность быстро получить большое число качественных снимков без расхода рентгеновской пленки, содержащей дорогостоящие соединения серебра, и без “мокрого” фотопроцесса.
152. Флюорография. Её принцип состоит в фотографировании рентгеновского изображения с экрана на малоформатную роликовую пленку. Применяется при массовых обследованиях населения. Преимущества метода – быстрота, экономичность.
153. Искусственное контрастирование органов. Метод основан на
введении в организм безвредных веществ, которые поглощают
рентгеновское излучение гораздо сильнее или, наоборот, гораздо слабее, чем исследуемый орган. Например, больному рекомендуется принять водную взвесь сульфата бария. При этом на снимке появляется тень контрастной массы, находящейся в полости желудка. По положению, форме, величине и очертаниям тени можно судить о положении желудка, форме и величине его полости.
Йод используется для контрастирования щитовидной железы. Из газов для этой цели применяют кислород, закись азота, углекислый газ. В кровяное русло можно вводить только закись азота и углекислый газ, так как они в противоположность кислороду не вызывают газовой эмболии.
154. Усилители рентгеновских изображений. Яркость свечения, преобразующего рентгеновское излучение в видимый свет флюоресцентного экрана, которым пользуется рентгенолог, производя рентгеноскопию, составляет сотые доли кандел на квадратный метр (кандел - свеча). Это примерно соответствует яркости лунного света в безоблачную ночь. При подобной освещенности человеческий глаз работает в режиме сумеречного зрения, при котором чрезвычайно плохо различаются мелкие детали и слабые перепады контраста.
Увеличить яркость экрана нельзя из-за пропорционального увеличения дозы облучения пациента, которая и так не безвредна.
Возможность устранить это препятствие дают усилители рентгеновского изображения (УРИ), способные усиливать яркость изображений в тысячи раз за счет многократного ускорения электронов с помощью внешнего электрического поля. УРИ, помимо увеличения яркости, позволяют существенно сократить дозу облучения при исследовании.
155. Ангиография – метод контрастного исследования кровеносной
системы, в котором под визуальным рентгеновским контролем с помощью УРИ и телевидения рентгенолог вводит в вену тонкую эластичную трубку - катетер и направляет его вместе с током кровипрактически в любую область тела, даже в сердце. Затем в нужный момент по катетеру вводится рентгеноконтрастная жидкость и одновременно делается серия снимков, с большой скоростью следующих друг за другом.
156. Цифровой метод обработки информации. Электрические сигналы представляют собой наиболее удобную форму для последующей обработки изображения. Иногда на изображении выгодно подчеркнуть линию, выделить контур, иногда высветить текстуру. Обработка может осуществляться как электронными аналоговыми, так и цифровыми методами. Для целей цифровой обработки аналоговые сигналы превращаются в дискретную форму с помощью аналого-цифровых преобразователей АЦП и в таком виде поступают на компьютер.
Полученное на флюороскопическом экране световое изображение усиливается электронно-оптическим преобразователем (ЭОП) и поступает через оптическую систему на вход телевизионной трубки ТТ, превращаясь в последовательность электрических сигналов. С помощью АЦП производится дискретизация и квантование, а далее запись в оперативную цифровую память – ОЗУ и обработка сигналов изображения по заданным программам. Преобразованное изображение вновь превращается в аналоговую форму с помощью цифро-аналогового преобразователя ЦАП и выводится на экран видеоконтрольного устройства ВКУ полутонового дисплея.
157. Цветовое кодирование черно-белых изображений. Большинство интроскопических изображений монохромно, то есть, лишено цвета. Но ведь нормальное зрение человека - цветное. Чтобы полностью использовать способности глаза, имеет смысл в ряде случаев искусственно раскрашивать наши интроскопические изображения на последнем этапе их преобразования.
При восприятии глазом цветного изображения появляются
дополнительные признаки изображения, облегчающие анализ. Это
цветовой тон, насыщенность цвета, цветной контраст. В цвете во много раз повышается различаемость деталей и контрастная чувствительность глаза.
158. Рентгеновская терапия. Рентгеновское излучениеприменяется для лучевой терапии при лечении ряда заболеваний. Показания и тактика рентгенотерапии во многом аналогичны методам гамма-терапии.
159. Томография. На изображение органа или патологического образования, интересующего врача, наслаиваются тени соседних органов и тканей, расположенных по ходу рентгеновского пучка.
Суть томографии заключается в том, что в процессе съемки
рентгеновская трубка перемещается относительно больного, давая резкое изображения только тех деталей, которые лежат на заданной глубине. Таким образом, томография – это послойное рентгеновское исследование.
160. Лазерное излучение –это когерентное одинаково направленное
излучение множества атомов, создающее узкий пучок монохроматического света.
Чтобы лазер начал действовать, необходимо перевести большое число атомов его рабочего вещества в возбужденное (метастабильное) состояние. Для этого рабочему веществу передается электромагнитная энергия от специального источника (метод накачки). После этого в рабочем веществе начнутся почти одновременные вынужденные переходы всех возбужденных атомов в нормальное состояние с излучением мощного пучка фотонов.
161. Применение лазера в медицине. Высокоэнергетические лазеры
применяются в качестве лазерного скальпеля в онкологии. При этом достигается рациональное иссечение опухоли с минимальным повреждением окружающих тканей, причем операцию можно выполнять вблизи структур мозга с большой функциональной значимостью.
Кровопотеря при применении луча лазера гораздо меньше, рана полностью стерилизуется, а отек в послеоперационном периоде минимальный.
Особенно эффективен лазер в микрохирургии глаза. Он позволяет проводить лечение глаукомы посредством “прокалывания” его лучом микроскопических отверстий для оттока внутриглазной жидкости. Лазером осуществляется безоперационное лечение отслойки сетчатки.
Низкоэнергетическое лазерное излучение оказывает противовоспалительное, аналгезирующее действие, изменяет тонус сосудов, улучшает обменные процессы и т.д.; оно применяется в специальной терапии в различных областях медицины.
162. Воздействие лазера на организм. Воздействие лазерного излучения на организм во многом схоже с воздействием электромагнитного излучения видимого и инфракрасного диапазонов. На молекулярном уровне такое воздействие приводит к изменению энергетических уровней молекул живого вещества, их стереохимической перестройке, коагуляции белковых структур. Физиологические эффекты лазерного воздействия связаны с фотодинамическим эффектом фотореактивации, эффектом стимуляции или угнетения биопроцессов, изменением функционального состояния как отдельных систем, так и организма в целом.
163. Использование лазеров в медико-биологических исследованиях. Одним из основных направлений лазерной диагностики является спектроскопия конденсированных сред , которая позволяет проводить анализ биологических тканей и их визуализацию на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.
Световая микроскопия
Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.
Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.
Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.
Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.
Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.
Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.
Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.
Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.
Метод темного поля и его разновидности
Метод тёмного поля в проходящем свете (Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции - т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.
Проведение темнопольного исследования
Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.
Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:
Устанавливают свет по Келеру;
Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;
На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;
Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;
Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;
С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);
Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.
Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).
После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.
В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.
Метод фазового контраста
Метод фазового контрастаи его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
Набора объективов со специальными фазовым пластинками;
Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.
Настройка фазового контраста заключается в следующем:
Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;
Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0");
Настраивают свет по Келеру;
Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;
Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;